Name: 에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장 대장균 : 디자인, 생산 및 정제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 배우세요 대장균 외막 소포에서 효소를 포장하고 정제하는 방법을. 이 기술은 효소 안정성을 향상시켜 세포 없는 촉매 및 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 해군 연구소에 제공된 핵심 기금을 통해 해군 연구소의 자금 지원을 받았습니다.

플라스미드 1. 준비 <ol><li> A (앵커-ST로서이 프로토콜 함) biorthogonal 결합 도메인 융합 플라스미드 (예, pET22) 앵커 단백질 함유 (하는 OmpA), 에피토프 태그 (예 : 정제 및 식별 6xHis, myc의 또는 FLAG 태그)를 준비 세포질 파악 태그 항생제 내성, 선택된 균주 7에 기초하여 적절한 복제 원점. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 다음 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 야간 문화의 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li><li> 플라스미드 (예, pACYC184) (효소 SC 등이 프로토콜에 언급) (PTE)를 앵커 단백질의 상보 bioorthogonal 결합 도메인에 융합 OMV 내에 패키징 될 수있는 효소 / 단백질을 함유 준비 에피토프 태그 앵커 단백질 플라스미드와 다른 주변 세포질 현지화 태그, 항생제 내성, 적절한 오리지널복제 선택된 균주 7을 기반으로. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 (7) 다음 시중에서 판매하는 DNA 분리 키트를 사용하여 야간 문화의 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li></ol> OMV 포장 대장균 문화의 2 세대 <ol><li> 플라스미드 분리 <ol><li> 효소-SC는 구성 및 앵커-ST는 제조 업체의 프로토콜 7에 따라 상업용 플라스미드 격리 키트를 사용하여 별도의 유지 보수 세포주에서 구축 인코딩하는 플라스미드를 정제. 260 nm의 280 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA 농도 및 순도를 결정합니다. </li></ol></li><li> 공동 변환 <ol><li> 단백질 발현을 용이하게하기 위해 상업적으로 사용할 수있는 대장균 균주를 선택한다. 주 : BL21 (DE3) 세포를 여기에 사용 하였다. T7의 lysogen는 제자의 T7 프로모터 및 T7 RNA 중합 효소에 의존 앵커-ST 구조의 표현이 필요합니다EIN 식입니다. 다른 박테리아 균주를 사용하면 T7의 lysogen 유전자의 존재 또는 pET22 7 이외의 플라스미드를 사용하는 하나를 요구한다. </li><li> 다음 선택 권한있는 셀의 제조 업체의 프로토콜 다음 열 충격 변환하거나 전기 중 하나를 통해 유능한 박테리아 세포로 변형 동등한 몰 농도 정제 된 플라스미드 DNA를 희석. </li><li> ; 위에 항생제 함유 모두 암피실린 (pET22) 및 클로람페니콜 (pACYC184)와 접시 한천 루리아 - 베르 타니 (LB)를 플레이트 형질 전환 된 세포 모두 25 μg의 / ㎖의 최종 농도로 존재. </li><li> 모두 플라스미드를 포함하는 경우에만 클론을 분리하기 위해 밤새 37 ° C에서 배양 접시를 놓습니다. 참고 : 항생제 선택 살아남을 식민지 이후의 모든 OMV 제제에 사용됩니다. 항생제 (암피실린과 클로람페니콜)을 선택적으로 압력을 유지하고 두 플라스미드의 존재를 확인하기 위해 모든 액체 배양 물에 첨가한다. </li></ol></li></ol> 3. OMV 생산 <ol><li> 식민지 확장 <ol><li> 2.2.4에 설명 된 선택 플레이트의 단일 콜로니로 상기 농도의 항생제를 함유하는 배지 (전형적 굉장 브로 쓰 (TB) 또는 LB) (단계 2.2.3) 5 ㎖를 접종한다. </li><li> 당황 배양 플라스크에 하룻밤 스타터 문화의 100 배 희석 : 1을 수행합니다. 참고 : 250-500 ml의 사이에 미디어의 볼륨을 사용합니다. </li><li> 문화의 충분한 통기가 달성하기 위해 250 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 문화를 유지한다. </li></ol></li><li> 각 플라스미드의 유도 <ol><li> 박테리아 문화가 주 성장 플라스크의 접종 후, OD 0.6-0.8의 600 성장의 약 3 시간을 증가 할 수 있습니다. </li><li> PTE-SC로드 소포의 최종 수율을 향상시키기 위해 15 분 동안 7,000 XG에서 전체 문화를 원심 분리기. 예열 신선한 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 참고 :이 옵트하는 ional 단계 PTE-SC 유도 전에 배양 배지에 존재하는 빈 OMV를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 물과 살균 필터 L - 아라비 노스의 20 % 원액을 확인합니다. 2~4주 4 ℃에서 보관 L - 아라비 노스 솔루션입니다. </li><li> PTE-SC 생산을 시작 최종 0.2 %의 농도로 배양 플라스크에 L-아라비 노스 솔루션을 추가합니다. 참고 :이 전에 돌연변이하는 OmpA-ST의 유도를 통해 증가 된 수포를 홍보에 PTE-SC와 주변 세포질 공간을 미리로드하는 데 도움이됩니다. </li><li> 0.22 μm의 필터를 사용하여 물과 살균 필터의 1 M 이소 프로필 β-D-1-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG) 솔루션을합니다. 참고 : IPTG 한 번 즉시 사용 수화해야합니다. IPTG의 분취 3-6 개월간 동결 보관하고, 사용 전에 즉시 해동 할 수있다. </li><li> 하는 OmpA-ST의 생산을 시작하는 0.5 mm의 최종 농도에 추가 3 시간의 잠복기 후 IPTG를 추가합니다. </li><li> 막 다른 허용진탕하면서 37 ℃에서 추가로 8 ~ 14 시간 동안 성장 진짜야. </li></ol></li></ol> 4. OMV 정화 <ol><li> 본래 박테리아의 제거 <ol><li> 그대로 박테리아를 펠렛 4 ° C에서 7,000 XG에 15 분 동안 세균 배양 배지를 원심 분리기. </li><li> 세포 펠렛을 방해하지에 캔트, 그리고 조심 세포 펠렛 포스트 원심 분리의 맨 위에 떨어져, 미디어를 저장합니다. </li><li> 하나의 추가 원심 분리 사이클은 모두 그대로 박테리아가 가만히 따르다 미디어를 저장해야되는 문화 미디어에서 제거되도록하는 반복 4.1.1와 4.1.2 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 단백질 응집체를 제거하여 <ol><li> 또한 잔류 세균 원하지 않는 큰 세포 물질을 제거하기 위해 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 세균 배양액을 정제. 주 : (셀룰로오스 아세테이트 (CA) 또는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 등의 높은 회수율 및 낮은 단백질 흡착 생물학적 호환 막 재료를 사용하여PVDF). 100 ㎖ 및 100 ㎖보다 큰 진공 필터 볼륨보다 작은 주사기 필터 볼륨. <ol><li> 주사기 필터, 멸균 10 ~ 50 ML의 주사기에 배지를 그립니다. 주사기의 루어 끝에 0.45 μm의 필터를 연결합니다. 플런저를 우울하게하고 흐름을 통해 새로운 용기를 수집합니다. </li><li> 필터 진공 멸균 여과 장치에 배지를 전송합니다. 펌프를 진공 또는 흡입을 생성하는 흡입기를 싱크 장치를 연결합니다. 새로운 용기에 여과 매체를 전송합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 초 원심 분리를 통해 OMV의 분리 <ol><li> 원심 분리기에 반대 튜브의 균형을주의하면서 원심 분리 튜브에 필터링 된 배양 배지를 추가합니다. </li><li> 악기 및 튜브 모두 일치하는 해당 로터를 사용하여 초 원심 분리기에서 4 ° C에서 3 시간 동안 ~ 150,000 XG에 펠렛 사용된다. </li><li> 즉시 완료 오에서의 OMV 펠렛을 방해하지 않도록주의하면서 OMV 펠릿에서 OMV 고갈 문화 매체를 가만히 따르다OMV 복구 저감 펠릿 연화 매체에 남아 있도록 OMV 펠렛을 허용 같은 F 원심. 참고 :이 펠릿은 약간 갈색과 세균 배양의 시작 양에 따라하는 또는 눈으로 볼 수 없습니다 수있을 것입니다. 원심 분리 튜브의 상단에서 직접 미디어를 흡입하는 것은 또한 OMV에서 ​​제거 더 많은 미디어가 최종 OMV 샘플이 될 것입니다 더 순수 펠렛 것을 염두에두고하는 옵션입니다. </li><li> OMV 입자가 완전히 미디어에서 고갈되었는지 확인 나중에 동적 광산란 (DLS) 테스트를위한 원심 분리하여 상층 액을 저장합니다. </li><li> 추가가 RT에서 30 분 동안 배양 허용 OMV 펠릿하여 pH 8.0 멸균 여과하고 인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4의 100 mM의 N 사이클로 헥실 -2- 아미노 에탄 술폰산 (CHES) 버퍼 0.5 ml의. 펠릿 건조하지 않도록하십시오. 참고 : 솔루션 이온 강도, pH를, 및 온도 극단이 감소 OMV 용해도가 발생하고 aggre 촉진 할 수있다gation. </li><li> 조심스럽게 용해 된 전체 펠릿을 위해 부드럽게 혼합 원심 분리 튜브로부터 정제 OMV 용액을 피펫. </li></ol></li></ol> 5. OMV 특성 <ol><li> OMV 크기 분포 및 입자 농도를 측정하기 위해 각 기기에 고유 제공된 제조사의 프로토콜에 따라 시판 DLS 또는 나노 추적 소프트웨어를 사용한다. 주 : 여기에서, OMV의 크기 분포 및 농도 NanoSight LM10 나노 입자 추적 및 NTA 2.3 분석 소프트웨어를 이용하여 측정 하였다. <ol><li> 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 현미경을 켜고 현미경과 나노 입자 추적 장치의 모든 표면을 청소합니다. </li><li> ~ 모든 공기를 주입하지 않고 전체 뷰잉 윈도우를 커버해야되는 1 ㎖의 멸균 주사기와 피팅 루어 통해 입자 추적 장치의 뷰잉 윈도우에 직접 OMV 시료 0.5 mL를이 시스템에 거품을 추가한다. </li><li> 장소 t그는 현미경 무대에서 장치를 추적하고 레이저를 켜 나노 입자. </li><li> 소프트웨어에서 &quot;캡처&quot;를 클릭합니다. </li><li> 현미경의 초점을 조절하고 소프트웨어 윈도우의 미리보기 화면에 존재하는 입자를 시각화하는 스테이지. </li><li> 밝은 입자가 명확하게 어두운 배경에 가시화 될 때까지 &quot;카메라 셔터&quot;와 &quot;카메라 이득&quot;을 조정합니다. </li><li> 60 초에 촬영 시간을 조정합니다. </li><li> &quot;기록&quot;을 클릭합니다. </li><li> 입력 샘플 / 소자 온도를 프롬프트 할 때, 샘플을 레이블 및 사용자 지정 폴더에 실행되는 각각의 완료시 상기 비디오 데이터를 저장한다. </li><li> (감지 임계 값은, 흐림, 최소 트랙 길이, 최소 예상 입자 크기) 자동차에이 모드를 감지하고 클릭 모든 분석 매개 변수를 유지 &quot;공정 순서를.&quot; 참고 : 각 매개 변수를 미세 조정 분석 결과를 독립적으로 조절할 수있는 방법에 대한 설명서를 참조하십시오. </li><li> 기록 입도 분포 및 입자 / m소프트웨어에 의해 결정된 L 농도. 참고 : 전형적인 OMV 유체 역학적 크기 범위는 ~ 10 × 10 (8)의 입자 / ml의 농도 30-200 나노 미터 사이이다. </li></ol></li><li> OMV의 단백질 함량을 결정 <ol><li> OMV 순도, 효소 생산 및 SC-ST 가교 효율 7 평가 표준 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 프로토콜을 사용한다. 참고 : 가교 효율이 100 % 7되지 않습니다. </li></ol></li></ol> 효소 포장 6. 확인 <ol><li> PTE 활동 분석 <ol><li> 하나 큐벳에 25 ° C에서 적절한 버퍼와 같은 100 mM의 CHES 완충액 (pH 8) 모든 효소 분석을 수행하거나 384분의 96 웰 플레이트에 다중화. </li><li> 1의 5 μl를 추가 CHES의 90 μl를 정제 OMV의 5 μL에 CHES 버퍼에 paraoxon 1,000 희석 (~ 36 배 배양 배지에 존재하는 OMV 농도에 비해 농축). 주의 : Paraoxon은 독성 농약이다및 제조 업체 및 기관의 지침에 따라 처리해야합니다. </li><li> 405 nm에서 일정한 간격으로 흡광도 측정 (~ 2 시간 총 반응 시간 동안 매 20 초)을 가지고 (ε = 18.1 밀리미터 -1 cm -1) 및 348 nm의 (등 흡수 점의 ε = 5.4 밀리미터 -1 cm -1)에의 발색 paraoxon 고장 제품, P는 니트로 페놀의 반응 진행을 모니터링 할 수 있습니다. 참고 : 8 위의 pH 값에서 P는 니트로 페놀의 지배적 인 탈 양성자 형태로 405 nm에서 정확한 모니터링을 가능하게 존재한다. 다른 복잡한 또는 낮은 pH 용액에서 그것은 P 개의 니트로 페놀의 다양한 형태가 존재할 수있는 바와 같이 348 nm 인 등 흡수 점을 활용하는 것이 필요하다. </li><li> 각 샘플 포장 효율 및 총 PTE 생산 PTE의 상대적인 양을 비교하는 단계 6.1.3에서 진행 곡선의 직선 부분의 기울기를 결정함으로써 초기 반응 속도를 계산한다. </li><li> 표준 효소를 수행분석 프로토콜은 K M, V 최대를 결정하고 OMV에 대한 K 고양이 PTE를 캡슐화. 참고 : 위버 - 버크 분석이이 운동 매개 변수의 결정에 이용 될 수있는 y 절편 = 1 / V 최대 및 기울기 = K M / V 최대 20. </li></ol></li><li> 횡단 기판 / 제품 확산. <ol><li> 체적 단계 0-3%에서 CHES 완충액 트리톤 X-100의 농도 증가를 이용하여 6.1에서 설명한 것과 동일한 역학적 분석 분석을 수행한다. 주 : OMV 가용화 기능에 트리톤 X-100의 첨가는 OMV의 내용이 반응 용액에 자유롭게 접근 할 수 있도록 허용하는 지질 이중층을 방해. </li><li> 계산하고 활성을 I 효소 효소 활성에 비해 최소한의 변화 (초기 속도)에 의해 표시 기판 / 제품의 횡단 통과를 확인하기 위해 각각의 트리톤 X-100 수준에서 초기 속도를 비교할N 트리톤 X-100의 부재. 효소 활성의 상당한 증가는 트리톤 X-100의 존재하에 관찰되는 경우에는, 기판이 자유롭게 OMV에 확산하지 않는 것 같다. </li><li> 이 효소의 활성을 확인하기 트리톤 X-100의 존재하에 분석 자유 효소 활성 (6.1 절에서 설명한 바와 같이) 자체가 계면 활성제에 의해 저해되지 않는다. 참고 : 활동이 크게 트리톤 X-100, 같은 사포닌 또는 다양한 폴리 소르 베이트 등의 다른 첨가제에 의해 영향을 경우 / 트윈 계면 활성제는 OMV 막 파열하는 것이 더 적합 할 수있다. </li></ol></li></ol> 7. OMV 저장 <ol><li> 동결 <ol><li> 직접 액체 질소로 정제 OMV의 장소 ~ 100 μL 씩 스냅인을 확인 완전히 유리 병을 잠수함 또는 샘플 자체에 액체 질소를 접촉하지되는 분취 량을 동결합니다. 주 : 정제 OMV가 버퍼에 직접 고정 할 수있는 스냅 purificat OMV 중에 펠렛을 용해시켰다 선정7 필요한 추가 cryoprotectants와 이온 과정. </li><li> -80 ° C에서 스냅 냉동 분취 량을 저장합니다. </li><li> RT 확실 샘플을 가열하지 않는 것을에서 그들을 배치하여 단계 7.1.1에서 냉동 분취 량을 해동. </li><li> 이러한 방식으로 스토리지의 모든 샘플을 준비하기 전 단계 이전에 초기 속도를 비교 6.1 및 효소 활동 후 동결 융해에 큰 손실이 없음을 확인하기 위해 동결 후 설명 효소 분석을 수행합니다. 참고 : 효소 활성의 감소가 동결로 인해 관찰되는 경우 스토어는 4 ° C에서 OMV를 정제 하였다. </li></ol></li><li> 동결 건조 <ol><li> 시중에서 판매하는 동결 건조 장비 (21)을 이용하여 스냅 냉동 정제 OMV 씩을 동결 건조. </li><li> 상점은 주 또는 여러 달 동안 -80 ° C에서 RT에서 분취 액을 동결 건조. </li><li> 동결 건조 이전과 동결 건조 OMV에 정제수의 동일한 볼륨을 추가하고 t을 재수 할 실온에서 30 분 동안 서 보자그는 샘플. 필요한 확인되는 경우 와동 또는 OMV를 초음파 처리하지 부드럽게 섞는다. </li><li> 이전에 희석 / 가용화가 필요하지 않은 점의 배려하는 응용 프로그램에 대한 직접 동결 건조 OMV 분말을 추가합니다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

대표적인 방법을 설명하기 위해이 프로토콜 기능은 관심있는 효소를 생산 E. coli에 의해 OMV로 패키징하는 패키징 방법을 지시했다. 많은 복잡한 기술과 같이, 프로토콜은 아래에 설명되는 일부 다른 고유 한 애플리케이션에서 사용하기 위해 수용하도록 변형 될 수있는 복수의 영역이있다. OMV 포장 및 효소 캡슐의 메커니즘은 특정 요구에 적용 할 수있는 반면 성공에 중요한이 프로토콜 내에서 몇 가지 단계가 있습니다. 그대로 세균 및 세포 파편의 초기 제거는 크게 중요하고 정량 또는 샘플 분석에서 모든 다운 스트림 시도에 영향을 미칠 것입니다. 여과 한 다음 두 개의 연속 원심 분리 단계에서는 이러한 오염 물질을 제거 할 수있는 일반적으로 적절하다. 경사 솔루션은 원심 분리 후 오염 물질의 전달을 최소화 할 때, 모든 인스턴스 관리에주의해야한다. 유사하게, 최종 OMV 펠릿 Obtained 다음 초 원심 분리는 종종 느슨하게 원심 관의 바닥에 부착된다. 펠렛이 상기 용기의 바닥에 방해받지 않고 유지되도록 폐 배지를...

효소 로딩 박테리아 외막 소체 (OMV)의 설계, 생산 및 정제 방법이 여기에서 제시 하였다. OMV는 30-200 nm의 1, 2에서 크기가 다양 테오 주로 단층, 작은 수 있습니다. 현재까지 연구 된 모든 그람 음성 및 그람 양성 박테리아는 표면 3,4에서 OMV 또는 세포 외 소포 (EV) 중 하나의 릴리스를 증명하고있다. OMV가 생산되고있는 정확한 메커니즘은 아직 완전히 때문에 그들뿐만 아니라 그들이 섬기는 다양한 기능을 분비하는 다양한 세균 집단을 규명해야한다. OMV 복잡한 시그널링 유전자 전위 다양한 서빙 유전 물질 소분자, 펩티드, 단백질로부터화물 다양한 수송 도시되어 있고, 독성은 5,6 기능한다. OMV의 생물 발생의 정확한 메커니즘은 잘 특징, 세균 종 사이의 차이 표시되지 않습니다. 생에도 불구하고S 사실, 우리는 목적 단백질과 세균의 외막에 매우 풍부한 단백질 내생 이후 OMV 간의 합성 결합을 만들어 OMV으로하는 재조합 단백질의 포장 효율을 향상시키는 방법을 개발했다. 합성 결합 또는 인위적으로 혼입 친화력의 부재에서, 상기 재조합 발현 된 단백질과 OMV 사이 관찰 포장 효율 7 매우 낮다. 이 결과는 잘 이해되지 않은기구에 의해 하나가 박테리아 표면이나 직접 포장 통해 OMV 형성의 정확한 순간에 우연 밀봉 통해 발생 OMV 내 단백질의 혼입으로 예상 할 수있다. 일 다른 사람에 비해 높은 효율로 포장 일부 단백질과 종속 단백질은 매우 약간의 성공이 우연 캡슐화하지만 효과적인 포장에 의존 주변 세포질 공간 내 표현을 통해 단순히 통해 단백질을 포장에서 관찰 된입니다전혀 8-10에서 포장하지 않습니다. 일반적인 합성 생물학 기술을 이용하여, 우리는 대장균 (E. coli에) 동시에 제조, 포장 및화물을위한 박테리아에 의해 선택되는 방법 OMV가 형성되는 방식에 대한 현재의 기술 한계를 회피 OMV에 목적 활성 효소를 분비을 설계하고자 포장. 선택 합성 링크가 OMV 방향으로 포장을 용이하게하도록 본 출원의 목적을 위해 분리 된 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템을 선택 하였다. 이름이 암시 하듯이 분할 단백질 바이오 콘쥬 게이션 시스템은 서로 상호 보완적인 두 서브 유니트 도메인으로 구성된다. 이 프로토콜의 목적을 위해 선택한 분할 단백질 도메인은 연쇄상 구균 화농의 피브로넥틴 결합 단백질 (FbaB) (11)에서 파생 된 SpyCatcher (SC) 및 SpyTag (ST) 도메인으로하고라고합니다. 이 분할 단백질 시스템은 w에서 이례적인 일이다암탉 개의 서브 유닛이 근접 내에 isopeptide 결합되어 자발적으로 공유 결합을 생성 산과 라이신 아미노산 잔기 아스파르트 기단 사이에 형성한다. Isopeptide 결합 형성은 샤페론 단백질, 효소, 촉매 또는 보조 인자의 첨가를 필요로하지 않고, 용이하게 실내 온도 (RT)에서 생리 학적으로 관련된 조건 (12)의 넓은 범위에 걸쳐 일어날 수있다. 개념의 증거로, Brevundimonas의 diminuta에서 phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1)는 OMV (13) 파생 대장균으로 포장하기 위해 선택되었다. PTE는 이핵 아연 / 아연 활성 부위를 포함하고 dialkylphosphates 및 아릴 알코올 (14)에 aryldialkylphosphates 변환 가수 분해 반응을 통해 유기 인산 화합물을 분해 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 유기 인산 화합물에 노출되면 신경 근육 접합부 보는 건에서 아세틸 콜린 에스 테라 제에 의해 아세틸 콜린의 가수 분해를 억제을 통해 적절한 신경 전달 물질의 기능을 손상15 극도로 위험한 g의 유기 인산 화합물 유래 화합물 등을들 수있다. 장기간 또는 유기 인산 화합물에 상당한 노출은 일반적으로 통제 할 수없는 경련을 초래 일반적으로 질식을 통해 죽음을 발생합니다. PTE가 paraoxon 향해 높은 촉매 활성을 나타내는 반면, 매우 강력한 살충, 또한 다른 살충제 및 V / G 형 화학 신경 제제 (16)의 넓은 범위를 가수 분해 할 수있다. OMV 패키징을 용이하게하기 위해, 박테리아 플라스미드는 유도 성 프로모터하는 주변 세포질 위치 파악 시퀀스 및 SC 유전자 서열 상류 짧은 다중 클로닝 부위를 포함하는 유전자 구조를 인코딩되도록 설계 하였다. OMV 포장에 대한 주변 세포질 공간으로 PTE-SC 융합 단백질을 대상으로하는 유전자 스위치의 생성을 허용하는 지도자와 SC 시퀀스 사이의 PTE 유전자의 삽입. 여기서 설명하는 노력이 PTE에 집중하지만, 효소 유전자가 상호 교환 용이 FAC 다른 유전자 서열로 대체 될 수있다다른 효소 또는 단백질의 ilitate 포장. 합성 링크의 두 번째 부분으로 풍부 외막 단백질 (하는 OmpA)는 ST의 단백질 서열을 제공하도록 선택된다. 변할 수 앵커 단백질의 선택은, 단백질은 원형질막 주위 공간에 표시하는 허용 도메인이 세포 독성을 유발하지 않고 융합 구조를 견뎌 것이 중요하면서 재조합 때, OMV에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 응집하지 않는다 생산했다. 높게하는 OmpA 박테리아 외막 이후 OMV (17)에 표시 될 것으로 알려진 37.2 kDa의 포린 횡단 단백질이다. 그것은 작은 분자의 운반에 관여하고, 박테리아 막 (18)을 가로 질러 크기가 2 nm의 &lt;. 네이티브하는 OmpA 두 구조적 고유 도메인, 경막 베타 배럴 모티브 및 펩티도 글리 칸 (19)과 상호 작용하는 것으로 알려진 periplasmically 수용성 C 말단 부분을 가진다. 돌연변이하는 OmpA-ST 융합 고안에서D 여기하는 OmpA의 C 말단 부분은 삭제하고, ST는 periplasmically 직면 N- 또는 C 말단에 융합되었다. 하는 OmpA의 주변 세포질 부분을 삭제하면 외막과 하이퍼 수포 7로 이어지는 막 불안정의 결과로 펩티도 글리 사이의 상호 작용의 수를 감소시킨다. 게놈하는 OmpA은 총 멤브레인 불안정을 완화하는 재조합 발현하는 OmpA-ST 구조 이외에 유지 하였다.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>항상 신선 또는 분취를 준비하고 얼립니다.</td></tr><tr><td>L-아라비노스</td><td>애니</td><td></td><td>는 미리 준비하여 4°C에서 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>임의 첨가</td><td></td>물은 <td>매체가 고압멸균으로 충분히 냉각된 후 사용 직전에 첨가합니다. &nbsp;</td></tr><tr><td>클로람페니콜&nbsp;</td>매체가 고압증기멸균으로부터 충분히 냉각된 후 사용 직전에 <td>추가합니다</td><td></td><td>.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB 배양 배지</td> 다른 <td>성장</td><td></td><td>배지도 유사하게 작동할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>많은 잠재적인 적합한 계면활성제 중 하나입니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>당황한 문화 플라스크</td><td>Any</td><td></td><td>배플은 더 높은 수준의 통기를 촉진합니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>파라옥손 탈화에 사용되는 최적의 완충액(pH > 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>매우 독성이 강한 물질은 신중하게 다루고 적절하게 처리해야 합니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>주사기 필터 0.45 &마이크로; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>필터 직경은 시료의 양에 따라 다릅니다. 낮은 단백질 결합막은 매우 중요합니다.</td></tr><tr><td>쉐이커 인큐베이터</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>정확한 온도와 혼합은 재생산 가능한 박테리아 성장에 필수적입니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall 배양 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>7,000 x g의 대용량(500ml) 배양 원심분리기.</td></tr><tr><td>Sorvall 초원심분리기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>원심력 가능 &ge; 150,000 x g입니다.</td></tr><tr><td>초원심분리기 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>적절한 로터와 튜브를 사용하고 모든 것이 적절하게 균형을 이루고 있는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>사용하기 전에 응력 파괴가 없는지 확인하고 튜브가 정확하게 균형을 이루고 있는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>분광 광도계&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>효소 동역학 분석에 필요합니다.</td></tr><tr><td>DLS/입자 추적</td><td>NanoSight&nbsp;</td><td>LM10</td><td>OMV 크기 분포 및 농도 측정에 필요합니다.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>적합한 박테리아 발현 균주.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>이들 대신 다른 플라스미드를 사용할 수 있습니다. &nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>이들 대신 다른 플라스미드를 사용할 수 있습니다. &nbsp;</td></tr><tr><td>겔 추출 키트,</td><td>Qiagen</td><td>28704</td>, <td>예시 키트.</td></tr></tbody></table>

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

외막 소체 (OMV)를 프로그래밍하는 합성 생물학 기술을 적용 점점 관심은 기존의 나노 입자를 합성하기에 너무 어려운 증명 OMV에 대한 몇 가지 매우 흥미로운 독특한 응용 프로그램을 선도하고 있습니다. 지금까지 모든 그람 음성균은 소분자, 펩티드, 단백질, 및 유전 물질을 포함하는화물의 다양한 OMV 시연 용기를 생산하는 것으로 나타났다. 그들의 다양한화물 바탕 OMV 셀 - 셀 통신에서 유전자 전달과 박테리아 OMV를 생성하는 의존 독성 인자의 전달에 이르기까지 여러 생물학적 과정에 연루되어있다. 최근 세균 OMV 제어하고 OMV 재조합 단백질을 직접 포장 기술의 개발을 통해 다양한 애플리케이션에 걸쳐 사용하기 위해 액세스 될 수있다. overa 개선이 프로토콜은 생산, 정제 방법, 및 효소 패키지 OMV 사용 제공 설명재조합 효소 증가 수포 및 향상된 효소의 안정성 게요 생산. 이 프로토콜의 성공적인 이용은 동시에 재조합 단백질을 생산하고, 재조합 단백질과 외막 사이에 앵커 단백질 합성 결합을 통해 생성 OMV 밀봉 용을 지시하는 균주의 생성한다. 제약 약물 전달, 의료 진단 및 환경 개선 :이 프로토콜은 또한 다른 고유 한 애플리케이션에 사용하기 위해이 프로토콜을 채택 할 때 고려해야 할 박테리아 문화뿐만 아니라 적절한 처리 기술과 일에서 OMV를 분리하기위한 방법을 자세히 설명합니다.

이 프로토콜에 설명 된 OMV 패키징 전략을 필요로 두 가지 재조합 단백질의 동시 발현은 다른 도로의 숫자를 통해 달성 될 수있다. 여기서, 두 벡터 시스템은 복제 분리 유도 유전자 카세트 호환 기원 이용 하였다. PTE-SC의 발현하는 아라비 노스 유도 성 유전자 카세트와 같은 효소 유전자의 클로닝을 용이하게하는 독특한 제한 부위의 시리즈 다음 세포질 파악 리더 서열 아르기닌 트윈을 포함하도록 설계 한 상업적 플라스미드 골격 (pACY184)를 구축 C- 말단 SC 융합 단백질. 외막 앵커 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체는 단백질 발현의 제어와 pelB 세포질 지역화 순서의 락토스 오페론을 이용하는 상업적 벡터 pET22이다. 짧은 ST 서열 INSE 전에 절단하는 OmpA 단백질로 클로닝발현 플라스미드에 rtion. 양 플라스미드에서, C 말단 헥사 히스티딘 서열 OMV 샘플의 융합 단백질의 동시 식별이 가능하도록 유지 하였다. ...

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro 촉매 시약으로 사용하기 위해 효소가 충전된 박테리아 외막 소포(OMV)를 정제하고 특성화하는 것입니다. 이 효소 분리 기술을 통해 배양 배지에서 박테리아 OMV를 수확하고, 이를 이용하여 유기인 화합물의 무세포 촉매 반응을 수행할 수 있습니다. 박테리아 OMV 내의 지향성 패키징은 효소 활성이 점진적이고 지속적으로 상실되는 경우가 많은 기존 기술과 달리, 다양한 반응 및 보관 조건에서 효소 안정성을 현저히 향상시킵니다.이 기술의 함의는 치료제 개발, 환경 정화 또는 무세포 촉매 시스템의 개발과 같이 여러 분야에서 유의미한 단백질의 패키징으로 확장됩니다. 본 프로토콜은 E.coli로부터 OMV를 정제하는 방법을 상세히 다루고 있지만, 패키징 전략을 수정하면 다양한 미생물 세포 배양물에서 OMV를 정제하는 데 이 기술을 쉽게 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 박테리아에서 외막 소포체(OMV)를 생성한 후, 손상되지 않은 박테리아 배양액을 7,000 ×g, 4 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.세포 펠렛이 섞이지 않도록 주의하며 상층액을 제거하여 보관하십시오. 그런 다음, 상층액을 다시 한번 원심분리하여 배지에서 모든 박테리아가 제거되었는지 확인하십시오. 보관된 배양 배지에서 단백질 응집물과 큰 세포 물질을 제거하려면, 해당 용액을 멸균된 10 내지 50 milliliter 주사기에 흡입하십시오.주사기 끝에 0.45 micron 필터를 부착합니다. 그런 다음 플런저를 눌러 통과액을 새 튜브에 수집합니다. 또는, 배양액을 멸균 여과 장치로 옮겨 진공 여과합니다.흡입력을 생성하기 위해 장치를 진공 펌프나 싱크 흡입기에 연결합니다. 여과된 배지를 새 용기로 옮깁니다. OMV를 분리하기 위해, 여과된 배양 배지를 초원심분리 튜브로 옮깁니다.사용 중인 튜브에 적합한 로터를 사용하여 배지를 약 150,000 ×g, 4°C에서 3시간 동안 원심 분리합니다. 펠릿 질량의 손실을 방지하기 위해 초원심 분리 직후, 육안으로 보일 수도 있고 보이지 않을 수도 있는 약간 갈색의 OMV 펠릿으로부터 OMV가 제거된 배양 배지를 따라냅니다. 초원심 분리 후 형성된 OMV 펠릿은 원심 분리 튜브 벽에 느슨하게 부착되어 있을 수 있습니다.데칸테이션 시 펠렛이 떨어져 손실되지 않도록 주의해야 합니다. 배지에서 OMV 입자가 완전히 제거되었는지 확인하기 위해, 이후 동적 광산란(dynamic light scattering) 분석에 사용할 상층액을 보관하십시오. 실험적 필요나 조건에 따라 결정된 pH 7.4의 멸균 여과된 PBS 또는 다른 여과된 버퍼 0.5~1 mL를 펠렛에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션합니다.그 다음, 정제된 OMV 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 부드럽게 섞어 펠렛 전체가 완전히 가용화되었는지 확인합니다. OMV 크기 분포를 측정하기 위해, 사용 중인 장비의 DLS 나노 입자 추적 소프트웨어를 실행합니다. 현미경 전원을 켜고 현미경과 나노 입자 추적 장치의 모든 표면을 세척합니다.1 mL 멸균 주사기를 사용하여 약 0.5 mL의 OMV 샘플을 하단 피팅을 통해 입자 추적 장치의 관찰창에 직접 주입합니다. 이때 시스템 내에 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하며 관찰창 전체를 덮도록 합니다. 나노 입자 추적 장치를 현미경 스테이지 위에 놓고 레이저를 켭니다. 그런 다음 소프트웨어에서 Capture를 클릭합니다.현미경의 초점과 스테이지를 조절하여 소프트웨어 창의 미리보기 화면에 입자가 나타나도록 합니다. 어두운 배경에서 밝은 입자가 명확하게 보일 때까지 카메라 셔터와 카메라 게인을 조절하십시오. 캡처 시간을 60 seconds로 설정한 다음, Record를 클릭하십시오.프롬프트가 나타나면 샘플 장치 온도를 입력하고, 샘플에 라벨을 부착하며, 각 런(run)이 완료되면 비디오 데이터를 사용자 지정 폴더에 저장하십시오. 모든 분석 파라미터를 자동 감지(auto-detect) 모드로 유지한 후 Process Sequence를 클릭하십시오. 소프트웨어에 의해 결정된 입자 크기 분포와 밀리리터당 입자 수로 표시되는 농도를 기록하십시오.OMV 단백질 함량을 결정하기 위해, SDS-PAGE와 Western Blot을 사용하여 OMV 순도, 효소 생산 및 SpyCatcher(SC)와 SpyTag(ST)의 교차 결합 효율을 평가하십시오. 표적 효소와 앵커 단백질의 발현을 확인하는 것이 필수적입니다. 재조합 단백질의 발현은 다양한 이유로 실패하는 경우가 많으므로, OMV 특성 분석 전에 단백질 생산 성공 여부를 반드시 확인해야 합니다.phosphotriesterase 또는 PTE 활성 분석을 수행하려면, CHES 완충액으로 1:1,000 희석한 paraoxon 5 µL를 90 µL의 CHES에 포함된 정제된 OMV 5 µL에 첨가하십시오. 발색성 paraoxon 분해 산물인 p-nitrophenol의 진행 상태를 모니터링하기 위해, 총 반응 시간 약 2시간 동안 20초마다 405 nm 및 348 nm에서 흡광도를 측정하십시오. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행하십시오.여기 SEM을 통해 확인한 E.coli 유래 정제된 OMV의 형태 예시가 제시되어 있습니다. 입자 추적 장비를 사용하여 측정한 결과, OMV의 크기는 50에서 250 nanometers 사이입니다. 이 그래프에는 OMV의 절대 농도가 표시되어 있습니다.arabinose와 IPTG가 존재하는 조건에서 N 말단 OMP-A-ST를 PTE-SC와 공동 형질전환시켰을 때, 대조군 샘플에 비해 OMV 생산량이 유의미하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 여기에 제시된 SDS-PAGE 및 Western Blot 결과는 OMP-A-ST, 천연 OMP-A, PTE-SC, 그리고 OMP-A-ST-PTE-SC에 대한 OMV 단백질 함량과 재조합 단백질 발현을 추가적으로 분석한 것입니다. 이 그림에서는 paraoxon을 발색 기질로 사용하여 초기 속도를 측정함으로써, 세포 펠렛, UC 상층액 및 정제된 UC OMV 펠렛 내의 전체적인 PTE 발현 수준과 OMV 패키징 효율을 결정하였습니다.본 실험에서는 Triton X-100을 사용하여 온전한 OMV 이중층을 가로지르는 paraoxon의 전이 여부를 확인하였습니다. 계면활성제 처리 여부에 따른 활성 차이가 거의 없었으며, 이는 paraoxon이 OMV의 내인성 기공을 통해 자유롭게 통과함을 나타냅니다. 마지막으로, 본 실험에서 확인된 바와 같이, arabinose 및 IPTG 존재 하에 PTE-SC와 함께 공동 형질전환된 N 말단 OMP-A-ST 및 arabinose 활성화 상태의 PTE-SC에 대한 PTE-SC 반응 속도 데이터는 표준 Michaelis-Menten 효소 반응 속도 식에 적합하게 맞추어 분석되었습니다.모든 유전자 구조체가 제작 및 확인되면, 효소 패키징과 OMV 정제는 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 새로운 구조체가 개발될 때마다 OMV를 확인하고 특성화하기 위해 셋째 날의 과정이 필요합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 모든 재료와 원심분리기 장비의 안전 등급을 확인하는 것이 중요함을 유념하십시오.또한, 다음 단계로 넘어가기 전에 각 단계의 성공 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 여기에서 설명한 특성 분석 단계는 효소 패키징과 OMV 형태를 확인하기 위한 다른 분석법으로 보완될 수 있습니다. 단백질 농도, 지질 함량, LPS 농도 및 기타 많은 특성은 탑재물과 결합 조건에 따라 달라질 수 있으며, 이는 후속 응용 단계에 영향을 미칠 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 효소가 충전된 OMV를 정제 및 특성화하는 방법과 효소 화물의 활성을 평가하기 위한 예비 분석을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 박테리아 및 화학 시약을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 무균 조작법 및 개인 보호 장구 사용과 같은 예방 조치를 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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대장균 스페로플라스의 준비

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재조합 단백질 생산 및 박테리아 유래 소포로부터의 회수

징크 핑거 도메인은 본질적으로 세포 투과성 및 포유 동물 세포 유형 내로 다양한 단백질 전달을 매개 할 수있다. 여기서, 단백질의 세포 내 전달을위한 아연 핑거 기술을 구현하기위한 상세한 단계별 프로토콜이 제시된다.

세포 투과성의 Cys를 사용하여 포유 동물 세포에 직접 단백질 배달<sub&gt; 2</sub&gt; - 그의<sub&gt; 2</sub&gt; 아연 손가락 도메인

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β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

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세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

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