리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

본 실험의 전반적인 목표는 박테리아 검출을 위한 간단한 변형 리트머스 테스트를 시연하는 것입니다. 이 방법은 E.coli에 의해 활성화된 RNA 절단 DNA 효소가 urease 기반의 신호 전달 플랫폼과 결합하여 E.coli에 반응해 색상 변화를 일으키는 과정을 설명합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 테스트의 간편함과 다른 분석물 반응형 RNA 절단 DNA 효소에 적용 가능하다는 점입니다.

실험 절차는 McMaster University의 Dr.Yingfu Li 연구실 소속 대학원생인 Seperh Manchehry와 Dingran Chang이 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시약과 완충액을 준비한 후, 1 mg의 SMCC를 676 µL의 DMSO에 녹여 succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate(SMCC) 스톡 용액을 조제합니다. 볼텍싱한 후 사용 전까지 얼음에 보관하십시오.

1 mg의 urease를 1 mL의 1x PBS에 녹인 후, 사용 전까지 얼음에 보관하십시오. urease DNA(UrDNA)를 합성하려면, 2.5 mL 마이크로 튜브에 100 µM LD1 10 µL를 넣습니다. 그 다음, 이중 증류수 140 µL와 10x PBS 40 µL를 추가하고 볼텍싱합니다.

다음으로, SMCC 스톡 80.5 µL와 DMSO 159.5 µL를 첨가합니다. 그런 다음 다시 볼텍싱하고 벤치탑 원심분리기를 사용하여 짧게 원심분리합니다. 인큐베이터 또는 히트 블록에서 37 °C로 60분 동안 반응물을 배양합니다.

배양 후, 튜브에 1x PBS 200 µL, 3 M sodium acetate 60 µL, 그리고 차가운 100% ethanol 1.5 mL를 첨가합니다. 볼텍싱으로 혼합한 후, 반응물을 -20 °C에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 20,000 ×g, 4 °C 조건에서 20분 동안 원심분리합니다.

그런 다음, 상층액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 건조합니다. 건조된 펠릿에 urease 스톡 400 µL를 첨가하고 실온에서 5시간 동안 배양합니다. 조제된 접합체 200 µL를 미리 세척한 100,000 분자량 컷오프 원심분리 필터 컬럼으로 옮깁니다.

컬럼을 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 남은 200 µL의 조제 접합물(crude conjugate)을 컬럼에 옮기고 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 컬럼을 꺼내어 새로운 2 mL 마이크로 원심분리 수집 튜브에 뒤집어서 넣습니다.

역방향으로 세운 컬럼과 튜브를 1,000 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브를 제거한 후, 접합체의 추가 회수를 위해 30 µL의 1x PBS를 원심분리 컬럼에 첨가하여 막을 세척합니다. 컬럼을 다시 뒤집어 수집 튜브에 넣습니다.

컬럼을 1,000 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 컬럼을 제거하여 폐기합니다. UrDNA를 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다.

E.coli-활성 RNA 절단 DNAzyme(EC1) 및 UrDNA를 자기 비드에 조립하려면, 자기 비드 스톡을 잘 섞은 후 비드 현탁액 100 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그런 다음, 비드를 분리하기 위해 튜브를 자기 랙 홀더에 놓습니다. 피펫팅으로 상층액을 제거하고 튜브에 150 µL의 결합 버퍼(BB)를 첨가합니다.

튜브를 홀더에서 꺼내고 튜브를 조심스럽게 쳐서 비즈가 균질한 용액이 되도록 재현탁합니다. 비즈가 BB 내에 부유된 상태에서 BB 세척을 두 번 더 반복한 후, 10 µM EC1 10 µL를 첨가합니다. 튜브를 쳐서 조심스럽게 혼합합니다.

용액을 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 비드의 응집을 방지하기 위해 2~3분마다 튜브를 톡톡 쳐줍니다. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브를 다시 마그네틱 랙에 놓아 비드를 분리하고 피펫팅을 통해 상층액을 제거합니다.

그런 다음, 150 µL의 BB를 사용하여 비드를 3회 세척합니다. 세척이 완료되면 비드를 총 150 µL의 BB에 현탁합니다. 이 용액에 15 µL의 UrDNA를 첨가하고 시료를 45 °C에서 2분 동안 가열한 후, 용액을 실온으로 냉각시켜 2시간 동안 배양합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 다시 자석 랙에 올려 비드를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.

반응 버퍼(reaction buffer, RB) 100 µL를 추가한 다음, 자석 랙에서 튜브를 꺼내 비즈를 조심스럽게 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 E.coli 세포를 준비한 후, 1.5 mL 마이크로 튜브에 RB 100 µL를 넣고 볼텍싱하여 사전 세척합니다. 그 다음, 버퍼를 제거합니다. 세척된 튜브에 조립된 EC1 15 µL를 추가하고, 튜브를 자석 랙에 놓은 뒤 상층액을 흡입하여 제거합니다.

랙에서 튜브를 꺼내 RB 100 µL를 넣고 마그네틱 비드를 조심스럽게 재현탁합니다. RB를 사용하여 비드를 두 번 더 세척하고 RB를 제거한 후, 튜브에 E.coli 샘플 10 µL를 넣고 튜브를 탭핑하여 내용물을 부드럽게 섞습니다. 그 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후, 90 µL의 이중 증류수를 첨가하고 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 약 3분간 마그네틱 분리를 수행한 후, 상청액 85 µL를 조심스럽게 0.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 이때 마그네틱 비드가 포함되지 않도록 용액을 매우 주의 깊게 파이펫팅하는 것이 중요합니다.

이 비즈들은 유레아제로 충전되어 있으며 위양성 신호를 생성합니다. 0.04% Phenol red 15 µL와 기질 용액 100 µL를 첨가하십시오. 그 후, 특정 시간 간격으로 사진을 촬영하여 색상 변화를 기록합니다.

리트머스 시험의 시작 색상은 pH 5.5 미만의 용액 상태를 반영하여 노란색이어야 합니다. 필요한 경우, 리트머스 시험의 시작 pH는 pH 5의 1 mM 아세트산 나트륨 완충액과 같은 약한 완충액으로 조절할 수 있습니다. 이 그림은 E.coli에 의해 활성화된 RNA 절단 DNAzyme EC1을 DNAzyme으로 사용하고 Phenol red를 pH 지시약으로 사용한 박테리아 리트머스 시험의 결과를 보여줍니다.

E.coli가 없을 때 색 변화가 나타나지 않는 것으로 보아, EC1은 선택성이 매우 높으며 다른 박테리아에 대해서는 최소한의 활성만을 보입니다. 색 변화의 정도는 DNAzyme 활성화 단계에서 사용된 E.coli 세포 수와 요소 가수분해 단계에 주어진 시간 모두에 의존합니다. E.coli 세포 수가 많을수록 색 변화가 더 강하게 나타나며, 요소 가수분해 시간이 길어질수록 더 적은 수의 세포를 검출할 수 있습니다.

이 그래프는 휴대용 pH 미터를 사용하여 모니터링한 pH 변화를 보여줍니다. 10⁷개의 E.coli 세포가 존재했을 때, 10분 이내에 pH가 3단위 점진적으로 증가했습니다. 반대로, E.coli가 없는 경우에는 동일한 조건에서 pH 변화가 감지되지 않았습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, urease의 활성이 매우 높으므로 세척이 불충분하거나 오염이 발생하면 위양성 결과가 나올 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 환경 수질 검사와 같이 보다 실제적인 조건에서 E.coli를 테스트하기 위해 이 방법을 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 E.coli 검사를 위해 간단한 리트머스 시험을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 시험은 매우 위험한 병원성 E.coli를 검출하는 데 사용될 수 있음을 잊지 마십시오. 병원성 박테리아에 대한 모든 시험을 수행하기 전에 생물 안전 교육을 이수해야 합니다.