2016년 9월 26일
프로토콜은 알긴산과 같은 세포 외 중합체 (ALE)를 추출하기 위해 호기성 입상 슬러지를 가용화하는 방법을 제공한다.
다음 실험의 전반적인 목표는 바이오폼, 특히 호기성 과립 슬러지에서 구조적 세포외 고분자 물질 또는 EPS를 얻기 위한 추출 방법론을 보여주는 것입니다. 이 방법은 세분화된 슬러지 필드의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 과립화 과정을 이해하고 EPS 구성을 분석하는 것과 같은.
이 기술의 주요 장점은 EPS에 겔 발포 폴리머의 존재를 짧은 시간에 테스트 할 수 있다는 것입니다. 과립상 진창을 4, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도에서 20 분 동안 원심 분리하고 상층액을 기울입니다. 추출을 위해 펠릿에 과립을 수집합니다.
자석 교반기의 1, 000 밀리리터 유리 비커에 담긴 150 밀리리터의 수돗물을 섭씨 80도까지 예열합니다. 250밀리리터 배플 플라스크에 3g의 과립을 옮기고 플라스크를 탈염수로 50밀리리터로 채웁니다. 플라스크에 0.67g의 탄산나트륨 십수화물을 첨가하여 부피당 0.5%의 탄산나트륨 농도를 얻습니다.
혼합물이 들어있는 플라스크를 수조에 넣으십시오. 증발을 방지하기 위해 플라스크와 비커 유리를 알루미늄 호일로 따로 덮으십시오. 혼합물을 400RPM과 섭씨 80도에서 35분 동안 저어줍니다.
혼합물을 50ml 원심분리 튜브에 옮깁니다. 혼합물이 들어있는 튜브를 4, 000 회 G 및 4 섭씨 온도에서 20 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 모아 펠릿을 버립니다.
투석 단계는 호기성 과립 슬러지에서 구조적 EPS를 얻기 위한 선택 사항입니다. 그러나 프로토콜에 설명된 몇 가지 장점이 있습니다. 분자량이 3, 500 달톤으로 절단된 투석 백에 상등액을 피펫으로 넣고 초순수 1000ml에 대해 24시간 동안 투석합니다.
투석 효과를 높이기 위해 12 시간 후에 투석 물을 교체하십시오. 투석된 추출물을 250ml 유리 비커에 옮기고 100rpm과 실온에서 추출액을 천천히 저어줍니다. PH 전극으로 PH 변화를 지속적으로 모니터링하면서 최종 PH 2.2 05에 1몰 염산을 추가하여 산성 형태의 에일을 얻습니다.
PH를 2.2로 조절한 후 추출물을 50ml 원심분리 튜브에 넣고 G 4000회, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 젤 같은 펠릿을 모으십시오. 젤 같은 펠릿은 산성 형태의 에일입니다.
에일의 나트륨 형태를 얻으려면 PH 8.5에 도달할 때까지 손으로 유리 스틱으로 젤을 천천히 혼합하면서 0.5몰 수산화나트륨을 젤에 천천히 첨가합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 나트륨 에일 추출물을 염화칼슘 용액에 천천히 떨어뜨립니다. 추출된 EPS가 이온 하이드로겔 겔 형성 특성을 가지고 있으면 물방울 모양의 정자 구슬이 형성됩니다.
또는 추출된 EPS에 이온 하이드로겔 겔 형성 특성이 없는 경우 추출물은 염화칼슘 용액에 분산됩니다. 하이드로겔 비드와 염화칼슘 용액을 30분 동안 보관합니다. 숟가락을 사용하여 염화칼슘 용액에서 하이드로겔 비드를 꺼내 EDTA 용액으로 옮깁니다.
하이드로겔 비드를 10ml의 EDTA 용액에 넣고 섭씨 4도에서 3시간 동안 보관합니다. 이 테스트는 프로토콜에 설명된 안정성 테스트의 한 가지 예를 보여 줍니다. 이 보관 중에 비드가 눈에 띄게 분해되는지 모니터링하여 비드가 이러한 조건을 견딜 수 있는지 평가하십시오.
추출이 성공적이면 알칼리성 추출 단계 후에 호기성 과립 슬러지가 가용화되고 추출된 EPS를 산성화 및 원심분리한 후 펠릿을 얻을 수 있습니다. 추출된 EPS가 구조적 EPS이고 칼슘 이온으로 하이드로겔을 형성할 수 있는 능력이 있는 경우 추출된 EPS를 칼슘 용액에 떨어뜨릴 때 겔 비드가 형성됩니다. 이러한 겔 형성 능력이 없는 EPS를 추출하면 EPS 용액이 칼슘 용액에 분산됩니다.
이 비디오를 시청한 후에는 호기성 과립 슬러지에서 구조적 EPS를 추출할 수 있어야 합니다. 또한 얻어진 EPS의 겔 형성 능력을 칼슘 이온으로 테스트할 수 있어야 합니다. 우리는 호기성 과립 슬러지에서 얻은 EPS에 대한 추출 기술의 영향을 설명하기 위해 이 추출 방법론을 보여주기로 결정했습니다.
그 외에도 EPS 추출 기법이 보편적으로 적용할 수 없다는 것을 보여주고 싶었습니다.
이 프로토콜은 호기성 과립 슬러지로부터 알기네이트와 같은 세포외 중합체(ALE)를 추출하는 방법론을 설명합니다. 추출 과정은 세포외 중합체 물질(EPS)의 구성 및 특성을 이해하기 위해 고안되었습니다.
Extraction and characterization of structural extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludge enables precise interrogation of biofilm matrix components relevant to bioprocessing and environmental biotechnology. The ability to isolate gel-forming alginate-like polymers (ALE) supports mechanistic de-risking in workflows where EPS composition impacts process stability and material properties. This methodology informs early-stage target validation and standardization for downstream assay development in biopharma and industrial biotech pipelines.
This extraction protocol positions EPS isolation at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from hypothesis testing to preclinical model validation.