준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

이 절차의 전반적인 목적은 방사광 가속기 및 X선 자유 전자 레이저 광원에서의 연속 결정학 데이터 수집을 위해 지질 입방상(lipidic cubic phase) 내 막단백질 결정 샘플을 준비하는 것입니다. 이 방법은 막을 통한 수송 및 신호 전달과 같이 막단백질 구조 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 샘플 소모량과 무시할 수 있는 수준의 방사선 손상으로, 상온의 천연 지질 환경에서 막단백질의 구조 결정이 가능하다는 점입니다.

지질 입방상(lipidic cubic phase)은 점성이 있는 겔 형태의 물질로, 특수 도구와 사전 경험 없이는 다루기 어렵기 때문에 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 1번 및 2번 시린지를 사용하여 지질 입방상(LCP) 내에 막 단백질을 재구성하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 투명하고 균질한 LCP가 형성되면, 샘플 전체를 2번 시린지로 옮기십시오.

커플러를 2번 주사기에 연결된 상태로 유지하면서 1번 주사기를 분리합니다. 3번 주사기라고 명명된 또 다른 100 µL 청결 주사기에 탈착 가능한 바늘을 연결합니다. 침전제 용액 약 70 µL를 주사기 안으로 흡입합니다.

Teflon spherule가 주사기 내부에 있도록 유지한 상태에서 3번 주사기에서 바늘을 분리합니다. 커플러를 통해 2번 주사기와 3번 주사기를 연결하고, 두 주사기 모두에 Teflon spherule이 올바르게 위치해 있는지 확인합니다. 커플러를 조심스럽게 끝까지 돌려 단단히 고정합니다.

결합된 주사기들을 수직으로 세우고 2번 주사기를 아래쪽으로 배치한 다음, 2번 주사기에 들어있는 단백질 함유 LCP 샘플을 3번 주사기의 플런저에 LCP 스트링이 닿을 때까지 천천히 일정하게 주입하십시오. 주입되는 LCP 부피는 3번 주사기에 처음에 들어있던 침전제 부피의 약 1/10 정도가 됩니다. 두 주사기의 눈금 읽기 값을 통해 부피를 확인하십시오.

그다음, 2번 시린지를 분리합니다. 이제 커플러는 침전제 용액에 담긴 시료가 들어 있는 3번 시린지에만 연결된 상태가 됩니다. 파라필름(Parafilm)을 사용하여 플런저와 시린지의 접합부, 커플러의 개방형 끝단, 그리고 니들 너트를 포함하여 3번 시린지를 완전히 밀봉합니다.

이 단계에서 밀봉이 불완전하면 침전제 조건이 변하거나 시료가 탈수될 수 있습니다. 단백질이 함유된 LCP 시료 주입 단계를 반복하여 6개의 추가 시린지에 결정화를 설정하며, 이때 총 약 50 µL의 LCP 시료를 사용합니다. 시료의 탈수를 방지하기 위해 물에 미리 적신 먼지 없는 세척 티슈 1~2장을 함께 넣어 밀봉 가능한 플라스틱 백에 밀봉된 시린지들을 보관하십시오.

봉투를 밀봉하고, 결정 성장 동안 주사기를 20°C 배양기에 보관하십시오. 결정 검출을 위해 12~24시간마다 주사기를 배양기에서 꺼내어, 교차 편광 장치가 장착된 실체 현미경 하에서 주사기 내부의 LCP 샘플을 직접 관찰하십시오. 결정은 조밀하게 뭉쳐진 빛나는 입자로 식별하며, 결정 크기가 작은 경우에는 LCP 필라멘트에서 발생하는 균일한 광채로 식별합니다.

밀봉된 주사기를 가방에 넣어 20 °C에서 보관하여 추후에 사용하십시오. 지질 적정 단계는 과잉 침전제 용액을 흡수하고 x-ray-free electron laser 빔에 주입 시 지질이 동결되는 것을 방지하기 위해 필요합니다. 데이터 수집 시작 약 1시간 전에 20 °C 인큐베이터에서 샘플이 들어 있는 주사기를 꺼내십시오.

유사한 결정 외관과 결정화 조건의 유사성을 바탕으로 시료 통합에 사용할 주사기 2~4개를 선택합니다. 선택한 주사기에서 Parafilm 밀봉을 조심스럽게 제거합니다. 주사기 커플러를 제거하고, 첫 번째로 선택한 주사기에 깨끗한 탈부착식 바늘을 부착합니다.

플런저를 천천히 부드럽게 밀어 침전제를 바늘을 통해 마이크로원심분리 튜브 속으로 짜냅니다. 이 단계에서 주의가 필요합니다. 플런저에 강한 압력을 가하면 침전제 용액과 함께 결정이 포함된 LCP의 일부가 배출되어 샘플의 일부 또는 전체가 손실될 수 있기 때문입니다. 침전제의 대부분이 제거되고 LCP가 바늘 입구에 모이면 플런저를 멈춥니다.

선택한 다른 주사기들에 대해서도 이 과정을 수행하십시오. 결과로 얻은 LCP 샘플들을 통합하려면, 깨끗한 커플러를 통해 두 주사기를 서로 연결하십시오. 한쪽 주사기의 플런저를 눌러 한 주사기의 샘플 전체를 다른 주사기로 옮기십시오.

빈 시린지를 분리합니다. 이 단계를 반복하여 결정이 포함된 모든 LCP 물질을 하나의 시린지에 모읍니다. 침전제를 가능한 한 많이 제거하십시오.

약 5 µL의 7.9 MAG 또는 원래의 짧은 사슬 MAG 호스트 지질을 빈 시린지에 넣습니다. 이 시린지를 시린지 커플러를 통해 통합 샘플이 들어 있는 시린지에 연결하고, 시린지 플런저를 교대로 눌러 혼합합니다. 잔류 용액이 모두 흡수되고 균질하며 투명한 LCP가 형성될 때까지 이 과정을 반복합니다.

혼합된 LCP 샘플 전체를 하나의 주사기로 옮기고, 빈 주사기는 분리합니다. 통합된 샘플이 담긴 주사기에 LCP 인젝터 로딩 바늘을 부착합니다. 약 1 µL의 LCP 샘플을 유리 슬라이드 위에 조심스럽게 분사하고, 유리 커버 슬립으로 덮습니다.

커버 슬립을 가볍게 눌러 샘플을 고정합니다. 명시야 조명과 직교 편광판을 사용하여 실체 현미경의 최대 배율에서 LCP 샘플의 이미지를 촬영합니다. 가능하다면 UV 형광 현미경과 이미저를 사용하여 추가 이미지를 촬영함으로써 샘플 내에 단백질 미세 결정이 존재하는지 확인합니다.

결정의 크기와 밀도를 추정합니다. 데이터 수집 실험을 위한 이상적인 결정 밀도는 결정의 크기, X-선 빔의 직경, LCP 스트림의 직경에 따라 달라지며, 결정 히트율(hit rate)이 약 10에서 40%가 되도록 설정해야 합니다. 마지막으로, LCP 인젝터를 충전하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LCP 직렬 펨토초 결정학 또는 LCP SFX 데이터 수집을 수행합니다. 여기에는 명시야 현미경 모드와 직교 편광 현미경 모드로 촬영한 ergometrine과 복합체를 이룬 세로토닌 수용체 마이크로결정이 표시되어 있습니다.

세로토닌 수용체 에르고타민 복합체의 구조는 LCP SFX 방식으로 얻었습니다. 여기에는 교차 편광 현미경 모드를 사용하여 촬영한 사이클로파민과 복합체를 이룬 스무던트 수용체의 미세 결정이 나타나 있습니다. 수용체 사이클로파민 복합체의 구조는 LCP SFX 방식으로 얻었습니다.

이 절차를 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 막 단백질 표적의 구조에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 약간의 수정을 통해 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 활용 범위는 약물 발견까지 확장되는데, 고해상도 구조는 표준 리그난 단백질 상호작용의 우수한 템플릿을 제공하여 더 효율적인 약물을 설계하는 데 도움을 주기 때문입니다.