의 pH에 ​​의존 활동의 검출 대장균 보호자 HdeB 체외 및 생체

이러한 in vivo 및 in vitro chaperone assay의 전반적인 목표는 산성 pH 조건에서 Escherichia coli chaperone HdeB의 pH 의존성 활성을 특성화하는 것입니다. 산성 활성화 샤페론이 할 일은 단 하나, 산에 의한 단백질의 풀림과 분해로부터 단백질을 보호해야 한다는 것입니다. 이 기능은 장 세균에게 특히 중요한데, 장내 세균이 장에 성공적으로 서식하려면 위의 산성 환경에서 살아남

여기에서 제시하는 방법을 사용하면 산 활성 샤페론을 식별 및 특성화하고 활성화로 이어지는 pH 조건을 정의할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 HdeB in vitro 및 in vivo와 같은 샤페론을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이는 활성화 메커니즘을 해독하는 데 도움이 됩니다. 이러한 방법은 HDA와 같은 다른 산성 보호 샤페론에 성공적으로 적용되었으며 다른 샤페론 및/또는 스트레스 조건과 함께 작동하도록 추가로 수정할 수 있습니다.

서로 다른 pH 값에서 열적으로 풀리는 돼지 미토콘드리아 말레이트 탈수소효소의 응집에 대한 정제된 HdeB의 영향을 모니터링합니다. 완충기 C.Then의 4개 리터에 대하여 밤새도록 4 섭씨 온도에 MDH를 투석한 것은 30 kilodaltons의 분자량 커트오프를 가진 원심 여과기 단위를 사용하여 대략 100 마이크로몰에 단백질을 집중시킵니다. 응집체를 제거하기 위하여는, 20, 4 섭씨 온도에 G 시간에 20 분 동안 단백질을 분리하십시오.

280나노몰에서 흡광도로 MDH 농도를 측정합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 MDH 분취액을 준비하고 분취액을 급속 동결하여 보관합니다. 1밀리리터 석영 큐벳을 온도 제어 시료 홀더와 교반기가 장착된 형광 분광 광도계에 넣습니다.

여기 파장과 진입 파장을 350나노미터로 설정합니다. 원하는 pH 값으로 적절한 부피의 예열된 완충액 D를 큐벳에 추가합니다. 총 부피는 1, 000 마이크로 리터입니다.

큐벳 홀더의 온도를 섭씨 43도로 설정합니다. 완충액에 12.5마이크로몰 HdeB를 추가한 다음 0.5마이크로몰 MDH를 추가합니다. 광 산란 모니터링을 시작합니다.

MDH가 충분히 풀릴 수 있도록 360초 동안 반응을 배양합니다. 0.16에서 0.34 부피의 2몰 un-buffered dipotassium phosphate를 추가하여 pH를 7로 올리고 440초 동안 광 산란을 계속 기록합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다.

화학적으로 적질된 세포를 사용하여 HdeB 또는 MD 벡터 대조군 PBAD 18을 발현 플라스미드를 BB7224 Delta RPOH 균주로 변환합니다. 이 균주는 온도에 민감하며 섭씨 30도에서 재배해야합니다. 섭씨 42도에서 45초 동안 열 충격을 가한 후 도금하기 전에 섭씨 30도 및 200RPM에서 셀을 배양합니다.

양성 클론의 단일 콜로니 스트리크 아웃을 수행하고 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 암피실린이 함유된 LB 50밀리리터에서 하룻밤 배양을 준비하고 섭씨 200rpm 및 30도에서 세포를 배양합니다. 밤새 배양물을 암피실린으로 40배 25ml의 LB로 희석합니다.

섭씨 30도, 200RPM에서 0.5%아라비노스가 있는 곳에서 박테리아를 600나노미터 또는 1.0과 같은 OD 600의 광학 밀도로 성장시켜 HDEB 단백질 발현을 유도합니다. pH 이동 실험의 경우 LB를 암피실린 및 아라비노스와 함께 사용하여 세포를 OD 600 0.5로 희석합니다. 5몰 염산을 적절한 부피로 추가하여 각각의 pH 값으로 조정합니다.

표시된 시점이 지나면 적절한 부피의 5몰 수산화나트륨을 첨가하여 배양물을 중화합니다. OD 측정을 사용하여 섭씨 30도에서 12시간 동안 중화된 배양물 및 액체 배양의 성장을 모니터링합니다. 시험관 내에서 HdeB의 샤페론 활성의 pH 최적을 조사하기 위해, 천연 MDH를 존재 또는 부재 또는 HdeB에서 표시된 pH의 예열된 완충액으로 희석했습니다.

360초의 배양 후, 섭씨 43도에서 MDH의 응집이 중화를 통해 촉발되었습니다. HdeB가 존재할 경우, pH 4에서 중화될 때 광 산란 신호가 현저히 감소하는데, 이는 HdeB가 MDH의 응집을 막는다는 것을 나타냅니다. 응집 측정은 온도 또는 버퍼 함량의 변화에 매우 민감합니다.

거짓 긍정 결과를 제거하기 위해 클라이언트 집계에 대한 샤페론 스토리지 버퍼의 영향을 조사했습니다. HdeB 스토리지 버퍼는 MDH 집계에 영향을 주지 않았습니다. in vivo에서 HdeB의 효과를 조사하기 위해 온도에 민감한 RPOH 결실 균주를 사용하여 pH 의존적 생존 분석을 수행했습니다.

이 균주는 대부분의 샤페론이 부족하므로 고온, 낮은 pH 또는 산화 응력에 더 취약합니다. 중성 pH 조건에서 HdeB의 과발현은 균주의 성장 속도에 영향을 미치지 않았으며, 이는 빈 벡터 PBAD 18을 품고 있는 대조 균주와 비교적 잘 성장했습니다. 대조적으로, pH 3 또는 pH 4 처리 시 성장을 재개하는 능력에서 분명한 차이가 발견되었으며, HdeB 과발현 균주는 대조군 균주에 비해 낮은 pH 처리에서 재현성 있게 향상된 회복을 보여주었습니다.

일단 마스터되면 정제는 3일, 시험관 내 산란 분석은 1일, 생체 내 생존 분석은 적절하게 수행될 경우 2일 안에 완료할 수 있습니다. 이러한 실험을 수행할 때는 클라이언트 단백질의 유형, 농도 및 사용하는 완충액 조건과 관련하여 실험 설계를 신중하게 고려해야 합니다. 이 기술의 주요 장점은 in vivo 맥락에서 샤페론 활성화 메커니즘과 그 효과에 대해 보다 자세히 이해하는 데 도움이 된다는 것입니다.

그리고 산성 보호 샤페론의 pH 최적 조건을 연구하는 것이 상당히 어려울 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 이는 사용하는 클라이언트 단백질의 응집 거동도 pH에 따라 변할 가능성이 높기 때문입니다. 따라서 chaperone과 client protein 모두에 적합한 완충 시스템을 선택해야 합니다.

이 절차에 따라, SCS 페이지에 의한 스핀 다운 분석과 같은 다른 방법은 클라이언트 응집의 자동 정량화된 샤프론 매개 억제에서 수행될 수 있습니다.