Name: 높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 학습하세요 고처리량 크라이오히스톨로지 플랫폼을 사용하여 광물 조직의 다중 형광 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 골격근계 생물학자들에게 관찰자 독립적이고 비용 효율적인 디지털 조직학 분석을 제공합니다.

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저자는 NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 및 T90-DE021989의 자금 출처를 인정합니다.

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<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에서 우리는 공동 현지화 및 단일 섹션에 염색 / 영상의 여러 라운드에서 이미지를 정렬하여 여러 가지 생물학적 조치를 정량화하기위한 세부 cryohistology 프로토콜을 제시 하였다. 이 섹션 조직에 어려운 형태 (예를 들어, 광물 뼈와 연골을) 유지로 cryotape을 사용하여 설명하는 방법은 특히 유용합니다. 또한, 단면 조직은 동일한 부의 염색 / 영상 여러 발사를 허용 유리 슬라이드에 단단히 부착되고; 시리얼 섹션은 각각의 다른 프로토콜로 염색하는 전통적인 방법과는 달리. , 섹션 사이의 공동 현지화 신호에 스테인드 여러 라운드로 이미지화 된 하나의 섹션이 문제가되지 않습니다 뭔가를 시도 할 때 문제를 제기 할 수 있습니다 시리얼 섹션을 사용. 시장 최초의 테이프 - 안정화 된 조직 절편 생성물 테이프 이송 시스템 (16), (17)이다.이 코팅 된 플라스틱 테이프를 사용티슈 cryoblock의 표면 상에 배치 된 저온 접착제...

생물학적 연구는 종종 자주 조직 학적 분석 1-3 일종의와 관련된 효율적인 표현형가 필요합니다. 이 필요 마우스 게놈 4 각 유전자를 방해 더욱 분명 야심 찬 프로젝트가있다. 이러한 조직 학적 분석은 개별 세포에 특정 유전자 또는 단백질의 매핑 표현 세포 형태 및 / 또는 해부학 적 특징을 평가에 이르기까지 다양 할 수 있습니다. 사실, 유전체 분야에 조직학의 기본적인 기여 중 하나가 특정 영역 또는 세포 유형으로 특정 분자 신호를 연결하는 기능이다. 특히 근골격계 조직에 대한 조직 검사의 전통적인 방법은 종종 시간이 많이 걸리고 힘들고, 때로는 해결하기 위해 주를 필요로하고, 석회, 섹션, 얼룩 및 이미지 시편은 인간의 해석을 통해 이미지를 분석 할 수 있습니다. 시츄 hybridizat의 여부 면역 통해 여러 분자 신호를 분석이온, 또는 특수 얼룩, 적절하게 수행하기 위해 여러 섹션, 심지어 여러 표본을 필요로한다. 또한, 이러한 복수 응​​답은 주어진 시료 내 특정 지역에 공동 지역화 할 수 없습니다 때로는 동일한 셀에 공동 지역화 할 수 없습니다. 게놈과 후성 유전체 매핑 센터, 후성 유전체학 분야는 디지털 시대로 이동함에 따라, 조직 학적 필드는 효율적이고 높은 처리량, 단일 조직 학적 섹션 내 분자 신호의 다양한 자동화 된 분석을 제공하기 위해 소송을 수행해야합니다. 실제로, 소정의 시험편의 특정 셀에 다수의 분자 신호들을 연결할 수 향상 조직학 기술에 대한 필요성이 대두되고있다. 최근에, 우리는 광물 조직 5-14에서 주어진 섹션 내에서 여러 가지 대응 방안을 평가하기위한 새로운 높은 처리량 cryohistological 방법을 발표했다. 방법은 현미경 슬라이드에 견고하게 접착 테이프 부 냉동 cryotape로 동결 절단 (Cryosections) 안정화 포함하며각 섹션에 염색 및 이미징의 여러 라운드를 실시. 이미지의 이러한 라운드는 수동 또는 이미지 분석하기 전에 컴퓨터 자동화 (그림 1)을 통해 정렬됩니다. 여기, 우리는이 과정에 대한 자세한 프로토콜을 제시하고 이러한 기술은 서로 다른 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 향상 예를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. 유독. 4% 파라포름알데히드로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S9378</td><td>여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>P5368</td><td>여러 공급업체 사용 가능.</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>조직에 따라 다양한 크기를 사용할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>다른 cryomatrices로 대체할 수 있습니다. 그러나 PVA/PEG 기반 수지는 우리 손에 가장 잘 맞았습니다.</td></tr><tr><td>2-메틸-부탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>M32631</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>는 다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>시편 디스크</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>저온 유지 장치 블레이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>크라이오테이프</td><td>섹션 연구실</td><td>크라이오필름 2C</td><td></td></tr><tr><td>롤러</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62800-46</td><td>다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 현미경 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71890-01</td><td>다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td>은 <td>다른 브랜드/모델로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td>Norland Optical</td><td>Norland Optical Adhesive, 61</td><td></td></tr><tr><td>UV Black Light</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>키토산</td><td>시그마 알드리치</td><td>C3646</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>InSpeck 적색 마이크로스코퍼,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr>, <tr><td>InSpeck 녹색 마이크로스피어,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr>, <tr><td>Calcein Blue</td><td>, Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>여러 공급업체 이용 가능.</td></tr><tr><td>칼세인</td><td>시그마 알드리치</td><td>C0875&nbsp;</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>알리자린 컴플렉스톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>A3882&nbsp;</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>데메클로사이클린</td><td>시그마 알드리치</td><td>D6140&nbsp;</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G5516</td><td>여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ELF 97 황색 형광 산 인산가수분해효소 기질</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>여러 공급업체 사용 가능. Hoechst 33342 또는 다른 핵 염료로 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 핵 대조염색)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>여러 공급업체 이용 가능.</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 무수</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td>여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>나트륨 주석산염 이염기성 이수화물&nbsp;</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T6521</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>아질산나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S2252</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MgCl2 육수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>M9272</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7653</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>빠른 빨강 TR 소금</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F8764</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다. Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>N4875</td><td>여러 공급업체 사용 가능.</td></tr><tr><td>N, N 디메틸 포름 아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>D158550</td><td>여러 공급 업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Toluidine 블루 O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T3260</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td>, <td>Carl Zeiss AG</td>, <td>Axio Scan.Z1</td><td>다른 선형 또는 타일 스캐너도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>DAPI 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49000</td><td></td></tr><tr><td>CFP 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>GFP 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>YFP 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>커스텀 옐로우(ELF 97) 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>관습; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 필터 세트</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane 테이프 전사 시스템</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62800-10</td><td>여러 공급업체 사용 가능.</td></tr><tr><td>CryoJane 테이프 Windows</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62800-72</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CryoJane 접착제 슬라이드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>62800-4X</td><td>여러 공급업체를 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 cryohistology

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

다양한 조직의 효율적인 표현형 분석 및 조직 병리학에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 이러한 표현형 분석의 필요성은 마우스 게놈의 모든 유전자를 파괴하려는 야심 찬 프로젝트에서 분명합니다. 연구 커뮤니티는 조직학을 통해 조직을 표현형화할 수 있는 빠르고 저렴한 수단이 필요합니다. 골격 조직의 조직학적 분석은 시간이 많이 걸리고 기껏해야 반(半)정량적일 수 있으며, 훈련된 개인의 슬라이드에 대한 주관적인 해석이 정기적으로 필요합니다. 여기에서는 광물화된 조직의 효율적이고 저렴한 표현형을 위한 극저온 조직학적 패러다임을 제시합니다. 먼저, 광물화된 조직의 형태를 보존하는 테이프 안정화 동결 절편의 새로운 방법을 제시합니다. 그런 다음 이러한 섹션을 유리 슬라이드에 단단히 부착하고 여러 차례의 염색을 통해 반복적으로 이미지화합니다. 그런 다음 결과 이미지는 수동으로 또는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 정렬되어 여러 계층의 이미지 합성 스택을 생성합니다. 이 프로토콜은 주어진 섹션 내의 특정 세포에 대한 수많은 분자 신호의 공동 국소화를 가능하게 합니다. 또한 이러한 형광 신호는 컴퓨터 소프트웨어를 통해 객관적으로 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 광물화된 조직의 조직학과 관련된 많은 단점을 극복하고 앞으로 나아가는 근골격계 조직의 고처리량, 고함량 표현형 분석을 위한 플랫폼 역할을 할 수 있습니다.

높은 처리량, 멀티 이미지 Cryohistology을위한 일반 워크 플로 그림 1은이 기술에 사용되는 일반적인 작업을 나타냅니다. 이 영상 마지막 이미지 정렬 / 분석의 여러 라운드를 통해 고정에서 여러 단계를 포함한다. 일주일이 샘플의이 유형을 석회하는 데 걸리는 시간보다 적은 시간 영상 4 라운드를 통해 샘플 고정에서 이동으로이 과정은 조금 걸릴 수 있습니다. 촬상의 순서는 통상적으로 시편 이미 (등 예 GFPs, 광물 라벨) 후 형광 효소 활성 분석 하였다 다중화 형광 면역 (예., TRAP, AP 등) 인 내인성 신호로 시작 최종적으로 세포주기 분석 시험 법 (예를 들면, EDU) 및 발색 얼룩 완료 (예를...

이 원고에서는 광물화된 조직의 동결된 절편에 대한 여러 차례의 형광 이미징에서 여러 차례의 반응 측정의 정렬된 복합 이미지를 생성하기 위해 고처리량 반자동 극저온 조직학 플랫폼을 제시합니다.

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

이 기술의 목적은 근골격계 생물학자들에게 비용 효율적이고 유의미하며, 고처리량의 관찰자 독립적인 완전 디지털 방식으로 복잡한 모델 시스템을 통합하는 조직학적 도구를 제공하는 것입니다. 조직학은 대부분의 생물학 연구자에게 매우 중요하지만, 흔히 노동 집약적이며 비정량적인 특성이 있습니다. 따라서 효율적이고 고처리량이며 자동화된 분석을 제공하는 조직학적 기술이 필요합니다.당사의 cryohistology 플랫폼을 통해 연구자는 동일한 슬라이드를 고처리량 방식으로 여러 번 이미징하고 염색함으로써, 주어진 표본 내의 특정 세포와 여러 개의 molecro 신호를 연관지을 수 있습니다. 이 절차의 시연은 제 실험실의 연구 보조원이며 이러한 기술의 개발과 실행을 선도한 Xi Jiang 박사와 Li Chen이 맡게 됩니다. 이 절차를 시작하려면, 포르말린에서 표본을 꺼내어 과도한 조직을 절제하고, 1x PBS로 제조한 30% sucrose로 옮기십시오.검체를 sucrose에 넣고 4°C에서 12~24시간 동안 배양합니다. 다음으로, cryomold에 cryoembedding medium을 채우고 검체를 몰드 안에 넣습니다. 그 후, 관심 영역의 절단면이 몰드 바닥과 평행하도록 몰드 내 샘플의 방향을 맞춥니다.그 후, 크라이오몰드(cryomold)를 드라이아이스 위에 올려놓아 동결매질의 얇은 층이 얼 때까지 기다려 시편을 고정합니다. 그다음, 크라이오몰드를 드라이아이스 펠렛 위에 유지한 상태로 크라이오몰드의 나머지 공간을 동결매질로 채웁니다. 이어서, 드라이아이스로 미리 냉각시킨 2-methylbutane이 담긴 용기에 크라이오몰드를 넣습니다.검체가 완전히 동결되면, 크라이오몰드(cryomold)를 제거하고 과잉의 2-methylbutane을 털어냅니다. 크라이오몰드를 셀로판으로 감싸 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관합니다. 본 절차에서는 검체 블록을 냉동고에서 -20 °C 내지 -25 °C로 설정된 크라이오스탯(cryostat)으로 옮깁니다.다음으로, 크라이오몰드(cryomold)에서 블록을 꺼내고 면도날을 사용하여 과도한 동결 매립액(cryoembedding medium)을 다듬어 제거합니다. 그런 다음, 시편 디스크 위에 동결 매립액을 약간 추가하고, 시편 디스크의 표면이 블록의 바닥면과 평행하도록 블록을 정렬합니다. 동결 매립액이 얼 때까지 기다립니다.그 후, 시편 디스크를 시편 헤드 위에 놓고 칼날이 시편 블록의 표면과 평행하게 절단되도록 헤드를 조정합니다. 다음으로, 관심 영역을 덮을 수 있는 크라이오테이프(cryotape) 조각을 잘라 크라이오스탯 내에서 미리 냉각시킵니다. 그 후, 필요에 따라 계속 조정하면서 관심 영역 내의 높이까지 블록을 다듬습니다.관심 영역에 도달하여 절편 제작이 가능해지면, 블록 표면의 모든 칩을 브러시로 제거합니다. 다음으로, 접착제가 없는 은금색 탭 부분을 잡고 크라이오테이프(cryotape)에서 비접착성 뒷면지를 제거합니다. 그런 다음 접착면이 아래로 향하게 하여 테이프를 블록 위에 부착합니다.롤러를 사용하여 크라이오테이프(cryotape)에 압력을 가하고, 크라이오스탯(cryostat)의 자동 모터 또는 수동 절단 휠을 사용하여 섹션을 제작합니다. 그 후, 크라이오스탯 내에서 플라스틱 현미경 슬라이드 위에 조직 면이 위로 향하도록 섹션을 배치합니다. 플라스틱 슬라이드를 크라이오스탯에서 꺼내어 동결 매립 매질(cryoembedding medium)을 녹임으로써 섹션이 슬라이드 표면에 부착되도록 합니다.연속 절편이나 다른 관심 영역에 대해 절편 제작 과정을 반복합니다. 완료되면 절편을 슬라이드 박스에 넣고, 필요한 보관 기간과 후속 반응 측정 항목에 따라 4, -20 또는 -80 °C에서 보관하십시오. UV 경화 접착제 방법을 수행하려면 먼저 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다.UV 활성 광학 접착제를 유리 슬라이드 두 장에 한 방울씩 도포하고, 슬라이드 모서리를 사용하여 유리 슬라이드 표면 전체에 접착제를 얇게 펴 바릅니다. 그런 다음, 은금 탭(silver gold tab)을 잘라내고 테이핑된 조직 단면의 조직 쪽이 위를 향하도록 하여 첫 번째 슬라이드의 접착층 위에 놓습니다. 테이프 아래에 기포가 생기는 것을 최소화하기 위해, 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 굴리듯 단면을 부착합니다.그 후, 첫 번째 슬라이드에서 테이프로 고정한 섹션을 제거하여 두 번째 슬라이드의 접착층 위에 놓으며, 이때 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 각 슬라이드에 해당 실험에 필요한 적정 수의 섹션을 배치한 후, 주변 영역의 과잉 접착제를 닦아냅니다. 다음으로, 테이프 아래에 기포나 섬유가 있는지 섹션을 면밀히 검사합니다.그런 다음 접착층을 가교시키기 위해 현미경 슬라이드를 UV 블랙라이트 아래에 5~10분 동안 둡니다. 이 단계에서 녹색 마이크로스피어 50 µL와 적색 마이크로스피어 50 µL를 물 100 µL에 녹여 기준 마커 용액을 준비합니다. 이 용액은 4 °C의 암소에 보관하십시오.그 다음 피펫 팁을 마이크로스피어 용액에 담그고, 관심 영역에 인접한 각 섹션에 마이크로스피어 용액을 살짝 찍어 바릅니다. 이어서 슬라이드를 실온에서 건조시키고, 당일에 슬라이드를 처리하는 경우 호일로 덮어 30분 동안 빛으로부터 보호합니다. 그렇지 않은 경우, 슬라이드를 4°C의 슬라이드 보관함에 넣습니다.절편 염색 후, acquiesce 마운팅 매질을 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 덮습니다. 이미징을 수행하려면 슬라이드를 현미경 트레이에 적재하고, 트레이를 슬라이드 스캐닝 현미경의 트레이 스택에 삽입합니다. 그런 다음, 현미경 소프트웨어의 프로필 목록을 클릭하여 각 형광체에 적절한 노출 시간이 설정된 슬라이드별 프로필을 로드합니다.Start Preview Scan 버튼을 클릭하여 각 슬라이드의 프리뷰 이미지를 캡처합니다. 소프트웨어는 슬라이드 라벨에 부착된 바코드를 읽어 파일 이름을 자동으로 지정합니다. 또는 각 슬라이드에 파일 이름을 수동으로 할당할 수 있습니다.조직 검출 마법사(tissue detection wizard)에 접속하여 그리기 도구를 사용해 각 관심 영역을 지정하고, 필요한 조정을 거친 후 이후의 이미징 라운드를 위해 저장하여 관심 영역을 설정하십시오. 각 슬라이드의 설정이 완료되면 Start Scan 버튼을 클릭하여 스캔 프로세스를 시작하십시오. 각 이미징 라운드가 끝난 후, 다음 염색 단계 이전에 커버슬립이 슬라이드에서 떨어질 때까지 1x PBS가 채워진 코플린 자(coplin jar)에 슬라이드를 담그십시오.모든 이미징 라운드가 완료되면, 이미지 조립 및 분석을 위해 각 개별 채널의 이미지를 TIF 또는 JPG 파일로 내보냅니다. 이 그림에서는 3개월 된 마우스 대퇴골 섹션을 calcein blue로 염색하였으며, 첫 번째 이미징 라운드에서 흰색으로 나타나는 누적 광물과 녹색 및 적색으로 나타나는 광물화 표지를 이미징했습니다. 이후 슬라이드를 두 번째 라운드에서는 노란색으로 나타나는 trap 활성으로, 세 번째 이미징 라운드에서는 적색으로 나타나는 AP 활성으로 이미징했습니다.마지막으로, 네 번째 라운드에서 슬라이드를 toluidine blue로 염색하였습니다. 발색 라운드를 포함한 모든 이미징 라운드 동안 기준 마커를 촬영하였으며, 커스텀 소프트웨어를 사용하여 이를 정렬하였습니다. 이 기술을 숙달하면 일반적인 시료를 탈석회화하는 데 걸리는 시간보다 더 짧은 시간 내에 완료할 수 있습니다.본 영상을 시청하신 후, 여러분은 고품질의 무기질화 조직 고함량 이미지를 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것이며, 저희는 이 방법이 근골격계 연구 커뮤니티에서 보다 폭넓게 활용되기를 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

골수의 조직학적 데이터를 정량적으로 분석하는 전략을 제시합니다. 조직 절편에서 형광 표지된 세포에 대한 컨포칼 현미경 검사는 자동으로 분석되는 2차원 이미지를 생성합니다. 다양한 세포 유형의 공동 국소화 분석을 시뮬레이션된 이미지의 데이터와 비교하여 세포 상호 작용에 대한 정량적 정보를 제공합니다.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

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이 프로토콜 이미징 나노 해상도 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 조직에서 특정 셀을 대상. 가벼운 현미경 목표를 식별 하 고는 SEM.에서 계층적 방식으로 다 수 생물학 물자 수 지 포함에서 직렬 섹션의 처음 몇...

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여기에 우리가 두 개의 샘플 처리 기술, 냉동 고압을 결합에 대 한 프로토콜을 현재 그리고 전자 레인지를 이용한 샘플 처리, 집중 된 이온 빔 스캐닝 전자 현미경 (SEM 거짓말)와 데이터 획득에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지. 이 마우스 tibial 신경 샘플와 꼬마 선 충을 사용 하 여 보여 줍니다.

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이 방법은 R26R-Confetti (Confetti) 마우스 모델을 사용하여 광물화된 조직을 연구하고 번식 전략에서 이미지 획득에 이르는 모든 단계를 포괄하는 방법을 설명합니다. 모든 연조직에 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜과 광물화된 조직에 적용될 수 있는 변형된 프로토콜이 포함된다.

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우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

이 프로토콜은 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 인간의 심장에서 얻은 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 제공합니다.

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IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

이 프로토콜에는 석회화된 혈관 표본에 대한 단계별 워크플로우가 포함되어 있습니다: 조직 취급, 탈석화, RNA 검증, 석회화 수준 검출, 그리고 Nanostring GeoMx 디지털 공간 프로파일러(DSP)에서의 관심 영역 선택 전략. 목표는 신뢰할 수 있는 공간 전사체 분석을 위해 혈관 조직 형태와 RNA를 보존하는 포괄적인 방법을 제시하는 것입니다.

디지털 공간 프로파일링을 위한 보존된 형태와 RNA를 이용한 석회화된 동맥 준비 및 처리

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

학습하세요 고처리량 크라이오히스톨로지 플랫폼을 사용하여 광물 조직의 다중 형광 이미징을 수행하는 방법을. 이 기술은 골격근계 생물학자들에게 관찰자 독립적이고 비용 효율적인 디지털 조직학 분석을 제공합니다.

높은 처리량, 광물 조직의 멀티 이미지 Cryohistology

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