Name: 리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 배우세요 리트머스 테스트를 수정하여 E. coli를 신속하게 검출하는 방법을 배우세요. RNA 절단 DNA자임과 우레아제 신호 전달을 활용한 분자 진단 기법으로 현장 적용이 가능합니다.

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이 연구 프로젝트에 대한 자금은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)에서 YL에 대한 디스커버리 보조금을 통해 제공했습니다.

<ol><li>Daar, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+ten+biotechnologies+for+improving+health+in+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Top ten biotechnologies for improving health in developing countries.</a> Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).</li>
<li>Newman, J. D., Turner, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Home+blood+glucose+biosensors%3A+a+commercial+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Home blood glucose biosensors: a commercial perspective.</a> Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).</li>
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<li>Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Bacterial+Detection+by+DNAzymes+into+a+Litmus+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).</li>
<li>Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+probes+as+bacterial+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligand+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
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<li>Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+catalytic+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Making catalytic DNAs.</a> Science. 290, 2095-2096 (2000).</li>
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<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Li, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+and+selective+catalytic+DNA+biosensor+for+lead+ions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).</li>
<li>Liu, J., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+lead+biosensor+using+DNAzyme-directed+assembly+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).</li>
<li>Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal+specificity+and+pH+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+beacon+sensor+for+uranium+with+parts-per-trillion+sensitivity+and+millionfold+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).</li>
<li>Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+a+new+lanthanide-dependent+DNAzyme+for+ratiometric+sensing+lanthanides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides.</a> Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+%27MgZ%27+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS One. 2, e1224(2007).</li>
<li>Xiang, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+personal+glucose+meters+and+functional+DNA+sensors+to+quantify+a+variety+of+analytical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets.</a> Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+DNA+enzyme-based+fluorescent+assay+for+bacterial+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection.</a> Biomolecules. 3, 563-577 (2013).</li>
<li>Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Bacteria+Using+Fluorogenic+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes.</a> J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).</li>
<li>Shen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalytic+DNA+activated+by+a+specific+strain+of+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+recognition+of+breast+tumors+by+an+RNA-cleaving+fluorogenic+DNAzyme+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe.</a> Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).</li>
<li>Sumner, J. B., Hand, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+point+of+crystalline+urease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Isoelectric point of crystalline urease.</a> J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).</li>
<li>Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((70+Years+of+crystalline+urease%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">70 Years of crystalline urease: What have we learned.</a> Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).</li>
<li>Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+platform+for+Real-Time+PCR+detection+of+Salmonella+spp.%2C+Listeria+monocytogenes+and+Escherichia+coli+O157+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk.</a> Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).</li>
<li>Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+preparation+method+for+PCR-based+detection+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+ground+beef%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef.</a> J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).</li>
<li>Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorogenic+real-time+PCR+for+detection+and+quantification+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+dairy+wastewater+wetlands%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).</li>
<li>Strachan, N. J., Ogden, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+microsphere+coagulation+ELISA+for+Escherichia+coli+O157%3AH7+using+Russell%27s+viper+venom%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom.</a> FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).</li>
<li>de Boer, E., Beumer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+detection+and+typing+of+foodborne+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms.</a> Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).</li>
<li>Gracias, K. S., McKillip, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+conventional+detection+and+enumeration+methods+for+pathogenic+bacteria+in+food%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food.</a> Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).</li>
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박테리아 반응성 DNA효소의 RNA 절단 활성의 작용을 리트머스 테스트로 번역하는 것은 그림 1과 같이 우레아제와 자기 분리를 사용하여 가능합니다. 박테리아 검출을 위한 변형된 리트머스 테스트의 시연은 대 장균 의존성 RNA 절단 DNA효소(5,19,20 )로 수행되지만, 설계는 일반적으로 모든 RNA 절단 DNA효소에 대해 확장될 수 있습니다. 다양한 분석물에 대한 RNA 절단 DNA효소의 가용성이 높고 새로운 표적을 위한 무작위 서열 풀에서 새로운 RNA 절단 DNA효소를 분리하는 다양한 방법론을 감안할 때, 수정된 리트머스 테스트 플랫폼이 다양한 관심 표적의 검출로 확장될 수 있을 것으로 기대합니다.
대장균 검출을 위한 리트머스 테스트는 보고 반응 시간이 각각 1시간 및 2시간으로 설정된 경우 5,000개 및 500개의 세포를 검출할 수 있습니다. 널리 사용되는 중합효소연쇄반응(PCR) 및 샌...

세균 병원체는 전 세계 이환율과 폐사의 주요 원인 중 하나입니다. 병원 감염, 식품 매개 병원균 및 환경 내 박테리아 오염 물질로 인한 발병은 공중 보건 및 안전에 심각하고 지속적인 위협을 가하고 있습니다. 이러한 발병을 예방하려면 다양한 환경에서 적시에 병원체를 검출할 수 있는 효과적인 도구가 필요합니다. 간단하지만 여전히 효과적인 검사는 휴대가 간편하고 비용 효율적이며, 특히 발병에 취약하지만 값비싼 검사 시설을 감당할 수 없는 지역에서 매우 탐납니다. 1-3 박테리아를 검출하는 방법은 다양하지만 그 중 대부분은 긴 테스트 시간, 값비싼 장비 및 복잡한 테스트 절차가 필요하기 때문에 스크리닝 또는 현장 테스트 도구로 적합하지 않습니다. 
색계 테스트는 육안으로 색상 변화를 쉽게 감지할 수 있기 때문에 현장 진료 또는 현장 응용 분야에 특히 매력적입니다. pH에 대한 리트머스 테스트는 간단하고 빠르며 효과적입니다. 매우 오래된 기술이지만 단순성과 효율성으로 인해 오늘날에도 여전히 널리 사용되고 있습니다. 놀랍게도, 이 간단한 검사는 최근에 대장균 검사를 위해 이 검사를 수정하는 접근 방식을 개발하기 전까지 다른 분석물을 검출하기 위해 수정한 적이 없었습니다. 4 개
대장균에 대한 확장된 리트머스 테스트는 대장균 활성화 RNA 절단 DNAzyme(EC1), 5 우레아제 및 마그네틱 비드의 세 가지 추가 구성 요소를 사용합니다. DNAzymes는 촉매 활성을 가진 합성 단일 가닥 DNA 분자를 나타냅니다. 6 그들은 시험관 내 선택을 사용하여 무작위 서열 DNA 풀에서 분리할 수 있습니다. 7,8 이들은 매우 안정적이며 고효율 자동 DNA 합성을 사용하여 비용 효율적으로 생산할 수 있습니다. 9 이러한 이유로, DNAzymes, 특히 RNA-cleaving DNAzymes는 바이오센싱 응용을 위해 널리 연구되어 왔습니다. 6,10,11 RNA 절단 DNAzyme 센서는 금속 이온, 12-16 개의 소분자, 17,18 개의 박테리아 병원체5,19-21 및 암 세포를 감지하기 위해 개발되었습니다. 22 표적 유도 RNA 절단 DNAzymes의 가용성이 높다는 점을 감안할 때, DNAzyme을 활용하는 모든 분석은 잠재적으로 다양한 분석물을 검출하도록 확장될 수 있습니다.
Urease는 요소를 암모니아로 가수분해하는 능력 때문에 선택되며,23,24 pH 증가를 초래합니다. Urease는 또한 매우 효율적이고 안정적이며 다른 생체 분자와의 접합에 적합합니다. 따라서, 우리는 RNA-cleavage DNAzyme과 urease의 접합체가 다른 표적의 검출을 위해 리트머스 테스트를 사용할 수 있다고 가정했습니다. 5 개
RNA 절단 DNAzyme의 작용은 DNAzyme-urease 접합체로 고정되는 자성 비드를 사용하여 urease-mediated pH 증가로 전달됩니다. 조사 중인 DNAzyme의 활성은 E. coli에 엄격하게 의존하기 때문에 테스트 용액에 이 박테리아가 존재하면 자성 비드에서 용액으로 우레아제가 방출된 다음 pH에 민감한 염료가 포함된 리포터 용액에서 요소를 가수분해하는 데 사용됩니다. 이 절차의 최종 결과는 염료 또는 pH 종이에 의해 편리하게 보고될 수 있는 색상 변화입니다.

<table><tbody><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0105</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH) 펠릿</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>SB6789</td><td></td></tr><tr><td>트리스 기반</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0497</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>AMRESCO</td><td>0588</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>VWR AMRESCO</td><td>M123</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1) 솔루션</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>A0007</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>바이오샵 캐나다 Inc.</td><td>SUC507</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>BRO777</td><td></td></tr><tr><td>크실렌시아놀 FF</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X-4126</td><td></td></tr><tr><td>10% 도데실황산나트륨</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>염산(HCl)</td><td>CALEDON LABORATORIES LTD</td><td>6026</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>SOD001</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>바이오샵 캐나다 Inc.</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 (II) 육수화물</td><td>VWR AMRESCO</td><td>0288</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Bioshop Canada inc.</td><td>TW508</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 트리포스파르테 (ATP)</td><td>AMRESCO</td><td>0220</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨 트리하이드레이트 (NaOAc)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>상업용 알코올</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸렌디아민 (TEMED)</td><td>AMRESCO</td><td>0761</td><td></td></tr><tr><td>10% 과황산암모늄 (APS)</td><td>BIO BASIC CANADA INC.</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>숙시니미딜 4-(N-말레미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>22360</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>CALEDON LABORATORIES</td><td>803540</td><td></td></tr><tr><td>Urease</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>U0251</td><td></td></tr><tr><td>1x 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>70011-069</td><td></td></tr><tr><td>0.04% 페놀 레드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액</td><td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 DNA 리가제 반응 완충액</td><td>Bio Basics Canada</td><td>B1122-B</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제(5 U/&#956; l)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>B1122</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB) Broth</td><td>AMRESCO</td><td>J106</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>AMRESCO</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (10 U/&#956; l)</td> <td>Lucigen</td><td>30061-1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli K12 (MG1655)</td> <td>ATCC</td><td>ATCC700926</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>392187</tr><tr><td>유리판</td><td>CBS 과학</td><td>ngp-250nr</td><td></td></tr><tr><td>0.75mm 두께의 스페이서</td><td>CBS 과학</td><td>VGS-0725r</td><td></td></tr><tr><td>12웰 빗</td><td>CBS 과학</td><td>VGC-7512</td><td></td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>UVP</td><td>95-0017-09</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계(NanoVue)</td><td>GE 헬스케어</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>금속판</td><td>CBS 과학</td><td>CPA165-250</td><td></td></tr><tr><td>와류</td><td>VWR International</td><td>58816-123</td><td></td></tr><tr><td>겔 전기 영동 장치</td><td>CBS 과학</td><td>ASG-250</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR International</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa MWCO 원심 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510024</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Bead (BioMag)</td><td>Bangs Laboratories Inc</td><td>BM568</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리 랙</td><td>New England BioLabs</td><td>S1506S</td><td></td></tr><tr><td>마이크로퓨지 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.69</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터(0.22 &#956; m)</td><td>VWR International</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>14ml 배양 튜브</td><td>VWR International</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Eppendorf Scientific</td><td>M13520000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 초음파 세척기</td><td>Branson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>카메라(Canon Powershot G11)</td><td>Canon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 튜브</td><td>VWR International</td><td>89004-364</td><td></td></tr></tbody></table>

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

현장 진료 또는 현장 적용을 위해 특정 병원체를 검출하는 데 사용할 수 있는 간단하지만 여전히 효과적인 방법에 대한 요구가 증가하고 있습니다. 이러한 방법은 사용자 친화적이어야 하며 전문가와 비전문가 모두가 쉽게 해석할 수 있는 신뢰할 수 있는 결과를 생성해야 합니다. pH에 대한 리트머스 테스트는 간단한 색상 변화를 통해 테스트 샘플의 pH를 보고하기 때문에 간단하고 빠르며 효과적입니다. 당사는 박테리아 검출을 위한 리트머스 테스트를 활용하기 위한 접근 방식을 개발했습니다. 이 방법은 박테리아 특이적 RNA 절단 DNAzyme을 활용하여 관심 박테리아를 인식하고 우레아제의 활성을 제어하는 메커니즘을 제공하는 두 가지 기능을 수행합니다. DNAzyme-urease 접합체로 고정된 마그네틱 비드를 사용하여 테스트 샘플에 있는 박테리아의 존재는 비드에서 용액으로의 urease 방출로 전달됩니다. 방출된 우레아제는 테스트 용액으로 옮겨져 요소를 암모니아로 가수분해하여 고전적인 리트머스 테스트를 사용하여 시각화할 수 있는 pH 증가를 초래합니다.

박테리아 리트머스 테스트의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 테스트는 세 가지 핵심 재료인 특정 박테리아에 의해 활성화되는 RNA 절단 DNAzyme, urease 및 자성 비드를 사용합니다. DNAzyme은 표적 박테리아를 매우 특이적으로 검출하기 위한 분자 인식 요소로 사용됩니다. Urease와 자성 비드는 DNAzyme의 RNA 절단 활성을 신호로 변환하기 위해 사용됩니다. 여기에는 urease-DNAzyme 접합체를 포함하는 자성 비드를 제작하는 과정이 포함됩니다. 표적 박테리아가 존재하면 DNAzyme이 RNA 연결 부위를 절단합니다. 이 작용으로 인해 자성 비드에서 urease가 해리됩니다. 방출된 urease는 자성 비드로부터 쉽게 분리될 수 있으며, urea와 pH 민감성 염료가 포함된 리포터 용액에서 색 변화를 일으키는 데 사용됩니다. Urease는 urea를 암모니아로 가수분해하며, 이 과정에서 pH가 상승하여 염료...

RNA 절단 DNAzyme, urease 및 마그네틱 비드를 활용하는 변형 리트머스 테스트를 사용하여 E. coli의 비색 검출 프로토콜을 설명합니다.

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

본 실험의 전반적인 목표는 박테리아 검출을 위한 간단한 변형 리트머스 테스트를 시연하는 것입니다. 이 방법은 E.coli에 의해 활성화된 RNA 절단 DNA 효소가 urease 기반의 신호 전달 플랫폼과 결합하여 E.coli에 반응해 색상 변화를 일으키는 과정을 설명합니다. 이 기술의 두 가지 주요 장점은 테스트의 간편함과 다른 분석물 반응형 RNA 절단 DNA 효소에 적용 가능하다는 점입니다.실험 절차는 McMaster University의 Dr.Yingfu Li 연구실 소속 대학원생인 Seperh Manchehry와 Dingran Chang이 시연하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시약과 완충액을 준비한 후, 1 mg의 SMCC를 676 µL의 DMSO에 녹여 succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate(SMCC) 스톡 용액을 조제합니다. 볼텍싱한 후 사용 전까지 얼음에 보관하십시오.1 mg의 urease를 1 mL의 1x PBS에 녹인 후, 사용 전까지 얼음에 보관하십시오. urease DNA(UrDNA)를 합성하려면, 2.5 mL 마이크로 튜브에 100 µM LD1 10 µL를 넣습니다. 그 다음, 이중 증류수 140 µL와 10x PBS 40 µL를 추가하고 볼텍싱합니다.다음으로, SMCC 스톡 80.5 µL와 DMSO 159.5 µL를 첨가합니다. 그런 다음 다시 볼텍싱하고 벤치탑 원심분리기를 사용하여 짧게 원심분리합니다. 인큐베이터 또는 히트 블록에서 37 °C로 60분 동안 반응물을 배양합니다.배양 후, 튜브에 1x PBS 200 µL, 3 M sodium acetate 60 µL, 그리고 차가운 100% ethanol 1.5 mL를 첨가합니다. 볼텍싱으로 혼합한 후, 반응물을 -20 °C에서 30분 동안 배양합니다. 용액을 20,000 ×g, 4 °C 조건에서 20분 동안 원심분리합니다.그런 다음, 상층액을 제거하고 펠릿을 진공 상태에서 건조합니다. 건조된 펠릿에 urease 스톡 400 µL를 첨가하고 실온에서 5시간 동안 배양합니다. 조제된 접합체 200 µL를 미리 세척한 100,000 분자량 컷오프 원심분리 필터 컬럼으로 옮깁니다.컬럼을 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 남은 200 µL의 조제 접합물(crude conjugate)을 컬럼에 옮기고 14,000 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, 컬럼을 꺼내어 새로운 2 mL 마이크로 원심분리 수집 튜브에 뒤집어서 넣습니다.역방향으로 세운 컬럼과 튜브를 1,000 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브를 제거한 후, 접합체의 추가 회수를 위해 30 µL의 1x PBS를 원심분리 컬럼에 첨가하여 막을 세척합니다. 컬럼을 다시 뒤집어 수집 튜브에 넣습니다.컬럼을 1,000 ×g에서 2분 동안 원심 분리합니다. 컬럼을 제거하여 폐기합니다. UrDNA를 사용 전까지 4 °C에서 보관합니다.E.coli-활성 RNA 절단 DNAzyme(EC1) 및 UrDNA를 자기 비드에 조립하려면, 자기 비드 스톡을 잘 섞은 후 비드 현탁액 100 µL를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮깁니다. 그런 다음, 비드를 분리하기 위해 튜브를 자기 랙 홀더에 놓습니다. 피펫팅으로 상층액을 제거하고 튜브에 150 µL의 결합 버퍼(BB)를 첨가합니다.튜브를 홀더에서 꺼내고 튜브를 조심스럽게 쳐서 비즈가 균질한 용액이 되도록 재현탁합니다. 비즈가 BB 내에 부유된 상태에서 BB 세척을 두 번 더 반복한 후, 10 µM EC1 10 µL를 첨가합니다. 튜브를 쳐서 조심스럽게 혼합합니다.용액을 가볍게 흔들어주며 30분 동안 배양합니다. 비드의 응집을 방지하기 위해 2~3분마다 튜브를 톡톡 쳐줍니다. 다음으로, 마이크로 원심분리 튜브를 다시 마그네틱 랙에 놓아 비드를 분리하고 피펫팅을 통해 상층액을 제거합니다.그런 다음, 150 µL의 BB를 사용하여 비드를 3회 세척합니다. 세척이 완료되면 비드를 총 150 µL의 BB에 현탁합니다. 이 용액에 15 µL의 UrDNA를 첨가하고 시료를 45 °C에서 2분 동안 가열한 후, 용액을 실온으로 냉각시켜 2시간 동안 배양합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 다시 자석 랙에 올려 비드를 분리하고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다.반응 버퍼(reaction buffer, RB) 100 µL를 추가한 다음, 자석 랙에서 튜브를 꺼내 비즈를 조심스럽게 재현탁합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 E.coli 세포를 준비한 후, 1.5 mL 마이크로 튜브에 RB 100 µL를 넣고 볼텍싱하여 사전 세척합니다. 그 다음, 버퍼를 제거합니다. 세척된 튜브에 조립된 EC1 15 µL를 추가하고, 튜브를 자석 랙에 놓은 뒤 상층액을 흡입하여 제거합니다.랙에서 튜브를 꺼내 RB 100 µL를 넣고 마그네틱 비드를 조심스럽게 재현탁합니다. RB를 사용하여 비드를 두 번 더 세척하고 RB를 제거한 후, 튜브에 E.coli 샘플 10 µL를 넣고 튜브를 탭핑하여 내용물을 부드럽게 섞습니다. 그 다음, 반응물을 상온에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 90 µL의 이중 증류수를 첨가하고 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 약 3분간 마그네틱 분리를 수행한 후, 상청액 85 µL를 조심스럽게 0.5 mL 마이크로 튜브로 옮깁니다. 이때 마그네틱 비드가 포함되지 않도록 용액을 매우 주의 깊게 파이펫팅하는 것이 중요합니다.이 비즈들은 유레아제로 충전되어 있으며 위양성 신호를 생성합니다. 0.04% Phenol red 15 µL와 기질 용액 100 µL를 첨가하십시오. 그 후, 특정 시간 간격으로 사진을 촬영하여 색상 변화를 기록합니다.리트머스 시험의 시작 색상은 pH 5.5 미만의 용액 상태를 반영하여 노란색이어야 합니다. 필요한 경우, 리트머스 시험의 시작 pH는 pH 5의 1 mM 아세트산 나트륨 완충액과 같은 약한 완충액으로 조절할 수 있습니다. 이 그림은 E.coli에 의해 활성화된 RNA 절단 DNAzyme EC1을 DNAzyme으로 사용하고 Phenol red를 pH 지시약으로 사용한 박테리아 리트머스 시험의 결과를 보여줍니다.E.coli가 없을 때 색 변화가 나타나지 않는 것으로 보아, EC1은 선택성이 매우 높으며 다른 박테리아에 대해서는 최소한의 활성만을 보입니다. 색 변화의 정도는 DNAzyme 활성화 단계에서 사용된 E.coli 세포 수와 요소 가수분해 단계에 주어진 시간 모두에 의존합니다. E.coli 세포 수가 많을수록 색 변화가 더 강하게 나타나며, 요소 가수분해 시간이 길어질수록 더 적은 수의 세포를 검출할 수 있습니다.이 그래프는 휴대용 pH 미터를 사용하여 모니터링한 pH 변화를 보여줍니다. 10⁷개의 E.coli 세포가 존재했을 때, 10분 이내에 pH가 3단위 점진적으로 증가했습니다. 반대로, E.coli가 없는 경우에는 동일한 조건에서 pH 변화가 감지되지 않았습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, urease의 활성이 매우 높으므로 세척이 불충분하거나 오염이 발생하면 위양성 결과가 나올 수 있음을 유의하는 것이 중요합니다. 이 절차를 마친 후, 환경 수질 검사와 같이 보다 실제적인 조건에서 E.coli를 테스트하기 위해 이 방법을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 E.coli 검사를 위해 간단한 리트머스 시험을 활용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 시험은 매우 위험한 병원성 E.coli를 검출하는 데 사용될 수 있음을 잊지 마십시오. 병원성 박테리아에 대한 모든 시험을 수행하기 전에 생물 안전 교육을 이수해야 합니다.

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여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

배우세요 리트머스 테스트를 수정하여 E. coli를 신속하게 검출하는 방법을 배우세요. RNA 절단 DNA자임과 우레아제 신호 전달을 활용한 분자 진단 기법으로 현장 적용이 가능합니다.

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

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