Name: 준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 지질 큐빅 상에서 막 단백질 미세결정을 준비하고 직렬 펨토초 결정학에 적용하는 방법을. 이 기술은 실온에서 최소한의 시료 소비와 방사선 손상 없이 구조를 결정할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 R01 GM108635 및 U54 GM094618, 메이요 클리닉 - ASU 공동 씨 그랜트 상 및 NSF STC 수상 1231306.는 우리는 원고 준비에 도움 A. 워커 감사 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 부여 지원되었다.

1. 필터링 솔루션 및 지질 참고 : LCP 인젝터를 방해 할 수있는 샘플의 미립자 오염 물질의 도입을 피하기 위해 가능한 한이 프로토콜에 사용 된 모든 시약과 도구가 깨끗해야한다. <ol><li> 5 μm의 스핀 다운 필터를 통해 모든 침전제 솔루션 및 용융 지질를 필터링합니다. 청소 주사기 철저히 건조 압축 공기를 적용합니다. 선택적으로, 샘플 준비 과정에서 먼지 입자 또는 섬유를 트래핑 방지하기 위해 휴대용 클린 룸 후드를 사용합니다. </li></ol> LCP의 MP의 2에서 재구성 주 : 결정화를위한 최선의 LCP 호스트 지질의 선택 대상 MP에 의존하고, 일반적으로 호스트 지질 스크리닝 정석 실험 (14)에서 식별된다. Monoacylglycerols (멕스)는 LCP 결정화 (15)에 사용되는 지질의 일반적인 클래스를 나타낸다. 프로토콜은 9.9로 MAG (모노 올레)를 사용에 기초이 날짜 16 메조의 결정화를위한 가장 성공적인 지질이기 때문에, 지질를 개최. 9.9 MAG 그들의 위상 동작 계정 차이점을 고려한 후에 다른 LCP 호스트 지질 또는 지질의 혼합물로 치환 될 수있다. 예를 들어,의 GPCR의 경우는 일반적으로 모노 올레 수용체 안정화 콜레스테롤로 도핑된다. 여기서, 구 사용 : 1 MAG 9.9 (W / w) : 호스트 지질로서 콜레스테롤 혼합물. <ol><li> 앞서 설명한대로 13 믹스 개의 주사기 (# 1, # 2) 및 결합기를 이용하여 적절한 LCP 호스트 지질과 세제 미셀 용액에 정제 MP를 타겟팅. </li><li> 간략하게, MP 솔루션 용융 지질과 주사기 # 2와로드 주사기 # 1. 2 V 9.9 MAG에 대한 / V 지질 / MP 솔루션, 1 : 1 v / V를 단지 해당 LCP 호스트 지질의 최대 수화 용량보다 낮은 수준, 예를 들어, 3에 해당하는 지질 및 수성 MP 솔루션 사이의 비율을 사용하여 대부분의 다른 짧은 체인 멕에 대한 지질 / MP 용액 (7.9 MAG9.7 MAG 등). </li><li> 주사기 커플러를 통해 주사기를 연결하고 시료가 균일하고 투명해질 때까지 앞뒤로 주사기의 혼합물을 이동하는 플런저를 누름으로써 물질을 혼합 시작합니다. LCP-SFX하여 완전한 데이터 세트의 수집에 대한 LCP 샘플의 약 50 μl를 준비합니다. 최종 샘플 량은 일반적으로 샘플 통합 및 지질 적정 (5 절) 후 2 (㎕를 100 ~까지)의 약 배 증가 할 것이다. </li></ol> 3. 주사기에 결정화 설정 <ol><li> 투명하고 균질 한 LCP를 형성 한 후, 주사기 # 2으로 전체 샘플을 이동. 주사기 # 2에 연결된 커플러를 유지하면서, 주사기 # 1 분리. </li><li> 다른 100 μL에 이동식 바늘 (게이지 26S)를 연결 깨끗한 주사기 (주사기 # 3)과에 침전제 솔루션의 흡인 약 70 μL. F 트리거 침전제 용액의 조성고밀도의 미세 ormation 각 대상 MP에 대한 고유하고 이들 프로토콜로 진행하기 전에 결정되어야한다. 여기서,은 A 2A 수용체 (40 mM의 나트륨 티오 시아 네이트, 100 mM 시트르산 나트륨 pH를 5 26~28% PEG400)의 미세 결정의 샤워 수득 최적화 침전제 용액 조성물을 사용한다. </li><li> 주사기 내부의 테프론 페룰을 유지하면서 주사기 # 3에서 바늘을 분리합니다. </li><li> 테프론 페룰 모두 주사기에 위치에 제대로 있는지 확인하고, 커플러를 통해 주사기 # 2, # 3를 연결합니다. 조심스럽게 위치에 단단히 커플러를 조입니다. </li><li> 수직으로 바닥에 주사기 # 2와 LCP 문자열 주사기 # 3의 플런저에 닿을 때까지 천천히 그리고 꾸준히 주사기 # 3에 주사기 # 2에서 단백질 라덴 LCP 샘플을 주입의 방향을 결합 주사기. 주입 된 LCP 볼륨 주사기 # 3 (~ 7 μL)의 약 1/10 초기 침전제 볼륨에 달할 것입니다. 모두 syri의 규모 읽기 볼륨을 확인nges (모두 플런저는 약 7 μL로 이동해야합니다). </li><li> 분리 주사기 # 2. 커플러는 이제 침전제 용액에 침지 샘플을 포함 주사기 # 3에 접속되어있다. </li><li> 완전히 플런저 주사기 인터페이스 커플러의 개방 단부와 바늘 너트 포함 주사기 # 3, 밀봉 파라 필름을 사용한다. 이 단계에서 불완전 밀봉 변경할 수있는 침전제 조건 탈수 할 수있는 샘플을 일으킬 수 있습니다. </li><li> 반복 ~ 6 추가 주사기 (# 9 4- #)의 총 이용에 LCP 샘플의 50 μl를 결정화를 설정 3.3-3.7 단계 (~ 각 주사기 당 LCP의 7 μL). </li><li> 상점은 하나 또는 두 개의 섬유 무료 청소 조직이 샘플 탈수를 방지하기 위해 물에 미리 담가과 플라스틱 밀봉 봉투에 주사기를 밀봉. 결정 성장하는 동안 20 ° C를 인큐베이터에서 가방 가게 주사기를 밀봉합니다. </li></ol> 4. 크리스탈 검출 <ol><li> 이미지 LC에 인큐베이터에서 주사기를 제거직접 주사기 내부 P 샘플 (# 3 # 9) 교차 편광과 실체 현미경 하에서 모든 12 ~ 24 시간. LCP의 필라멘트에서 균일 한 빛이 작아 결정 크기의 경우에 단단히 포장 반짝이 입자와 같은 결정을 식별하거나. </li><li> 가방에 밀봉 된 주사기를 반환하고, 향후 사용을 위해 20 ° C에서 보관. </li></ol> 7.9 MAG 5. 샘플 통합 및 적정 참고 :) 초과 침전제 용액을 흡수하고 b)는 XFEL 빔을 주사에 냉동 지질을 방지하기 위해 : 여기에 설명 된 지질 적정 단계는 두 가지 목적을 제공합니다. 9.9 MAG 이루어지는 LCP 샘플은 데이터를 수집하기위한 진공 챔버에 주입 할 때, 집중 증발 라멜라 결정상으로 샘플의 일부를 변환하는 다운 평형 상전이 온도 (~ 18 ° C)의 온도에 샘플을 냉각 할 (LC). 빔에 의해 공격 LC 단계의이 패치는 강렬한 분말 diffr을 생산예를 들면 코넬 - SLAC 픽셀 어레이 검출기 (CSPAD)와 같은 민감한 검출기 (6)가 손상 될 수 있습니다 액션 반지. 이러한 혼합물은 낮은 상전이 온도를 가지고 짧은 체인 지질 (MAG 9.7 또는 7.9 MAG)와 9.9 MAG 시료의 적정이 문제를 완화시킨다. 여기, 우리는 7.9 MAG와 9.9 MAG 구성된 LCP의 적정을 설명합니다. 짧은 사슬 멕스 (9.7 MAG 7.9 MAG 등), 결정화에 사용되는 또는 직렬 결정학 데이터는 대기압에서 회수 할 때 단계 5.11의 적정 여전히 필요하지만 때 채용 원래 LCP 호스트 지질을 사용하여 수행 될 수있다 결정화. <ol><li> 약 1 시간 데이터 수집의 시작 전에 20 ° C 배양기에서 샘플을 주사기를 제거합니다. </li><li> 결정화 조건의 유사한 결정 모양과 유사성을 기반으로 샘플 통합을위한 2-4 주사기를 선택합니다. </li><li> 조심스럽게 선택된 주사기에서 밀봉 파라 필름을 제거합니다. </li><li> 없애다주사기 커플러는 처음 선택한 주사기에 깨끗한 이동식 바늘 (게이지 26S)를 연결합니다. 부드럽게 천천히 microcentrifuge 관에 바늘을 통해 침전물을 짜내 앞으로 플런저를 밀어 넣습니다. 이 단계에서 운동주의는이 단계에서 플런저에 높은 압력을 적용하는 샘플의 일부 또는 전체 손실로 이어지는, 침전제 용액과 함께 결정 라덴 LCP의 일부를 추출 할 수 있기 때문이다. </li><li> 침전제의 대부분이 제거 된 상기 LCP 니들 입구에 축적 될 때, 플런저를 중지. </li><li> 다른 선택 주사기와 단계를 반복 5.4-5.5. </li><li> , 결과 LCP 샘플을 통합 깨끗 커플러를 통해 두 개의 주사기를 연결합니다. </li><li> 다른 주사기의 하나에서 모든 샘플을 전송하기 위해 하나의 주사기 플런저 우울. </li><li> 빈 주사기를 분리합니다. </li><li> 반복 2-4 사전에서 결정 라덴 LCP 재료를 모두 통합 5.7-5.9 단계하나의 주사기에 -selected 주사기. 가능한 한 많은 침전물을 제거합니다. </li><li> 빈 주사기에 7.9 MAG 또는 원래 짧은 체인 MAG 호스트 지질 ~ 5 μl를 추가합니다. 주사기 커플러를 통해 통합 된 샘플 주사기에이 주사기를 연결하고 대안 주사기 플런저를 누름으로써 섞는다. 모든 잔류 용액을 흡수하여 균일하고 투명한 LCP가 형성 될 때까지 반복한다. 적정 후에 LCP의 최종 양은 과량 침전제와 그 조성물의 양에 따라 20 내지 35 μL로 변할 수있다. </li><li> 하나의 주사기에 전체 혼합 LCP 샘플을 이동하고 빈 주사기를 분리합니다. </li></ol> 미세 6. 특성 <ol><li> 통합 샘플 주사기에 LCP-인젝터 로딩 바늘 (포인트 스타일 3, 게이지 (22), 길이 1 인치)를 연결합니다. </li><li> 조심스럽게 유리 슬라이드에 LCP 샘플 ~ 1 μl를 배출하고는 유리 커버 슬립으로 다룹니다. 조심스럽게 누르지샌드위치에 커버 슬립 샘플. </li><li> 밝은 필드 조명 및 교차 편광기를 사용하여 가장 높은 배율 (전형적 100X)에서 스테레오 현미경 LCP 샘플 이미지를 취할. 가능하면, 시료 중의 단백질 미세 결정의 존재를 확인하기 위해 UV 형광 현미경 (키랄 크리스탈 이차 비선형 영상)을 SONICC 이미 저 (17)를 사용하여 추가 이미지를 취할. </li><li> 결정 크기 및 밀도 (10)를 추정한다. 데이터 수집 실험 이상적인 결정 밀도는 결정 크기는 X 선 빔의 직경과 LCP 스트림의 직경에 의존하며, 약 10~40%의 결정 적중률 초래한다. </li></ol> 크리스탈 밀도 7. 조정 주 : 결정 밀도 단계에서 발견 된 경우 6.4 여러 결정 히트들의 큰 비율의 결과가 너무 높으면, 결정이 최적화 아래와 같이 다음 희석되어야데이터 수집을위한 샘플. 결정 밀도 준비된 모든 시료에서 효율적인 데이터 수집이 너무 낮 으면 LCP의 MP 결정 농축위한 신뢰할 수있는 방법이 없기 때문에, 그 결정 성장 조건은, 다시 최적화한다. <ol><li> 깔끔한 LCP의 요구량을 제조하여 희석 할 필요가 결정 원래 시료의 LCP 조성물 (동일한 지질 및 침전제)을 모방하여 희석을 위해 사용된다. </li><li> 하나의 주사기에 모든 깔끔한 LCP를 이동합니다. 빈 주사기를 분리하지만, 연결 커플러를 둡니다. </li><li> 미세과 LCP 샘플이 들어있는 주사기에서 바늘을 제거합니다. 커플러를 통해 깔끔한 LCP가 들어있는 주사기에 샘플 주사기를 연결합니다. </li><li> 균일 성이 달성 될 때까지 커플러를 통해 앞뒤로 밀어 주사기의 내용을 섞는다. </li><li> 제 6 반복 조정 시료의 미세 결정 밀도를 다시 평가한다. </li></ol> 8. LCP 인젝터로드차 LCP-SFX 데이터 수집 <ol><li> 샘플과 주사기의 커플러를 분리하고 주사기에 1 &quot;로딩 바늘을 연결합니다. </li><li> LCP 인젝터의 저장소에 샘플의 20 ~ 40 μl를 전송합니다. </li><li> 시료 챔버 (18)에 LCP 인젝터를 삽입 인젝터를 시작 유량을 조정하고 LCP-SFX 데이터를 수집한다. </li></ol> LCP 9. 법인 가용성의 단백질 결정 참고 : 수용성 단백질의 결정의 전달을 위해 같은 LCP와 같은 점성이 높은 매체를, 사용하여 하나가 극적으로 직렬 결정학 실험에서 단백질 소비를 줄일 수 있습니다. 이 단계에서 우리는 LCP에 수용성 단백질의 결정을 통합하는 방법에 대해 설명합니다. 결정은 결정 현탁액의 형태로 함께 통합되어 필요한 경우, 여과 된 기술로 수득 할 수있다. <ol><li> 약 10~40%의 결정 적중률을 보장하기 위해 정지 결정 밀도를 조정합니다. </li><li> 티동부 표준시 7.9 MAG, 9.7 MAG 또는 1 사용 LCP와 침전제 솔루션의 호환성 : 7.9 MAG 1 혼합물 호스트 지질로 9.9 MAG합니다. </li><li> 믹스 ~ 함께 결정 현탁액 25 μL ~ 균질 LCP이 형성 될 때까지 주사기 믹서 호스트 지질의 25 μL. </li><li> 제 8 항에 기술 된 바와 같이 데이터를 LCP 인젝터에 제 6로드에 샘플을 설명하고 수집으로 결정 크기 및 밀도를 평가합니다. </li></ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명 된 프로토콜은 LCP 인젝터 표준 LCP-SFX 실험을위한 시료 준비 과정의 일반적인 개요를 제공한다. 미결정 크기에 따라, 우리의 경험을 바탕으로, 전체 데이터 세트를 수집하는데 필요한 최종 미결정 함유 LCP 샘플의 총량은 전형적으로 50 내지 100 μL (초기 단백질 함유 LCP 샘플 25-50 μL 표 1)은 품질 및 밀도. 각 100 μL 기밀 유리 주사기 적절한 상기 LCP에 침전제 용액에도 확산을 위해 완전히 연장 된 문자열 형태의 LCP의 약 7 μl를 수용 할 수 있기 때문에, 주사기 적어도 4-7 시료를 준비해야 각 LCP-SFX 실험. 샘플을 직경 모세관 좁은 20-50 μm의 통해 압출되기 때문에, 시료의 이물질 미립자 물질을 피하기 위해 중요하다. 가끔 LCP에 도입 될 수있는 먼지 및 섬유샘플 또는 침전제 용액 인젝터 모세관 폐색 및 실험 중에 중단 시간을 증가시킬 수있다. 따라서, 샘플을 준비하기 전에 5㎛의 기공 필터를 통해 모든 지질 용액을 필터링하는 것이 중요하다. 선택적으로, 청정실 또는 청정실 휴대용 후드 샘플 제조에 사용될 수있다. 이러한 프로토콜은 MP의 결정화를위한 호스트로서 지질 9.9 MAG (모노 올레)를 사용에 기초한다. 그러나 이들은 9.9 MAG에 한정되지 않고 쉽게 고려 지질 상 거동의 차이를 복용 후 다른 LCP 호스트 지질 또는 지질의 혼합물로 구성 될 수있다. LCP 결정화 의원의 구조의 대부분은 9.9 MAG 15 지금까지 가장 성공적인 대표되는 더불어 멕스 중 하나를 사용하여 얻어졌다. SFX 9.9 MAG 사용의 주요 단점은 데이터 수집 진공에서 수행 될 때 종종 발생하는 18 ° C,보다 냉각시 라멜라 결정상으로의 전이이다. titrati7.9 MAG이 프로토콜의 제 5 절에 기술과에이 문제에 대한 좋은 솔루션을 제공합니다. 우리의 경험에 의하면, 결정은 부작용없이 같은 적정을 견딜. 그러나 7.9 MAG 또는 다른 짧은 체인 MAG의 첨가는 바람직하지 않은 경우, 적정 9.9 MAG로 수행 될 수있다. 이 경우, 진공 상태로 주입하는 동안 LCP의 흐름을 안정화 가스는 덜 안정 샘플 흐름을 갖는 희생 대부분의 샘플에서 결정 지질상의 형성을 방지 할 수있는, 질소, 헬륨로 전환되어야한다. 이 현대 XFEL 및 싱크로트론 소스에 직렬 결정학 데이터 수집에 적합한 넓은 범위에 걸쳐 결정의 유량을 조정할 수 있기 때문에 LCP의 겔형 일관성은 결정 담체 매질로서 사용하기 위해 큰 장점을 갖는다. (C)의 크기 순서에 의해 결정 소비 극적인 감소에 XFEL 펄스 반복율 결과 결정 유량 매칭액체 주입 ompared. LCP는 또한 가용성 단백질 (21)의 결정을 위해, 단지 그것이 성장 MP 결정의 전달을위한 적합한 담체 매체이다. 직렬 결정학 실험을 수행하기위한 도구와 시약의 무기고를 확장, 24 - 여러 대안 점성 결정 캐리어 미디어는 최근 22 도입되었다. 또한, 액정 전달 매체로서 LCP 직렬 결정학 적어도 잘 회절 결정 (24, 25)에 대해, 종래의 싱크로트론 소스에서 입증되었다. 검출기 기술에 대한 X 선 크기의 주문에 의해 강도뿐만 아니라 개선을 향상 싱크로트론 소스의 미래 업그레이드, 일련 결정학 구조 결정에 더욱 접근 가능하고 매력적인 방법을 만들 것입니다. LCP-SFX는 MP 구조 결정에 대한 효능을 입증했다. 여기서, L (예 : 된 GPCR 또는 거대 분자 복합체와 같은) 도전 생물학적 시스템의아니라 단지 가능한 옵션 원자 해상도 구조를 해결하는 경우 ARGE 회절 품질 결정이 성장하기 어려운, LCP-SFX는 매력을 제공 할 수있다. 모든 장점과 함께 즉, MP 결정화 및 결정 납품, 저가 단백질 소비, 방사선 손상의 유무, 실내 온도 데이터 수집, 시간이 해결 연구 26, 27의 가능성없이 결정 수확 요구 사항, LCP-의 행렬로 LCP를 사용하여 SFX는 구조 생물학의 미래에 중요한 역할을한다.

X 선 결정학은 막 단백질 (MPS)의 원자 해상도 구조를 해결하는 현재까지 가장 성공적인 방법이다. 또는, 메소 결정화 또한 지질 입방 상 (LCP)로 알려진 지질 중간상으로부터 결정화는 G 단백질 결합 수용체로서 도전 대상의 고해상도 구조 결정을 활성화 한 MP 결정학의 주요 개발 중 하나 (의 GPCR을 나타낸다 1). LCP 도구와 기술의 최근 발전은 세계 2 주위에 구조 생물학의 큰 커뮤니티에 사용할 수있는이 기술을 만들었습니다. 그러나, 많은 경우에 LCP에 형성 MP 결정은 높은 해상도에서 충분한 신호 (3)를 수득 할 수 있기 전에 샘플이 심한 방사선 손상 및 열화 고통 심지어 가장 진보 된 마이크로 포커스 싱크로트론 빔라인을 사용하기에는 너무 작다. 결정 데이터 수집에 대한 새로운 접근 방식최초의 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL)의 시운전으로 활성화되었습니다. 방법은 &quot;파괴하기 전에 회절&quot;의 원칙, 최초의 이론적 4를 도입하고 선형 가속기 코 히어 런트 광원 (LCLS) 3, 하드 XFELs에서 세계의 개척자에서 생물학적 시료에 실험적으로 확인을 기반으로합니다. XFEL 단백질 원자 방사선 손상에 응답하여 이동하기 전에 원시 결정에서 회절 펨토초 기간 내에 수십 고휘도 X 선 펄스를 생성한다. 초기 실험에서, 미세 연속 액체 분사 장치 (5)에 의해 제조 된 수성 스트림의 XFEL 빔 교차점에 공급 하였다. 이 실험 장치는 시리얼 펨토초 결정학 (SFX)로 알려져있다. SFX위한 액체 분사 장치를 사용하는 주요 단점은 결과적으로 전체 데이터 세트의 수집을 위해 정제 된 단백질 밀리그램 수십에서 수백를 필요로 높은 유량이다. EMP으로현저히 감소 된 단백질, 9 - 겔상 LCP 샘플들을 처리 할 수있는 특별한 주입기 (LCP의 microextrusion 인젝터) 6 loying 우리는 성공적 LCP 매트릭스에서 성장 여러 인간의 GPCR의 미세 전달 및 고해상도 구조 (6)를 수득 세트 당 0.3 미만 mg의 소비. 인젝터는 최대 20, 40 또는 100 크리스탈 함유 LCP ㎕의 샘플이 (10000까지 고압의인가에 의해 압출되는 좁은 모세관 (직경 10 ~ 50 μm의)을 보유 할 수있는 저장 이루어져 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피) 펌프로부터의 액체에 의해 구동되는 압력 증폭 스테이지 유압 플런저로부터 PSI). 모세관 노즐을 빠져 LCP의 스트림이 반응성 가스 (통상, 헬륨 또는 질소)를 평행 흐름에 의해 안정화된다. 여기에 우리가 준비하고 샘플을 특성화하기 위해 필요한 단계의 시각적 데모를 제공합니다LCP-SFX의 실험. 자세한 내용은 게시 된 프로토콜 (10)에서 찾을 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 SFX 방식을 사용하여 X 선 데이터 수집 LCP이 단백질의 결정 아데노신 2A 수용체 (11) 및 사용 준비된다. 우리의 프로토콜 XFEL과 싱크로트론 소스에 직렬 결정학에 의해 데이터 수집 LCP를 스트리밍 할 수있는 임의의 인젝터와 호환 있지만, 설명을 위해, 우리는 참고 문헌에 기술 된 LCP 인젝터를 사용합니다. LCP 고밀도 미세 생성 6. 최적화 침전 조건은 높은 처리량 프로토콜이 결정화를 진행하기 전에 12,13 스크리닝에 의해 식별되어야한다. 이 프로토콜의 일반적인 흐름도가도 1에 도시되어있다.

<table><tbody><tr><td>LCP 숙주 지질 모노올레인 (9.9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>결정화될 단백질을 위한 숙주 지질</td></tr><tr><td>LCP 숙주 지질 모노올레인 (9.9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>단백질이 결정화되기 위한 숙주 지질</td></tr><tr><td>LCP 숙주 지질 모노팔미톨레인 (9.7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>결정화될 단백질을 위한 숙주 지질</td></tr><tr><td>LCP 숙주 지질 7.9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>시료 주입 중 층상 결정상(Lc) 형성을 피하기 위한 적정 처리를 위한 숙주 지질</td></tr><tr><td>20-50 mg/ml</td><td></td><td></td>로 농축된 정제 단백질 용액 <td>클로</td></tr><tr><td>로포름</td><td>Fisher 지</td><td>질을 녹이기 위하여 사용되는</td>과학적인 <td>C606-1</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td> 주사기 Eleven 100 &#956<td>를 세척하기 위하여 사용</td></tr><tr><td>하는; l 바늘이 없는 Hamilton 기밀 주사기</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>LCP 준비용</td></tr><tr><td>8개의 주사기 커플러</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>LCP 준비용</td></tr><tr><td>LCP 주입기 로딩 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7804-01 포인트 스타일 3, 길이 1인치</td><td>LCP 디스펜싱 및 인젝터 로딩용</td></tr><tr><td>탈착식 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>침전제 용액 제거용</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>주사기 밀봉에 사용</td></tr><tr><td>보푸라기 없는 렌즈 청소 티슈</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>침전물 용액 및 지질 필터링에 사용</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 1 인치 x 3 인치&nbsp;</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>팁이 미세한 두 개의 세척 병. 하나는 milli-Q 또는 증류수로 채워져 있고, 다른 하나는 메탄올</td><td>VWR</td><td>89094-640</td>으로 채워져 <td>있습니다. 이것들은 주사기, 바늘, 커플러를 청소하는 데 사용됩니다. 메탄올이 먼저 사용되고 그 다음에 물이 사용됩니다.</td></tr><tr><td>장갑</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>주사기, 바늘, 페룰, 커플러 블로우 드라이</td></tr>용 <tr><td>안전 안경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>압축 공기 캔</td><td>Office Depot (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>주사기 청소용</td></tr><tr><td>디지털 온도 컨트롤러가 있는 드라이 블록 히터</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>지질 해동에 사용</td></tr><tr><td>벤치탑 원심분리기</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>회전 다운 솔루션</td></tr><tr><td>클린 룸 미니 - 12인치 휴대용 양압 후드(HEPA 필터 포함</td>) <td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>청소 샘플 준비</td></tr><tr><td>선형 편광판과 회전 분석기가 장착된 스테레오 줌 현미경&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>결정 밀도 확인</td></tr><tr><td>UV 현미경</td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>옵션, 크리스탈 이미징 목적</td></tr><tr><td>SHG 이미저</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>옵션, 크리스탈 이미징 목적</td></tr></tbody></table>

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

막 단백질 (의원)은 세포막 및 기본 약물 표적의 필수 구성 요소입니다. 합리적 약물 설계는 일반적 결정학에 의해 얻어진 정확한 구조적 정보에 의존하고; 그러나 의원은 결정화하기 어렵다. MP 구조 결정에 최근 진행 싱크로트론 소스에서 기존의 결정 데이터를 수집하는 동안 방사선 손상으로 고통 일반적으로 잘 회절 산출 지질 입방 단계 (LCP) 결정화 방법,하지만 종종 작은 결정의 개발에 크게 도움이되고. 차세대 X 선 자유 전자 레이저 (XFEL) 매우 밝은 펨토초 펄스를 생성 소스의 개발이 없거나 무시할 방사선 손상과 미세에서 실내 온도 데이터 수집을 사용할 수있다. 직렬 펨토초 결정학 (LCP-SFX)과 LCP 기술을 조합 한 우리의 최근의 노력은 승 여러 인간 G 단백질 결합 수용체의 고해상도 구조 이어질HICH 구조 결정에 대한 악명 어려운 대상을 나타냅니다. LCP의-SFX 기법에서, LCP는 결정 학적 데이터 수집을위한 XFEL 빔 주사 스트림의 교차점 MP 미결정 모두 성장 및 전달을위한 매트릭스로서 채용된다. 그것은 단지 서브 - 10 μm의 결정을 사용할 수있는 경우 LCP-SFX 실질적 또는 회절의 해상도를 향상시킬 수 있음을 입증되었다 실온에서 작은 결정의 사용은 결함의 축적과 같은 큰 cryocooled 결정과 연관된 다양한 문제들을 극복 할 수있는 경우에는, 높은 mosaicity 및 cryocooling 유물. X 선 소스와 검출기 기술의 미래 발전은 XFELs에서뿐만 아니라, 더 접근 싱크로트론 빔라인에서뿐만 아니라 구현을위한 일련 결정학은 매우 매력적이고 실용적인해야한다. 여기에서 우리는 일련 결정학 실험에 대한 LCP의 준비, 특성화 및 미세 결정의 전달을 위해 상세한 시각 프로토콜을 제시한다.이러한 프로토콜은, 주사기에서 결정화 실험을 검출 및 결정 샘플의 특성, 결정 밀도를 최적화하는 상기 주사 기기로 미결정 라덴 LCP 로딩 및 데이터 수집을 위해 상기 빔에 샘플을 제공하기위한 방법을 포함한다.

작용제의 에르고 타민 8 (PDB ID 4NC3 복잡한 세로토닌 수용체 5-HT 2B : 우리 대표 우리 SFX 데이터를 수집하고 다섯 인간의 GPCR의 고해상도 구조를 해결하기 위해 허용되는 상기 프로토콜에 따라 제조 된 샘플로 얻어진 결과를 설명하는 아래 ) 길항제의 cyclopamine 6 (PDB ID 4O9R)는 복잡한의 이중 기능성 펩티드 리간드 DIPP-NH 2 (7) (PDB ID 4RWD), 안지오텐신 수용체와 복잡한에, δ-오피오이드 수용체와 복잡한에 평활 수용체 (SMO) 차단 ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), 및 로돕신 19 (PDB ID 4ZWJ를) 아레스 사이의 복잡한; 및 수용성 단백질이 시험 : 라이소자임 (PDB ID 4ZIX) 및 피코시 아닌 (PDB ID 4ZIZ). 5-HT (2B)은 세로토닌의 다양한 중추 및 말초 생리적 기능을 매개한다. 이 수용체확립 고급 광자 소스 (APS)에서 전통 microcrystallography 해결 cryocooled 구조 LCLS에서 얻어진 실온 구조를 비교함으로써, LCP-SFX 방법을 확인하는 데 사용 하였다. 단백질 미세 100 μL의 LCP 시료 (평균 크기는 약 5 μm의) ~ 총 준비 SFX 데이터 수집에 이용하고, 5HT (2b)의 LCP-SFX 구조가 성공적으로 2.8 Å (도 2)도 8에 해결 하였다. 샘플 준비 및 데이터 수집에 유용한 추가 세부 사항은 표 1에 제공된다. 평활 수용체 (SMO)는 배아 발달 및 종양 성장에 잘 입증 기능을 가진 클래스 F 된 GPCR의 부재와 기형의 cyclopamine의 분자 표적이다. 처음에, 120 × 10 × 5 ㎛의 평균 크기 SMO / cyclopamine 비교적 큰 결정을 수득 한 후 데이터 collecti 사용 하였다싱크로트론 소스에서에 기존의 고니 오 미터 기반의 결정학을 이용하여. 그러나 이들 큰 결정 (2-3도 이상), 아마도 결정 성장 결함의 축적 또는 cryocooling 관련된 영향으로부터 큰 mosaicity 앓고 마이크로 포커스 빔라인 (직경 10 μm의)에서 열악한 회절 제조. LCP-SFX 그러나, 실온에서 5 ㎛의 크기의 크리스탈에서 LCLS 품질의 회절 데이터를 수집 할 수 있었다. 구조는 명확하게 결합 포켓 (6) (도 3)에 cyclopamine의 위치를 식별하는 세 개의 주축을 따라 이방성 3.4, 3.2 및 4.0 Å 해상도에서 분자 여분으로 해결 하였다. μ-아편 유사 수용체 (μ-OR)을 대상으로 모르핀과 같은 알칼로이드 아편은 널리 심한 통증 관리에 사용됩니다. 그러나, 그들의 광범위한 사용은 획득 내성과 중독에 이르게. morphines의 공동 관리δ 오피오이드 수용체 (δ-OR) 길항제에 따라서 혼합 작용제 μ-OR-δ-OR 길항제 및 기능을 갖는 화합물의 탐색을 촉진 상술 부작용을 방지하는 것으로 나타났다. 우리 δ-OR 관능 테트라 펩티드 DIPP-NH 2와 복합체에서 종래 측각기 기반 데이터 수집 전략을 채택 싱크로트론 X- 선 소스에서 3.3까지 회절 cryocooled 결정을 사용하여 초기 회절 데이터를 획득. 이러한 데이터는 펩티드 리간드에 대한 일부 모호한 전자 밀도를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이어서, 실온에서 XFEL 회절 데이터를 획득하고, 구조는 리간드와 수용체 (7)에 대한 명확한 밀도를 나타내는 2.7 Å 해상도에서 측정 하였다. 이 구조는 더 이해 오피오이드 수용체 기능 및 선택의 기회를 제공하고 새로운 진통제의 개발을위한 가치있는 통찰력을 제공. (1 AT R) -1 수용체 GPCR은 혈압의 차 레귤레이터로서 기능한다. 우리는 LCP의 길항제 ZD7155 복잡한 1 R AT 결정화. 최적화 된 결정 싱크로트론 소스에서만 ~ 4에 도달하는 최선의 회절 40 × 4 × 4 ㎛의 (3)의 최대 크기에 도달 하였다. 결정화 조건을 변경함으로써 XFEL 방사선을 사용하여 2.9 Å 해상도에서 실온 구조를 얻기 위해 사용 된 작은 결정의 샤워 (10 × 2 × 2 μm의 3)를 수득. 2764739 검출기 이미지의 총 단백질 (9)의 약 0.29 mg의 대응 크리스탈 - 라덴 LCP의 약 65 μL에서 전체 데이터 집합을 수집 하였다. 프레임의 총 수, 457,275은 73,130 프레임 (명중 16 %)을 성공적으로 인덱싱 된 집적있는 17 %의 히트 레이트에 대응하는, 액정 히트로서 확인되었다. 지PCR들은 G 단백질 또는 arrestins 중 하나에 의해 매개되는 두 가지 경로를 통해 신호. 아레스 복잡한에서 GPCR의 구조가 애매 유지했던 반면 이종삼 S G 단백질에 결합 된 β 2 아드레날린 수용체의 구조는 몇 년 전에 20 해결 하였다. 우리는 최장 치수가 25 내지 30 μm의 도달 LCP의 로돕신 아레스 - 융합 단백질의 작은 결정을 수득하지만, 광범위한 최적화에도 불구하고, 오직 싱크로트론 소스에서 ~ 7 Å 해상도 회절. LCP의-SFX 방법을 사용하여, XFEL의 beamtime의 12 시간 이내에, 우리는 18,874 패턴이 성공적으로 인덱싱 및 3.8 Å / 3.8 Å / 3.3 Å (19)의 해상도 한계를 이방성에 통합 된 중 22,262 크리스탈 안타를 수집. 로돕신 - 아레스는 전통적인 방법을 사용하여 구조 결정에 저항 매우 도전적인 단백질 복합체이다. 이 구조의 성공적인 결정의 거대한 잠재력을 보여 주었다LCP의-SFX의 어려운 문제를 해결하는 방법 및이 된 GPCR에 아레스 바이어스 신호의 메커니즘을 검사 할 수있는 독특한 기회를 제공했다. 마지막으로, 지질 상에 성장 된 단백질 결정 막에 부가하여, 샘플 준비 및 전달 방법이 성공적으로 극적 단백질 소비를 줄일 수 있도록 허락, LCP는 결정의 전달을위한 담체 매질로서 사용되는 가용성 단백질 결정으로하도록 하였다 구조 결정에 필요한. 두 모델 단백질 리소자임 및 피코시 아닌의 구조는 각각의 단백질 21 0.1 밀리그램을 사용하여이 방법으로, 각각 1.89 Å 및 1.75 Å 해상도로 해결되었다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 세로토닌 수용체 (b) </td><td> 평활 수용체 </td><td><strong&gt; δ-오피오이드 수용체 </td><td> 안지오텐신 II 수용체 1 형 </td><td> 로돕신 - 아레스 </td><td> 라이소자임 </td><td> 피코시 아닌 </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> 전체 샘플 사용 * μL </td><td> (100) </td><td> (83) </td><td> (50) </td><td> (65) </td><td> (75) </td><td> (10) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 사용 된 총 단백질, μg의 </td><td> (300) </td><td> (500) </td><td> (300) </td><td> (290) </td><td> (340) </td><td> (100) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> 평균 결정 크기, μm의 </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5 ~ 10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> 타율, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> (17) </td><td> 0.45 </td><td> (40) </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> 총 데이터 수집 시간, 시간 </td><td> (10) </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> (12) </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> 인덱스 패턴의 수 </td><td> 32819 </td><td> 61964 </td><td> 36083 </td><td> 73130 </td><td> 18874 </td><td> 54544 </td><td> 6,629 </td></tr><tr><td> 공간 그룹 </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C (2) </td><td> C (2) </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> 해상도, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3.3 / 3.8 / 3.8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> 표 대표적인 구조물 샘플 준비 및 데이터 수집 통계 1. 개요는 LCP-SFX 방법을 이용하여 해결. LCP-SFX 실험에 필요한 시료의 양을 결정 회절 품질 결정 밀도, 인젝터 노즐의 직경뿐만 아니라 XFEL 빔 크기, 강도 및 펄스 반복 속도에 의존한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> LCP-SFX. 샘플 제조를위한 전형적인 샘플 준비 절차도 1 순서도 기밀 유리 주사기에있는 표적 단백질의 LCP 결정화 시작한다. 결정을 수득 한 후, 결정 LCP 함유 한 주사기로 통합 추가적인 지질으로 적정, absor 할초과 침전제 용액 나. 다음 이전 XFEL 데이터 수집에 대한 다양한 현미경 방법을 사용하여 특징을 결정. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> 도 2의 대표적인 결과의 구조 5-HT 2B 에르고 타민 복잡한한다. (a) 5-HT 2B / 에르고 타민의 미세 결정은 명 시야 현미경을 사용하여 형태 8 군데. 이 그림은 과학에서 저작권 허가 기준 8에서 재사용되고있다. (b)는 미세 5-HT (2B) / 에르고 타민의 교차 편광 현미경 모드 (8)을 사용하여 몇 군데. 이 그림은 저작권과 기준 8에서 재사용 된과학 허가. (c) 상기 LCP-SFX 방법에 의해 얻어진 5-HT 2B / 에르고 타민 구조 만화 표현. 모델에 내장 된 지질은 스틱 표현에 표시됩니다. 리간드는 에르고 타민 분야 표현에 나타낸다. 실선은 대략 막 경계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> 그림 3. 대표 결과, cyclopamine 복잡한에서 SMO의 구조. 왼쪽 패널은 SMO / cyclopamine의 미세 크로스 편광 현미경 모드 6을 사용하여 몇 군데. 이 수치는 자연 커뮤니케이션에서 저작권 허가 기준 6에서 재사용되고있다. 오른쪽 패널, 만화 representati을LCP의-SFX 방법에 의해 얻어진 SMO / cyclopamine 구조에. 리간드는 cyclopamine 분야 표현에 나타낸다. 실선은 대략 막 경계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

X선 자유전자 레이저 및 싱크로트론 소스에서 연속 결정학을 위한 지질 입방상의 막 단백질 미세결정의 준비 및 전달 절차를 설명합니다. 이러한 프로토콜은 또한 용해성 단백질 미세결정의 통합 및 전달에 적용할 수 있으며, 이로 인해 액체 주입에 비해 샘플 소비를 크게 줄일 수 있습니다.

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

이 절차의 전반적인 목적은 방사광 가속기 및 X선 자유 전자 레이저 광원에서의 연속 결정학 데이터 수집을 위해 지질 입방상(lipidic cubic phase) 내 막단백질 결정 샘플을 준비하는 것입니다. 이 방법은 막을 통한 수송 및 신호 전달과 같이 막단백질 구조 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 최소한의 샘플 소모량과 무시할 수 있는 수준의 방사선 손상으로, 상온의 천연 지질 환경에서 막단백질의 구조 결정이 가능하다는 점입니다.지질 입방상(lipidic cubic phase)은 점성이 있는 겔 형태의 물질로, 특수 도구와 사전 경험 없이는 다루기 어렵기 때문에 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 어려움을 겪을 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로, 1번 및 2번 시린지를 사용하여 지질 입방상(LCP) 내에 막 단백질을 재구성하는 것으로 이 절차를 시작하십시오. 투명하고 균질한 LCP가 형성되면, 샘플 전체를 2번 시린지로 옮기십시오.커플러를 2번 주사기에 연결된 상태로 유지하면서 1번 주사기를 분리합니다. 3번 주사기라고 명명된 또 다른 100 µL 청결 주사기에 탈착 가능한 바늘을 연결합니다. 침전제 용액 약 70 µL를 주사기 안으로 흡입합니다.Teflon spherule가 주사기 내부에 있도록 유지한 상태에서 3번 주사기에서 바늘을 분리합니다. 커플러를 통해 2번 주사기와 3번 주사기를 연결하고, 두 주사기 모두에 Teflon spherule이 올바르게 위치해 있는지 확인합니다. 커플러를 조심스럽게 끝까지 돌려 단단히 고정합니다.결합된 주사기들을 수직으로 세우고 2번 주사기를 아래쪽으로 배치한 다음, 2번 주사기에 들어있는 단백질 함유 LCP 샘플을 3번 주사기의 플런저에 LCP 스트링이 닿을 때까지 천천히 일정하게 주입하십시오. 주입되는 LCP 부피는 3번 주사기에 처음에 들어있던 침전제 부피의 약 1/10 정도가 됩니다. 두 주사기의 눈금 읽기 값을 통해 부피를 확인하십시오.그다음, 2번 시린지를 분리합니다. 이제 커플러는 침전제 용액에 담긴 시료가 들어 있는 3번 시린지에만 연결된 상태가 됩니다. 파라필름(Parafilm)을 사용하여 플런저와 시린지의 접합부, 커플러의 개방형 끝단, 그리고 니들 너트를 포함하여 3번 시린지를 완전히 밀봉합니다.이 단계에서 밀봉이 불완전하면 침전제 조건이 변하거나 시료가 탈수될 수 있습니다. 단백질이 함유된 LCP 시료 주입 단계를 반복하여 6개의 추가 시린지에 결정화를 설정하며, 이때 총 약 50 µL의 LCP 시료를 사용합니다. 시료의 탈수를 방지하기 위해 물에 미리 적신 먼지 없는 세척 티슈 1~2장을 함께 넣어 밀봉 가능한 플라스틱 백에 밀봉된 시린지들을 보관하십시오.봉투를 밀봉하고, 결정 성장 동안 주사기를 20°C 배양기에 보관하십시오. 결정 검출을 위해 12~24시간마다 주사기를 배양기에서 꺼내어, 교차 편광 장치가 장착된 실체 현미경 하에서 주사기 내부의 LCP 샘플을 직접 관찰하십시오. 결정은 조밀하게 뭉쳐진 빛나는 입자로 식별하며, 결정 크기가 작은 경우에는 LCP 필라멘트에서 발생하는 균일한 광채로 식별합니다.밀봉된 주사기를 가방에 넣어 20 °C에서 보관하여 추후에 사용하십시오. 지질 적정 단계는 과잉 침전제 용액을 흡수하고 x-ray-free electron laser 빔에 주입 시 지질이 동결되는 것을 방지하기 위해 필요합니다. 데이터 수집 시작 약 1시간 전에 20 °C 인큐베이터에서 샘플이 들어 있는 주사기를 꺼내십시오.유사한 결정 외관과 결정화 조건의 유사성을 바탕으로 시료 통합에 사용할 주사기 2~4개를 선택합니다. 선택한 주사기에서 Parafilm 밀봉을 조심스럽게 제거합니다. 주사기 커플러를 제거하고, 첫 번째로 선택한 주사기에 깨끗한 탈부착식 바늘을 부착합니다.플런저를 천천히 부드럽게 밀어 침전제를 바늘을 통해 마이크로원심분리 튜브 속으로 짜냅니다. 이 단계에서 주의가 필요합니다. 플런저에 강한 압력을 가하면 침전제 용액과 함께 결정이 포함된 LCP의 일부가 배출되어 샘플의 일부 또는 전체가 손실될 수 있기 때문입니다. 침전제의 대부분이 제거되고 LCP가 바늘 입구에 모이면 플런저를 멈춥니다.선택한 다른 주사기들에 대해서도 이 과정을 수행하십시오. 결과로 얻은 LCP 샘플들을 통합하려면, 깨끗한 커플러를 통해 두 주사기를 서로 연결하십시오. 한쪽 주사기의 플런저를 눌러 한 주사기의 샘플 전체를 다른 주사기로 옮기십시오.빈 시린지를 분리합니다. 이 단계를 반복하여 결정이 포함된 모든 LCP 물질을 하나의 시린지에 모읍니다. 침전제를 가능한 한 많이 제거하십시오.약 5 µL의 7.9 MAG 또는 원래의 짧은 사슬 MAG 호스트 지질을 빈 시린지에 넣습니다. 이 시린지를 시린지 커플러를 통해 통합 샘플이 들어 있는 시린지에 연결하고, 시린지 플런저를 교대로 눌러 혼합합니다. 잔류 용액이 모두 흡수되고 균질하며 투명한 LCP가 형성될 때까지 이 과정을 반복합니다.혼합된 LCP 샘플 전체를 하나의 주사기로 옮기고, 빈 주사기는 분리합니다. 통합된 샘플이 담긴 주사기에 LCP 인젝터 로딩 바늘을 부착합니다. 약 1 µL의 LCP 샘플을 유리 슬라이드 위에 조심스럽게 분사하고, 유리 커버 슬립으로 덮습니다.커버 슬립을 가볍게 눌러 샘플을 고정합니다. 명시야 조명과 직교 편광판을 사용하여 실체 현미경의 최대 배율에서 LCP 샘플의 이미지를 촬영합니다. 가능하다면 UV 형광 현미경과 이미저를 사용하여 추가 이미지를 촬영함으로써 샘플 내에 단백질 미세 결정이 존재하는지 확인합니다.결정의 크기와 밀도를 추정합니다. 데이터 수집 실험을 위한 이상적인 결정 밀도는 결정의 크기, X-선 빔의 직경, LCP 스트림의 직경에 따라 달라지며, 결정 히트율(hit rate)이 약 10에서 40%가 되도록 설정해야 합니다. 마지막으로, LCP 인젝터를 충전하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 LCP 직렬 펨토초 결정학 또는 LCP SFX 데이터 수집을 수행합니다. 여기에는 명시야 현미경 모드와 직교 편광 현미경 모드로 촬영한 ergometrine과 복합체를 이룬 세로토닌 수용체 마이크로결정이 표시되어 있습니다.세로토닌 수용체 에르고타민 복합체의 구조는 LCP SFX 방식으로 얻었습니다. 여기에는 교차 편광 현미경 모드를 사용하여 촬영한 사이클로파민과 복합체를 이룬 스무던트 수용체의 미세 결정이 나타나 있습니다. 수용체 사이클로파민 복합체의 구조는 LCP SFX 방식으로 얻었습니다.이 절차를 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 막 단백질 표적의 구조에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 약간의 수정을 통해 다른 단백질에도 적용할 수 있습니다. 이 기술의 활용 범위는 약물 발견까지 확장되는데, 고해상도 구조는 표준 리그난 단백질 상호작용의 우수한 템플릿을 제공하여 더 효율적인 약물을 설계하는 데 도움을 주기 때문입니다.

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

본는 lipidic mesophases 수동으로 막 단백질의 결정화 실험을 설정 캐퍼리 막 구조 및 기능 생물학 그룹의 구현 절차를 설명합니다.

Lipidic Mesophases를 사용하여 구조 결정을위한 막 단백질 Crystallizing

프로토콜은 LCP 결정화 시련과 수확 결정을 설정, LCP - FRAP 미리 결정화 assays과 초기 조건을 찾는 lipidic 입방 단계 (LCP)에서 단백질의 reconstitution부터 막 단백질의 회절 품질 결정을 얻기 위해 필수적인 단계를 설명 .

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

β-barrel 외막 단백질(OMP)은 그람 음성 박테리아, 미토콘드리아 및 엽록체의 외막 내에서 많은 기능을 수행합니다. 여기에서 우리는 X선 결정학 또는 NMR 분광법에 의한 구조 결정을 위해 충분한 양의 β배럴 OMP를 생산하기 위한 프로토콜을 제시하여 구조 연구에서 알려진 병목 현상을 완화하기를 희망합니다.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

단백질 미세 결정을 사용하는 X 선 결정학을위한 프로토콜이 제시됩니다. 정제 후 또는 cellulo에서 미세 -grown 생체 분석 두 예가 비교된다.

단백질 결정의 미세 결정학 및<em&gt; 셀룰로에서</em&gt; 회절

여기 선물이 단백질 microcrystals의 제어 생산을 위한 프로토콜. 프로세스의 여러 결정 화 매개 변수 제어 조작 수 있도록 자동화 된 장치를 사용 합니다. 단백질 결정 화는 수행-아웃 모니터링 및 결정 화 방울 입자의 반경 분포를 조사 하는 동안 결정 화 솔루션의 제어 및 자동화 된 추가 의해.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

시간이 해결 직렬 펨 결정학 실험의 성공 효율적인 샘플에 따라 달라 집니다. 여기, 우리는 프로토콜 최적화 높은 점도 마이크로 압출 인젝터에서 bacteriorhodopsin microcrystals의 입체 면을 설명 합니다. 방법론은 소설 3 방향 커플러와 샘플 균질 및 고속 카메라와 시각화에 의존합니다.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

이 프로토콜의 목표는 최근 호주 싱크로트론에서 의뢰한 고점성 인젝터 인Lipidico에서 데이터 수집을 위한 직렬 결정예학 샘플을 준비하는 방법을 시연하는 것입니다.

오스트레일리아 싱크로트론의 직렬 결정학 측정을 위한 지질 주입 프로토콜

이 기사의 목적은 시청자에게 대규모 단일 단백질 결정을 성장시키기 위한 소량의 증기 확산 프로토콜을 직렬 결정학을 위한 대용량 배치 미세 결정화 방법으로 변환하는 방법에 대한 확실한 이해를 제공하는 것입니다.

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

제시된 프로토콜은 96웰 고처리량 투석 플레이트를 사용하여 단백질 결정화 조건 및 결정 성장을 스크리닝하기 위한 간단한 접근 방식을 설명합니다. 미세 결정의 대규모 성장을 위한 투석기 튜브의 사용은 직렬 결정학 및 MicroED 응용 분야에서도 입증됩니다.

Microdialysis를 통한 High-Throughput Protein Crystallization

이 프로토콜은 스테롤 수송체 ABCG5/G8의 결정화를 위한 설정을 설명합니다. ABCG5/G8은 행잉 드롭 결정화를 위해 이셀로 재구성됩니다. 이 프로토콜은 특수 재료나 기질이 필요하지 않으므로 X선 결정학을 통해 단백질 구조를 결정하기 위한 모든 실험실에서 쉽게 접근할 수 있고 적용할 수 있습니다.

X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

배우세요 지질 큐빅 상에서 막 단백질 미세결정을 준비하고 직렬 펨토초 결정학에 적용하는 방법을. 이 기술은 실온에서 최소한의 시료 소비와 방사선 손상 없이 구조를 결정할 수 있습니다.

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

더 많은 동영상 탐색