에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장 대장균 : 디자인, 생산 및 정제

이 절차의 전반적인 목표는 in vitro 촉매 시약으로 사용하기 위해 효소로 채워진 박테리아 외막 소포를 정제하고 특성화하는 것입니다. 이 효소 분리 기술을 사용하면 배양 배지에서 박테리아 OMV를 수확한 다음 유기인산염 화합물의 무세포 촉매 작용을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 박테리아 OMV 내의 지시 포장은 종종 효소 활성의 점진적이고 지속적인 손실을 초래하는 기존 기술과 달리 다양한 반응 및 저장 조건에서 효소 안정성을 크게 향상시킵니다.

이 기술의 의미는 치료제 개발, 복원 또는 무세포 촉매 시스템 개발과 같은 여러 분야와 관련된 단백질의 패키징으로 확장됩니다. 이 프로토콜은 E.coli에서 OMV를 정제하는 방법을 자세히 설명하지만, 패키징 전략을 수정한 기술은 다양한 미생물 세포 배양에서 OMV를 정제하는 데 쉽게 사용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 박테리아에서 외막 소포 또는 OMV를 생성한 후 온전한 박테리아 배양 배지를 7, 000배 G, 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다.

상등액을 제거하고 저장하며 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 상층액을 두 번째 스핀을 통해 모든 박테리아가 배지에서 제거되었는지 확인합니다. 저장된 배양 배지에서 단백질 응집체와 큰 세포 물질을 제거하려면 용액을 10-50ml 주사기의 멸균 주사기에 넣습니다.

0.45미크론 필터를 부착하여 주사기 끝을 유인합니다. 그런 다음 플런저를 누르고 새 튜브에 흐름을 수집합니다. 또는 배양 배지를 멸균 여과 장치로 옮겨 진공 여과합니다.

흡입을 생성하기 위해 진공 펌프 또는 싱크 흡입기에 장치를 부착하십시오. 여과된 매체를 새 용기로 옮깁니다. OMV를 분리하려면 여과된 배양 배지를 초원심분리 튜브로 옮깁니다.

사용 중인 튜브에 해당하는 로터를 사용하여 약 150, 000회 G 및 섭씨 4도에서 3시간 동안 매체를 회전시킵니다. 펠릿 질량의 손실을 방지하기 위해 초원심분리 직후, 눈으로 보이거나 보이지 않을 수 있는 약간 갈색의 OMV 펠릿에서 OMV가 고갈된 배양 배지를 디캔팅합니다. 초원심분리 후 형성된 OMV 펠릿은 원심분리 소포에만 느슨하게 부착될 수 있습니다.

펠릿이 빠지거나 분실되지 않도록 디캔팅할 때 주의해야 합니다. OMV 입자가 매질에서 완전히 고갈되었는지 확인하기 위해 나중에 동적 광 산란을 위해 상등액을 저장합니다. 실험 요구 사항 또는 조건에 따라 결정된 대로 1ml의 멸균 여과된 PBS, PH 7.4 또는 기타 여과된 완충액을 펠릿에 0.5-1ml를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 정제된 OMV 용액을 조심스럽게 피펫으로 피펫하고 부드럽게 혼합하여 전체 펠릿이 용해되었는지 확인합니다. OMV 크기 분포를 확인하려면 사용 중인 기기의 DLS 나노 입자 추적 소프트웨어를 엽니다. 현미경을 켜고 현미경과 나노 입자 추적 장치의 모든 표면을 청소합니다.

1밀리리터 멸균 주사기를 사용하여 약 0.5mL의 OMV 샘플을 하단 피팅을 통해 입자 추적 장치의 관찰 창에 직접 추가하고 시스템에 기포를 주입하지 않고 전체 관찰 창을 덮도록 주의합니다. 나노 입자 추적 장치를 현미경 스테이지에 놓고 레이저를 켭니다. 그런 다음 소프트웨어에서 캡처를 클릭합니다.

현미경 초점과 스테이지를 조정하여 소프트웨어 창에 있는 미리보기 화면에서 입자를 시각화합니다. 어두운 배경에서 밝은 입자가 명확하게 시각화될 때까지 카메라 셔터와 카메라 게인을 조정합니다. 캡처 시간을 60초로 조정한 다음 Record(기록)를 클릭합니다.

메시지가 표시되면 샘플 장치 온도를 입력하고, 샘플에 레이블을 지정하고, 각 실행이 완료되면 비디오 데이터를 사용자가 지정한 폴더에 저장합니다. 모든 분석 매개변수를 자동 탐지 모드로 유지하고 Process Sequence를 클릭합니다. 입자 크기 분포 및 농도를 소프트웨어에 의해 결정된 밀리리터당 입자로 기록합니다.

OMV 단백질 함량을 측정하려면 SDS-PAGE 및 Western Blots를 사용하여 OMV 순도 효소 생산을 평가하고 SpyCatcher 또는 SC를 SpyTag 또는 ST 교차 링크 효율로 평가합니다. 표적 효소와 앵커 단백질의 발현을 확인하는 것이 필수적입니다. 재조합 단백질의 발현은 다양한 이유로 인해 종종 실패할 수 있으며 성공적인 단백질 생산은 OMV 특성 분석 전에 확인되어야 합니다.

포스포트리에스테라제 또는 PTE 활성 분석을 수행하려면 CHES 완충액에 있는 파라옥손 1-1,000 희석 5마이크로리터를 CHES 90마이크로리터에 정제된 OMV 5마이크로리터에 추가합니다. 총 반응 시간 중 약 2시간 동안 20초마다 405나노미터 및 348나노미터에서 흡광도 판독값을 측정하여 발색 파라옥손 분해 산물 p-니트로페놀의 진행을 모니터링합니다. 마지막으로 텍스트 프로토콜에 따라 데이터 분석을 수행합니다.

다음은 SEM을 통해 E.coli에서 정제된 OMV의 형태에 대한 예입니다. OMV의 크기는 입자 추적 기기를 사용하여 측정된 대로 50에서 250나노미터까지 다양합니다. 이 그래프에는 절대 OMV 농도가 표시되어 있습니다.

아라비노스와 IPTG가 있는 상태에서 N 말단 OMP-A-ST를 PTE-SC와 동시 형질전환했을 때, 대조군 샘플에 비해 OMV 생산량이 크게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 여기에서 볼 수 있는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯은 OMP-A-ST, 네이티브 OMP-A, PTE-SC 및 OMP-A-ST-PTE-SC에 대한 OMV 단백질 함량 및 재조합 단백질 발현을 추가로 특성화합니다. 이 그림에서 세포 펠릿, UC 상등액 및 정제된 UC OMV 펠릿의 전체 PTE 발현 수준과 OMV 패키징 효율은 파라옥손을 발색 기질로 사용한 초기 속도 측정에 의해 결정되었습니다.

여기에서 Triton X-100은 손상되지 않은 OMV 이중층에서 파라옥손의 전좌를 확인하는 데 사용되었습니다. 세제를 사용하거나 사용하지 않은 경우의 활성 차이는 거의 없었으며, 이는 파라옥손이 OMV의 내인성 기공을 자유롭게 통과한다는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 이 실험에서 볼 수 있듯이 PTE-SC 동역학 데이터는 아라비노스 활성화가 있을 때 PTE-SC와 공형질전환되고 IPTG 및 PTE-SC와 함께 형질전환된 N 말단 OMP-A-ST에 대한 표준 Michaelis-Menten 효소 동역학 방정식에 적합합니다.

모든 유전자 구조가 만들어지고 확인되면 효소 패키징 및 OMV 정제를 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 새로운 구조가 개발될 때마다 OMV를 확인하고 특성화하는 데 세 번째 날이 필요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 재료 및 원심분리 장비의 안전 등급을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

또한 다음 단계로 진행하기 전에 각 단계의 성공 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 여기에 설명된 특성화 단계는 효소 패키징 및 OMV 형태학을 확인하기 위해 다른 단계로 보완할 수 있습니다. 단백질 농도, 지질 함량, LPS 농도 및 기타 여러 특성은 페이로드 및 내전(adduction) 조건에 따라 달라질 수 있으며 다운스트림 응용 분야에 영향을 미칠 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 효소 충전 OMV를 정제하고 특성화하는 방법과 효소 화물의 활성을 평가하기 위한 예비 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 및 화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 무균 기술 및 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 사용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.