형광 염료와 항체 라벨은 자기 단백질 A와 단백질 G 비즈를 사용하여

이 방법의 전반적인 목적은 자성 단백질 A 또는 G 비드를 사용하여 정제된 샘플이나 세포 배양액에서 항체에 형광 염료를 표지하는 것입니다. 이 방법은 세포 배양액 내의 소량의 항체에 대해서도 표지 화학 반응을 최적화하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 항체의 하위 응용 단계에서 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 항체를 정제할 필요가 없으며, 아민 또는 티올 화학을 사용할 수 있고, 자동 또는 수동 방식으로 수행 가능하다는 것입니다. 먼저 부드럽게 흔들어 비즈를 균일하게 재현탁하십시오. 그런 다음, 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 50 microliters의 비즈를 첨가하십시오.

그 다음, 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 10초 후, 저장 버퍼를 250 µL의 항체 결합 버퍼로 조심스럽게 교체하고 비드를 잘 섞어줍니다. 다시 10초가 지난 후, 결합 버퍼를 1 mL의 목적 항체로 조심스럽게 교체합니다.

그 후 시료를 상온에서 60분 동안 혼합합니다. 배양이 끝나면 튜브를 다시 자석에 부착하고, 비드가 튜브 벽면으로 이동하면 상층액을 제거합니다. 그런 다음, 회당 250 µL의 항체 결합 세척 완충액을 사용하여 10초씩 두 번 세척하여 비드와 항체 혼합물을 헹굽니다.

아민 화학법을 이용하여 항체를 라벨링하려면, 2차 세척 후 세척 버퍼를 100 µL의 아민 결합 버퍼로 교체하고 항체 100 µg당 2.5 µL의 갓 준비한 아민 반응성 염료를 첨가합니다. 라벨링 과정 동안 비드가 부유 상태를 유지할 수 있도록 상온에서 60분 동안 샘플을 볼텍싱합니다. 그 후, 튜브를 다시 자석 위에 10초 동안 두고 상층액을 제거합니다.

방금 시연한 것과 같이, 항체 결합 세척 완충액으로 비드를 두 번 세척합니다. 그 다음, 세척 완충액을 50 µL의 용출 완충액으로 교체하고 비드를 5분 동안 혼합합니다. 튜브를 다시 자석에 10초 동안 놓은 후, 용출된 항체를 5 µL의 중화 완충액이 들어 있는 새 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다.

방금 시연한 것과 같이 항체를 한 번 더 용출시키고, 용출된 샘플을 수거합니다. 그 다음, 280 nanometers와 염료의 lambda max에서 항체-염료 접합체의 흡광도를 측정합니다. 티올 화학을 이용해 항체를 표지하려면, 두 번째 세척 후 세척 완충액을 250 microliters의 티올 접합 완충액으로 교체하고 파이펫팅으로 비드를 부드럽게 섞어줍니다.

10초 후, 항체 결합 세척 버퍼로 비드를 2회 세척합니다. 그런 다음, 세척 버퍼를 100 µL의 티올 접합 버퍼로 교체하고 DTT를 최종 농도가 2.5 mM이 되도록 첨가합니다. 비드를 60분 동안 더 혼합합니다.

그런 다음, 비드를 다시 자석에 10초 동안 두고 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 비드에 thiol-conjugation buffer 250 µL를 넣고 부드럽게 섞어줍니다. 10초 후, antibody-binding wash buffer로 비드를 두 번 세척하며, 두 번째 세척 후에는 신선한 thiol-conjugation buffer 100 µL로 교체합니다.

이제 항체 100 µg당 2.5 µL의 갓 준비한 티올 반응성 염료를 첨가하고 실온에서 60분 동안 비드를 혼합합니다. 배양이 끝나면 튜브를 다시 자석에 10초 동안 둡니다. 그 후 상층액을 제거하고 250 µL의 신선한 티올 결합 버퍼로 교체하며 부드럽게 혼합합니다.

10초 후, 비드를 두 번 세척합니다. 그런 다음, 세척 버퍼를 50 µL의 용출 버퍼로 교체하고, 방금 시연한 것과 같이 접합된 항체를 두 번 용출합니다. 이어서, 항체-염료 접합체의 흡광도를 280 nm와 해당 염료의 λmax에서 측정합니다.

항체와 Protein G 사이의 강한 친화력, 비드에 대한 자석의 강력한 친화력, 그리고 비드 정제 전의 방법 최적화를 통해 라벨링 반응 중 항체의 명목상 손실을 최소화했으며, 이는 단순 정제와 비교하여 형광 이중 라벨링 후 세 가지 서로 다른 마우스 항체 동형 단백질(isotype)이 효율적으로 회수되었다는 점으로 입증되었습니다. 이러한 회수율은 Coomassie 젤에서도 확인되었으며, magnetic G Protein 비드의 낮은 비특이적 결합 특성 덕분에 고도로 정제된 형광 이중 라벨링 중쇄 및 경쇄가 나타났습니다. magnetic Protein A 비드를 이용한 비드 상의 라벨링 또한 여러 형광 염료와 호환되어 높은 회수율과 양호한 염료-항체 비율을 나타냈습니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 2~3시간 만에 완료할 수 있습니다. 이를 통해 여러 시료를 수동으로 처리하거나, 처리량을 높이기 위해 자동화 플랫폼을 사용할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 자기 비드가 항상 현탁 상태를 유지하도록 하는 것이 중요합니다.

샘플에 적절한 부피의 자기 비드를 선택하십시오. 그리고 관심 항체에 맞는 형광 염료의 양을 최적화하십시오. 이 절차에 따라, 표지된 항체는 ELISA, FACS 또는 세포 기반 분석과 같은 관련 생물학적 분석을 통해 기능성을 확인하는 테스트를 거쳐야 합니다.

이 영상을 시청한 후에는 자기 Protein A 또는 G 비드를 사용하여 정제되었거나 정제되지 않은 항체를 형광 태그 또는 biotin이나 세포독성 약물과 같은 다른 소분자로 표지하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.