Name: 의 pH에 의존 활동의 검출 대장균 보호자 HdeB 체외 및 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 대장균 HdeB의 pH 의존적 활성을 생체 내외에서 특성화하는 방법을. 산성 조건에서 단백질 보호 메커니즘을 연구하고 세균 생존 전략을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리는 보호자의 분석에 그녀의 도움이 조언 박사 클라우디아 Cremers 감사합니다. 켄 완은 HdeB 정화에 자신의 기술 지원을 인정 받고 있습니다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에서 제공하는 박사 연구 친교에 의해 지원됩니다 (JCAB에) 하워드 휴즈 의학 연구소 JCAB 및 UJJ-UD에 보건 부여 RO1 GM102829 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 발현 및 주변 세포질 HdeB의 정제 참고 : HdeB는 E. 표현했다 폴리 믹신 용해시의 페리 플라 즘에서 플라스미드 pTrc- hdeB 10 및 정제를 보유하는 대장균 세포. <ol><li> E.의 야간 문화를 준비 200 μg의 / ㎖의 앰피 실린 (LB 앰프)를 포함하는 30 ml의 LB에 플라스미드 pTrc- hdeB (10)를 숨겨 대장균 세포. 0.7 OD를 600 ㎚에 도달 할 때까지 LB 앰프 네 1 L 배양 물을 접종하고 37 ℃에서 성장을 200 RPM. 그리고, HdeB의 발현을 유도하고, 30 ℃로 성장 온도를 감소 300 μM IPTG를 추가한다. </li><li> 30 ℃에서의 단백질 발현을 5 시간 후에는 4 ° C에서 5 분 동안 8000 × g으로 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 8,000 XG에서 세포를 다시 A (50 mM 트리스 / 염산, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)와 원심 분리기 버퍼 100 ㎖로 세포 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 그 후,에 resuspend80 세포 펠렛은 용액 1 ㎎ / ㎖ 폴리 믹신 설페이트를 함유하는 버퍼. 외막의 효율적인 붕괴를 들어, 부드럽게 4 ° C에서 1 시간 동안 정지를 저어. </li><li> 세포질 분획 및 세포 파편을 제거하려면, 4 ℃에서 15,000 XG에서 20 분 동안 현탁액을 원심 분리기. 이 ~에 용해 HdeB를 포함하는 60 ml의 상층 액을 발생합니다. </li><li> 6 kDa의 MW 갖는 투석막을 이용하여 버퍼 B (20 mM 트리스 / 염산, 0.5 mM의 EDTA, pH를 8.0)의 150 배 부피에 대해 밤새 주변 세포질 추출물을 함유하는 상청액을 투석 차단한다. 3 kDa의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 15 ml의 단백질을 농축시킨다. 0.2 ㎛의 기공 필터를 사용하여 단백질 용액을 필터. </li><li> 2.5 ㎖ / 분의 유속으로 5 컬럼 부피의 완충액 B로 평형화 한 음이온 교환 크로마토 그래피 컬럼 (컬럼 부피 5 ㎖)에 단백질을 적용한다. 단백질이 컬럼에로드되면, 10 분에 대한 버퍼 B와 열을 씻어/ 분으로 2.5 ㎖의 유속. 2.5 ㎖ / 분 (6)의 유량을 50 분의 시간주기 동안 버퍼 B에서 0.5 M 염화나트륨 0 내지 선형 구배로 용출 HdeB. </li><li> 15 % SDS-PAGE를 사용하여 HdeB을 포함하는 분획을 확인합니다. 5 ㎕의 5 배 감소 SDS 로딩 버퍼 20 μl의 샘플을 섞는다. 로드 (10) 젤 위에 μL 및 트리스 - 글리신 버퍼 (14.4 g / L의 글리신, 2.9 g / L 트리스 1 g / L 황산 도데 실 나트륨, 산도 8.3)에서 실행됩니다. 브로 모 페놀 밴드가 젤 (~ 45 분)의 바닥에 가까운 마이그레이션 할 때까지 150 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 풀 모든 HdeB 함유 분획 4 L HdeB 저장 완충액에 대하여 밤새도록 4 ℃에서 투석 (50mM 트리스 / 염산, 200 mM의 염화나트륨, pH를 8.0), 및 분자량 원심 필터 유닛을 이용하여 약 300 μM로 단백질을 농축 컷 - 오프 3 kDa의의를. 흡광 계수 ε = 280 ㎚에서 15,595 M을 사용하여 280 nm에서 HdeB의 농도를 결정 -1 cm -1. 100 ㎕를 분취 및 플래시없는 준비액체 질소의 분취 량을 &#39;제. 주 : HdeB 적어도 6 개월 -70 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. 보호자 활동 분석 말 레이트 탈수소 효소를 펼쳐 열적으로 사용 (MDH) 주 : 열 상이한 pH 값에서 돼지 미토콘드리아 말산 탈수소 효소 (MDH)를 전개의 응집 그래피 HdeB의 영향을 아래와 같이 조사 하였다. 나열된 모든 단백질 농도는 단량체 농도를 참조하십시오. <ol><li> MDH를 제조 밤새 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대하여 4 ℃에서 MDH을 투석 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 100 μM로 단백질을 농축 kDa의. 참고 : MDH는 황산 암모늄 용액으로 전달 될 때 MDH의주의 투석이 필요합니다. </li><li> 집계를 제거하려면, 4 ℃에서 20,000 XG에서 20 분 동안 단백질을 원심 분리기. ε &lt;(280 nm에서 흡광도 MDH 농도를 측정서브&gt; 280 나노 미터 = 7950 M -1 cm -1). MDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 온도 조절 샘플 홀더 및 교반기가 장착 된 형광 분광 광도계에 1 ml의 석영 큐벳을 놓습니다. 설정 λ 전 / EM 350 nm이다. </li><li> 큐벳과 세트 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에 미리 예열 (43 ° C) 버퍼 D (150 mM의 인산 칼륨, 150 mM의 염화나트륨)의 적절한 볼륨을 추가 43 ° C에 큐벳 홀더의 온도. 총 부피는 1000 μL이다. </li><li> 0.5 μM의 MDH 첨가 한 후 상기 버퍼 12.5 μM HdeB (또는 대안 적으로, 버퍼 컨트롤 HdeB 저장 버퍼의 동일 부피)을 추가한다. 광산란 모니터링을 시작. MDH의 전개 충분한 수 있도록 360 초 동안 반응을 품어. </li><li> HPO 4 2 M 버퍼링 K 2의 0.16-0.34 볼륨을 추가하여 7 pH를 올리고 다시 계속또 다른 440 초 동안 광 산란 등에 이용. </li><li> 중화 이후 소정 시점에서 샤페론의 부재에 기록된다 MDH 응집의 정도를 100 %로 설정 (여기서는 MDH의 최대 광산란 관찰 하였다 500 초 후). 각각 나타낸 pH 값에서 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 HdeB의 활성을 정상화. </li></ol> 분석 초 원심 분리에 의해 HdeB-LDH 복합체 형성 3. 검출 (AUC) 주 : HdeB 단독으로 또는 열적 젖산 탈수소 효소 (LDH)를 전개로 복잡 침강 속도 실험 분석 초 원심 분리기를 사용하여 수행 하였다. <ol><li> 4 L의 완충액 C (50mM의 인산 칼륨, 50 mM의 염화나트륨, pH를 7.5)에 대해 밤새 39 ° C에서 LDH를 투석, LDH을 제조 30의 분자량 컷오프 원심 필터 유닛을 이용하여 약 200 μM로 단백질을 집중 kDa의. 참고 : LDH의주의 투석이 LD로 필요H는 황산 암모늄 용액으로 전달된다. </li><li> 4 ° C에서 20,000 XG에 20 분 동안 집계, 원심 분리기 LDH를 제거합니다. 280 nm에서 흡광도 LDH 농도를 측정 (280 nm의 ε = 43,680 M -1 cm-1). LDH의 50 μl의 분취 량을 준비하고 저장을 위해 분취 량을 플래시 동결. </li><li> 41 ° C에서 15 분 동안 버퍼 D에 30 μM의 HdeB의 유무 (각각의 pH 4, 7)에서 3 μM의 LDH을 품어. 참고 : 완전한 집계에 높은 온도 결과에서 LDH의 배양 및 HdeB없이 보호자 효과를 관찰 할 수있다. </li><li> 샘플을 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 그런 다음, 표준 분야를 포함하는 세포로로드 샘플은 1.2 cm 경로 길이와 2 채널 중앙 장식품을 형성. 초원 심 분리기에 세포를로드 전에 침전 적어도 1 시간 동안 22 ° C 평형. </li><li> 스핀 22 ° C에서 샘플을 12 시간 동안 각각의 로터에서 167,000 XG, 그리고 나오지도를 모니터링계속해서 280 nm에서의 단백질 imentation. 이미 증명 된 바와 같이 각 채널의 투과광 강도보다 오히려 흡광도를 측정 할 때, 신호 대 잡음비가 향상된다. 이는 또한 후속 데이터 피팅의 품질을 향상시킨다. </li><li> 연속 C (S) 배포 모델 (17)을 사용 SEDFIT (버전 15.01b 2015 12월)으로 데이터 분석을 수행. 방법 SEDFIT를 사용하는 설명하는 튜토리얼 참조 (18)에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 0.7에 ME (최대 엔트로피) 정규화에 대한 신뢰 수준을 설정합니다. </li></ol></li><li> SEDNTERP 19 사용하여 버퍼 밀도뿐만 아니라 점도를 계산합니다. 집계 클라이언트 단백질의 양을 추정 기준으로 pH 7로 pH를 4로 침강 LDH의 적분 값을 비교한다. 주 : 침강 분포도의 통합 SEDFIT에서 직접 수행 될 수있다. 침강 속도 데이터를 분석하는 다른 소프트웨어는 최근의 검토 (20)에서 찾을 수있다. &lt;/ 리&gt; </ol> HdeB의 존재 4. 모니터링 MDH 불 활성화 및 재 활성화 주 : pH의 펼친 MDH의 폴딩 그래피 HdeB의 영향에 MDH 중화 활성을 모니터링함으로써 측정 하였다. <ol><li> 부재 또는 25 μM의 HdeB의 존재에 37 ° C에서 1 시간 동안 (산도 2.0, 산도 3.0의 pH 4.0, pH를 5.0 여기에) 원하는 pH 값에서 버퍼 D 1 μM의 MDH을 품어. 그 후, 10 분 동안 20 ℃로 온도를 이동. 주 : MDH는 37 °의 C보다 높은 온도에서 배양했을 때 어떤 MDH의 폴딩 심지어 HdeB의 존재는 관찰되지 않았다. </li><li> 산 변성 된 MDH의 폴딩을 개시 0.5 M 인산 나트륨, pH를 8.0 0.13-0.42 양을 첨가하여 pH 7로 시료를 중화한다. </li><li> 20 ° C에서 2 시간 동안 배양 한 후, 340 nm의 구에서 NADH의 감소를 모니터함으로써 MDH 활성을 결정한다. 참고 : MDH는 L 말 산염에 옥 살로 아세테이트의 NADH 의존 감소를 촉매한다. <oL&gt; <li> 분석 완충액 950 μL의 (50 mM의 인산 나트륨, pH를 8.0, 1 밀리미터 옥 살로 아세테이트 및 150 μM NADH)와 인큐베이션 반응물 50 μl를 섞는다. 참고 : 분석 버퍼에 MDH의 최종 농도는 44 nM의해야합니다. </li><li> 20 ° C로 설정 펠티에 온도 제어 블록을 구비 한 분광 광도계 흡광도의 변화를 모니터한다. </li><li> pH를 7.0로 유지 된 44 nM의 기본 MDH에 MDH 활동 상대를보고합니다. </li></ol></li></ol> E.에 HdeB 과발현 5. 효과 산 스트레스에서 대장균 생존 참고 : E. 대장균 MG1655의 게놈 DNA가 발행 프로토콜 (21)을 사용하여 단리 하였다. <ol><li> E.에서 hdeB를 증폭 를 BamHI-레브 GGT의 GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA의 GTC의 AT &amp; T와 hdeB - -를 EcoRI-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C를 PCR 프라이머의 hdeB를 사용하여 대장균 MG1655 </li><li> 다음과 같이 50 μL의 PCR 반응 설정 : 10 μL 5 배 중합 효소 버퍼, 200 μM의 dNTPs, 0.5 μM 프라이머 JUD2, 0.5 μM 프라이머 JUD5, 150 ng를 게놈 DNA의 MG1655, 0.5 ㎕의 DNA 중합 효소를, DDH 2 O 50 μl를 추가합니다. </li><li> 다음과 같이 hdeB의 증폭을 수행 1 단계 : 95 ° C, 1 사이클에서 5 분; 2 단계 : 95 ° C에서 30 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C, 40 회에서 30 초; 3 단계 : 72 ° C에서 10 분. </li><li> 제한 부위 클로닝을위한 표준 방법을 이용하여 플라스미드를 EcoRI pBAD18의 I 및 I를 BamHI 부위로 PCR 단편을 생성 클론. 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 정제 하였다. 시퀀싱 (10)에 의해 생성 된 플라스미드를 확인합니다. </li><li> HdeB 또는 변형 BB7224에 빈 벡터 제어 pBAD18 (Δ rpoH) (유전자형 발현하는 플라스미드 변환 : F를 - λ - E14 - [araD139] B / r에 [6 (된 argF-락) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (SM R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: 테네시 (10) (TC S) suhX401 deoC1 아라드 + rpoH :: 관 + 16) 화학적으로 유능한 세포를 사용. 참고 :이 변형 온도를 구분합니다. </li><li> 45 초 42 ° C에서 열 충격과 이전에 도금을 한 후, 30 ° C, 200 rpm에서 세포를 배양한다. 긍정적 인 클론의 단일 콜로니 연속 아웃을 수행하고 하룻밤에 30 ° C를 품어. 50 ml의 LB 앰프에서 하룻밤 문화를 준비하고 200 rpm으로 30 ℃에서 세포를 배양. </li><li> 밤새 배양 물을 25ml의 LB 앰프로 40 배 희석하고 HdeB 단백질 발현을 유도하기 위하여 30 ° C 및 OD를 600 ㎚ 내지 200 RPM = 1.0 0.5 % 아라비 노스 (아)의 존재 하에서 박테리아 성장. </li><li> pH를 변화 실험에, LB를 사용앰프 + 아라는 0.5 OD의 600 ㎚로 세포를 희석 (여기서는의 pH 2.0, pH가 3.0, pH를 4.0) 각각의 pH 값을 조정합니다 (5) M 염산의 적절한 볼륨을 추가하여. </li><li> 표시된 시점 (하여 pH 3, 2.5 분; pH를 2, 1 분, 4의 pH, 30 분) 한 후, 5 M NaOH를 적절한 양을 첨가하여 배양을 중화. </li><li> OD 측정을 사용하여 30 ℃에서 12 시간 동안 액체 배양에서 중화 문화의 성장을 모니터링합니다. </li></ol>

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<li>Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+Heat-shock+Protein+70+Reaction+Cycle+by+the+Mammalian+DnaJ+Homolog%2C+Hsp40%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40.</a> J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).</li>
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<html> 활성화 및 HdeB의 샤페론 기능의 메커니즘을 연구하기 위해, HdeB 다량이 발현되고 정제 될 수있다. 발현 벡터 시스템의 숫자는이 연구에 사용 하였다 둘 PTRC 또는 pBAD 벡터를 포함하는 목적 단백질의 높은 수준의 생산에 사용할 수있다. 발기인은 E.에 대해 쉽게 접근 할 수 있습니다 대장균 RNA 중합 효소 및 E.에서 HdeB의 이렇게 강하게 상향 조절 허용 식 대장균 균주. 이 측면은 rpoH 결핍 균주가 사용 된 산 스트레스 조건 하에서 HdeB의 생체 과발현 연구에 특히 적합하다. 이 균주는 보호자의 대부분을 부족하고, 따라서 높은 온도, 낮은 pH 및 산화 스트레스 (15)을 포함하는 다양한 스트레스, 대한 더 민감하다. 대안으로, 생존 목적 유전자 결여 변이주에서 수행 될 수있다 여기에서 제시된 것과 유사한 연구. t &quot;&gt; 임의 샤페론 활성에 대한 실험 설계 ...

미생물 병원체가 산에 의한 단백질 전개 상황을 경험하는 일반적인 자연 환경은 그 산성 pH 식중독 병원균 1에 대한 효과적인 장벽 역할을하는 포유류 위 (pH 범위 1-4)입니다. 아미노산 측쇄 양성자로 인한 단백질 응집 펼쳐지는 생물학적 과정, 손상 세포 구조에 영향을 미치며, 결국 세포 사멸 1,2-시킨다. 박테리아 페리 플라 즘의 pH 의한 다공질 외측 막을 통한 양성자의 자유로운 확산을 거의 즉시 환경 pH를 평형화하기 때문에, 그람 음성 박테리아의 주변 세포질과 내막 단백질 산 스트레스 조건 3 하에서 가장 취약한 세포 성분이다. 빠른 산 - 매개 손상에 대한 자신의 주변 세포질 프로테옴을 보호하기 위해, 그람 음성 세균은 산 활성화 주변 세포질 보호자 HdeA 및 HdeB을 사용한다. HdeA는 조건 흐트러 보호자입니다 <sup&gt; 4,5 : 중성 pH에서 HdeA가 접혀, 보호자 - 비활성 이합체로 존재한다. pH가 3 이하의 pH 변화에 따라, HdeA의 보호자 기능은 신속 6,7 활성화됩니다. HdeA의 활성화는 단량체 6-8의 전개 깊은 구조 단량체로는 해리를 포함하여 변경 및 부분이 필요합니다. 활성화되면, HdeA은 산성 조건 하에서 전개 단백질에 결합한다. 그것은 효과적으로 낮은 pH에서 배양하는 동안뿐만 아니라 pH를 중화에 모두 자신의 응집을 방지 할 수 있습니다. pH가 7.0 반환에, HdeA는 ATP 독립적 인 방식으로 자사의 클라이언트 단백질의 접힘을 용이하게하고 이량 체, 샤페론 비활성 형태 9로 다시 변환합니다. 마찬가지로, 동성 보호자 HdeB은 샤페론 비활성화되어 pH가 7.0에서. HdeA 달리, HdeB의 보호자 활동, pH가 4.0에서 HdeB 여전히 크게 접힌 10 이량되고있는 조건을 겉보기 최대에 도달한다. 또한, 상기 pH를 저하 CAUSHdeB의 비활성화 말이지. 이러한 결과는 광범위한 유사성에도 불구하고 HdeA HdeB은 그들의 보호 샤페론 기능 넓은 pH 범위를 커버 할 수 있도록 기능을 활성화 모드들이 다르다는 것을 제시한다. E.의 내산성에 관여 한 또 다른 보호자 대장균은 중립 상태가 복원 될 때까지 펼쳐진 클라이언트 단백질을 안정화 나타나는 세포질 Hsp31이다. Hsp31의 작용의 정확한 모드는, 그러나, 12 수수께끼 남아있다. 살모넬라와 같은 다른 장내 유해 세균이 hdeAB 오페론이 부족한 점을 감안, 다른 아직 미확인 주변 세포질 보호자가이 박테리아 (11)의 내산성에 관여하는 것을있을 수 있습니다 가능성이 높다. 여기에 제시된 프로토콜은 생체 열 관내 및 HdeB에서의 pH 의존성 샤페론 활성을 모니터링 할 수 있도록 다른 샤페론을 조사하기 위해 적용 할 수있다Hsp31 등. 대안 적으로, hdeAB의 발현을 조절하는 전사 인자의 복잡한 네트워크는 잠재적으로 생체 내 응력 분석에 의해 조사 할 수있다. 생체 내에서 단백질의 샤페론 기능을 특성화하기 위해 상이한 실험 설정을 적용 할 수있다. 하나의 경로는 단백질 전개 응력 조건을 적용 표현형 중 관심의 유전자를 과발현 또는 유전자의 삭제를 수행하는 변이주를 특징 화하는 것이다. 프로테오믹스 연구가 보호자가 존재하면 응력 조건 집합을 더 이상 어떤 단백질들을 식별하기 위해 수행 될 수도 있고, 특정 효소의 샤페론의 영향 효소 분석법 14-16을 사용하여 응력 조건에서 측정 할 수있다. 이 연구에서 우리는 모든 주요 E.의 발현을 제어 RpoH 열 충격 시그마 인자 (32)이 부족 rpoH 삭제 변형에 HdeB를 과발현하기로 결정했습니다 콜라이 샤페론 및 삭제는 SENS 증가하는 것으로 알려져단백질 (15)을 전개 발생할 환경 스트레스 조건 itivity. HdeB의 생체 샤페론 활성은 Δ rpoH 균주의 pH 민감성을 억제하는 능력을 모니터하여 측정 하였다. 전체적으로 여기에 제시된 프로토콜은 시험 관내에서뿐만 아니라 생체 내 환경에서 산 활성화 샤페론 활성을 특성화하는 빠르고 간단한 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. coli 세포</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth mix, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>폴리믹신 B 황산염&nbsp;</td><td>ICN 바이오메디컬 Inc.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0.2 & 마이크로; m pore sterile 주사기 필터</td><td>Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malate dehydrogenase (MDH)Roche</td><td></td> <td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate (Monobasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium 인산염 (이염기성)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 형광 분광 광도계</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마&nbsp;</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>젖산 탈수소효소(LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I 분석 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764///0/1//0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>중앙 장식, 12mm, 에퐁 숯으로 채워진</td><td>베크만 쿨터</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, Analytical, 플라</td>스미드 정제에 사용되는 8-Place <td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>(프로토콜 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>형광 세포 큐벳</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>Varian Cary 50 분광 광도계</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 투석 멤브레인 MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 울트라 원심 필터 장치 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-Well Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

의 ph에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 hdeb<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

박테리아 흔히 pH의 변화, 온도, 산화 환원 상태, 노광 또는 기계적 힘 등의 환경 변화에 노출된다. 이러한 조건 중 많은 셀 전개 단백질 원인 유기체의 생존에 불리한 영향을 미친다. 무관 스트레스 특정 분자 샤페론의 그룹이 스트레스 조건의 생존에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 완전히 접혀 및 보호자 - 비활성 스트레스 전에,이 단백질은 빠르게 전개 및 특정 스트레스 조건에서 chaperone 단백질을 활성화하는 동안. 일단 이들 조건 무질서 샤페론 다른 응집 경향 많은 단백질에 결합 활성, 그 응집을 방지하고, 직접 또는 간접적으로 비 응력 조건에 따라 반환 폴딩 단백질을 용이하게한다. 자신의 활성화 및 클라이언트 인식의 메커니즘에 대한 자세한 이해를 얻기위한 기본 접근 방식은 정화 및 subsequen을 포함시험관 샤페론 분석에서 사용하는 이들 단백질의 t 특성화. 생체 스트레스 분석에 후속 독립적으로 시험 관내 결과에서 얻어진 확인할 절대적으로 필수적이다. 이 프로토콜은 E.의 샤프론 활성을 특성화하기 위해 시험 관내 및 생체 내 방법에 대해 설명 콜라이 HdeB, 산 - 활성화 된 샤페론. 광산란 측정은 시험 관내에서, 설정된 모델 클라이언트 단백질 MDH의 산 - 유도 된 응집을 방지하기 HdeB 용량 편리한 판독을 사용 하였다. 분석 초 원심 분리 실험은 아닌 스트레스 조건에 자신의 복귀에 따라 클라이언트 단백질의 운명에 빛을 창고에, HdeB 및 클라이언트 단백질 LDH 사이의 복합체 형성을 나타 내기 위해 적용되었다. 클라이언트 단백질의 효소 활성 분석법을 pH 유도 클라이언트 비활성화 및 활성화에 HdeB의 효과를 모니터링하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 생존 연구 과정 제어하는 ​​데 사용 된생체 내에서 HdeB의 보호자 기능의 영향을 r에.

HdeA 및 HdeB는 E. 상동 있습니다 산 스트레스 조건 (10)에 대해 주변 세포질 단백질을 보호하는 것으로 알려져 대장균 단백질. 우리의 작업은 산 분자 보호자 활성화로 HdeA 유사은 HdeB 또한 기능 것으로 나타났습니다. 그러나, 여전히 잠재적 살균하지만 HdeA 6,9,10,22의 pH 최적보다 상당히 더 높은 pH에서 HdeA, HdeB 기능 대조적이다. 체외 HdeB의 샤페론 활성의 최적 pH를 조사 네이티브 MDH는 HdeB의 유무에 표시된 pH를 예열 된 (43 ℃로) 완충액으로 희석 하였다. 인큐베이션 360 초 후, 배양 반응물을 중화시켰다. 이 중화은 43 ° C를 9에서 MDH의 집계를 트리거합니다. 대표적인 결과 HdeB의 부재 MDH의 광산란 신호 때문에 MDH의 응집 중화시 급격히 증가 시킨다는 것을 보여준다 (도 ...

이 연구는 산성 pH 조건 하에서 대장균 HdeB의 보호자 활동을 특성화, 생물 물리학, 생화학 및 분자 기술에 대해 설명합니다. 이러한 방법은 성공적 HdeA 다른 산 보호 샤페론에 적용되었고, 다른 보호자 스트레스 조건 작동하도록 변경 될 수있다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

이러한 in vivo 및 in vitro 샤페론 분석의 전반적인 목표는 산성 pH 조건에서 Escherichia coli 샤페론 HdeB의 pH 의존적 활성을 특성화하는 것입니다. 산 활성 샤페론은 산으로 유도된 단백질 변성과 분해로부터 단백질을 보호하는 단 하나의 역할만을 수행합니다. 이러한 기능은 장내에 성공적으로 정착하기 위해 위장의 산성 환경에서 생존해야 하는 장내 세균에게 특히 중요합니다.본 과정에서 제시하는 방법들을 통해 산성 활성화 샤페론을 식별 및 특성화하고, 활성화에 필요한 pH 조건을 정의할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, in vitro 및 in vivo 환경에서 HdeB와 같은 샤페론을 특성화하는 방법을 충분히 이해하게 되며, 이를 통해 해당 샤페론의 활성화 기전을 파악하는 데 도움을 얻을 수 있습니다. 이러한 방법들은 HDA와 같은 다른 산 보호 샤페론에도 성공적으로 적용되었으며, 다른 샤페론이나 스트레스 조건에 맞게 추가로 수정하여 사용할 수 있습니다.다양한 pH 값에서 정제된 HdeB가 열적으로 변성되는 돼지 미토콘드리아 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase)의 응집에 미치는 영향을 모니터링합니다. 투석된 MDH를 4 °C에서 4 L의 버퍼 C를 사용하여 하룻밤 동안 투석합니다. 그 후, 분자량 컷오프(molecular weight cutoff)가 30 kDa인 원심분리 필터 장치를 사용하여 단백질을 약 100 µM로 농축합니다. 응집물을 제거하기 위해 4 °C에서 20,000 ×g로 20분 동안 단백질을 원심분리합니다.280 nm에서의 흡광도로 MDH 농도를 결정합니다. 그 다음 MDH를 50 µL씩 분주하여 준비하고, 보관을 위해 분주된 시료들을 급속 냉동합니다. 온도 조절 샘플 홀더와 교반기가 장착된 형광 분광 광도계에 1 mL 석영 큐벳을 넣습니다.들뜸 및 투과 파장을 350 nanometers로 설정하십시오. 원하는 pH 값의 예열된 버퍼 D를 적절한 부피로 큐벳에 추가하십시오. 총 부피는 1,000 microliters입니다.큐벳 홀더의 온도를 43 °C로 설정합니다. 버퍼에 12.5 µM HdeB를 넣은 다음, 0.5 µM MDH를 추가합니다. 빛 산란 측정을 시작합니다.MDH가 충분히 언폴딩될 수 있도록 반응물을 360초 동안 인큐베이션합니다. 2 M 비완충 인산칼륨을 부피의 0.16에서 0.34배만큼 첨가하여 pH를 7로 높이고, 440초 동안 광산란 기록을 계속합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.화학적 컴피턴트 세포를 사용하여 HdeB를 발현하는 플라스미드 또는 MD 벡터 대조군인 PBAD 18을 BB7224 Delta RPOH 균주에 형질전환합니다. 이 균주는 온도 민감성이 있으므로 30 °C에서 배양해야 합니다. 42 °C에서 45초간 열충격을 가한 후, 플레이팅 전까지 세포를 30 °C, 200 RPM 조건에서 배양합니다.양성 클론의 단일 콜로니 스트리킹을 수행하고 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. Ampicillin이 포함된 LB 50 mL에 하룻밤 배양액을 준비하고, 세포를 200 RPM 및 30 °C에서 배양합니다. 하룻밤 배양한 배양액을 Ampicillin이 포함된 LB 25 mL에 40배 희석합니다.HDEB 단백질 발현을 유도하기 위해 0.5% arabinose가 포함된 배지에서 30 °C, 200 RPM 조건으로 박테리아를 배양하여 600 nm에서의 광학 밀도(OD 600)가 1.0이 되도록 합니다. pH 변화 실험의 경우, Ampicillin과 arabinose가 함유된 LB 배지를 사용하여 세포를 OD 600 0.5로 희석합니다. 적절한 양의 5 M 염산을 첨가하여 각각의 pH 값으로 조정합니다.지정된 시간 경과 후, 적절한 부피의 5 M 수산화나트륨을 첨가하여 배양액을 중화합니다. OD 측정을 통해 중화된 배양액과 액체 배양액의 성장을 30 °C에서 12시간 동안 모니터링합니다. in vitro에서 HdeB 샤페론 활성의 최적 pH를 조사하기 위해, HdeB의 존재 또는 부재 하에 native MDH를 지정된 pH로 미리 데운 버퍼에 희석하였습니다.360초 동안 배양한 후, 중화 과정을 통해 43°C에서 MDH의 응집을 유도하였습니다. HdeB가 존재하는 경우, pH 4에서 중화 시 광산란 신호가 현저하게 감소하며, 이는 HdeB가 MDH의 응집을 방지함을 나타냅니다. 응집 측정은 온도나 완충액 조성의 변화에 매우 민감합니다.위양성 결과를 배제하기 위해, 샤페론 보관 버퍼가 클라이언트 응집에 미치는 영향을 조사하였습니다. HdeB 보관 버퍼는 MDH 응집에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. HdeB의 in vivo 효과를 조사하기 위해, 온도 민감성 RPOH 결손 균주를 사용하여 pH 의존적 생존 분석을 수행하였습니다.이 균주는 대부분의 샤페론이 결핍되어 있어 고온, 낮은 pH 또는 산화 스트레스에 더 취약합니다. 중성 pH 조건에서 HdeB를 과발현시켰을 때, 공벡터인 PBAD 18을 보유한 대조군 균주와 비교하여 성장이 유사하게 나타나 성장률에는 영향이 없음을 확인했습니다. 반면, pH 3 또는 pH 4 처리 후 성장을 재개하는 능력에서는 뚜렷한 차이가 발견되었으며, HdeB 과발현 균주는 대조군 균주에 비해 낮은 pH 처리로부터의 회복력이 일관되게 향상된 모습을 보였습니다.숙달되면 정제는 3일, in vitro 산란 분석(scattering assay)은 1일, 그리고 in vivo 생존 분석은 적절히 수행될 경우 2일 만에 완료할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행할 때는 클라이언트 단백질의 종류, 농도 및 사용하는 버퍼 조건과 관련하여 실험 설계를 신중하게 고려하십시오. 이 기술의 주요 장점은 샤페론 활성화 메커니즘과 그것이 in vivo 환경에서 미치는 영향에 대해 더욱 상세한 이해를 얻는 데 도움이 된다는 점입니다.산 보호 샤페론(acid protective chaperone)의 최적 pH를 연구하는 것은 상당히 까다로울 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이는 사용하는 클라이언트 단백질의 응집 거동 또한 pH에 따라 변할 가능성이 높기 때문입니다. 따라서 샤페론과 클라이언트 단백질 모두에 적합한 완충액 시스템을 선택하시기 바랍니다.본 절차 이후, SCS page를 이용한 스핀 다운 분석(spin down assays)과 같은 다른 방법들을 통해 클라이언트 응집의 샤페론 매개 억제 정도를 자동 정량화하여 수행할 수 있습니다.

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Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 산성 및 열 스트레스 하에서 기질 단백질에 대한 샤페론 활성을 평가하기 위한 형광 분광광도계 기반 분석법을 시연합니다. 이 문서는 빛 산란을 통한 기질 전개 및 집적 모니터링 단계, 인솔이 있는 상태와 없는 상태 비교를 설명합니다.

모델 단백질의 열 전개를 통한 박테리아 샤페론 활성 평가

출처: Dahl, J. 외 시험관 및 생체 내에서 대장균 샤페론 HdeB의 pH 의존성 활성 검출. J. Vis. 경험 (2016)이 영상은 재조합 대장균 배양을 이용해 산 활성화 샤페론이 산 스트레스 시 보호 효과를 평가하는 과정을 보여줍니다. 박테리아 성장 모니터링은 샤페론 발현 배양에서 대조군에 비해 생존율이 향상되었음을 보여주며, 스트레스 조건에서 단백질 안정화에서 샤페론의 역할을 강조합니다.

산 스트레스 하에서 대 장균 에서 산 활성화 샤페론의 보호 역할 평가

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

샤페론-샤페론과 샤페론 기판 상호 작용을 연구하기 위해, 우리는 온화한 돌연변이와 결합된 RNA 간섭을 사용하여 Caenorhabditis elegans에 있는 합성 상호 작용 스크린을 능력을 발휘하고 chaperones의 과잉 발현및 유기체 수준에서 조직 특정 단백질 기능 장애를 감시합니다.

조직별 샤페론 상호 작용을 위해 검사하기 위해 Caenorhabditis elegans를 사용

이 프로토콜은 히스톤 샤페론 올리고머화 및 안정성을 연구하기 위한 분석 크기 배제 크로마토그래피, 히스톤 샤페론-히스톤 상호작용을 밝히기 위한 풀다운 분석, 단백질 복합체의 화학량론을 분석하기 위한 AUC, 추정 히스톤 샤페론을 시험 관 내에서 기능적으로 특성화하기 위한 히스톤 샤페로닝 분석을 포함하는 일련의 방법을 설명합니다.

체외 분석, 풀다운 및 샤프롱 분석을 사용한 히스톤 샤페론의 특성 분석

이 프로토콜은 열 충격 단백질 70(Hsp70)의 샤페론 활성을 보여줍니다. 대장균 dnaK756 세포는 기능적으로 손상된 Hsp70을 가지고 있어 열 스트레스에 취약하기 때문에 분석의 모델 역할을 합니다. 기능성 Hsp70의 이종 도입은 세포의 성장 결핍을 구제합니다.

열충격 단백질 70의 샤페론 기능을 연구하기 위한 대장균 기반 보완 분석

다양한 응용 분야에 걸쳐 구현하기 위해 향상된 효소 안정성을 제공하는 효소 포장 외막 소포체(OMV)의 생산, 정제 및 사용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

배우세요 대장균 HdeB의 pH 의존적 활성을 생체 내외에서 특성화하는 방법을. 산성 조건에서 단백질 보호 메커니즘을 연구하고 세균 생존 전략을 이해하는 데 활용할 수 있습니다.

의 pH에 ​​의존 활동의 검출

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