이 실험의 전반적인 목표는 활성화된 T 세포와의 상호 작용 시 내피 세포 무결성 및 투과성에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 T 세포와 내피 세포 간의 직접적인 상호 작용이 혈액-뇌 장벽 무결성 및 투과성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 신경 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 T 세포와 내피 세포 상호 작용의 표적 조절에 따라 장벽 기능을 실시간으로 자동 평가할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 자가면역 CNS 장애의 치료로 확장되는데, 이는 이러한 질병의 발병에 대한 중요한 단계인 T 세포 매개 혈액-뇌 장벽 파괴에 대한 통찰력을 제공하기 때문입니다. 이 방법은 EAE 중 해양 혈액-뇌 장벽 특성에 중점을 둡니다. 그러나 적색 또는 인간 혈액 뇌 장벽 모델뿐만 아니라 다른 자가면역 CNS 질환에 대한 연구에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 1차 내피 세포 배양과 T 세포 활성화를 결합한 최적의 타이밍에 어려움을 겪을 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 다발성 경화증의 동물 모델인 EAE 동안 혈액-뇌 장벽 특성에 대한 다양한 T 세포 활성화 수준의 영향을 조사하기 시작했을 때 이 방법을 처음 개발했습니다. T 세포 및 내피 세포 공동 배양을 설정하는 것은 웰 간 T의 초기 변동이 이후에 결과를 잘못 표현해야 할 수 있기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

이 절차를 시작하려면 MBMEC 분리 후 5일째에 인서트당 80마이크로리터의 MBMEC 코팅 용액으로 투과성 인서트를 사전 코팅합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3시간 동안 배양합니다. 인서트에서 MBMEC 코팅 용액을 제거한 후 각 웰에 실온 PBS 2ml를 첨가하고 1분 후에 흡인하여 MBMEC를 세척한 다음 이 절차를 한 번 더 반복합니다.

다음으로, 웰당 300마이크로리터에 0.05%트립신 EDTA를 첨가하고 5-10분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 MBMEC 배지를 추가하여 트립신화를 중지합니다. 그런 다음 수집된 세포를 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 샘플을 섭씨 4도에서 8분 동안 700배 g으로 원심분리합니다.

8분 후, 상층액을 버리고 퓨로마이신이 없는 1ml의 MBMEC 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 계수하려면 90 마이크로 리터의 0.04 % trypan blue를 혼합하십시오. 10 마이크로 리터의 세포 현탁액으로, 유리 덮개와 혈구 계 사이의 혼합물 10 마이크로 리터를 피펫으로 만듭니다.

다음으로, 삽입당 네 번째 셀에 10을 두 번 양도합니다. 810마이크로리터의 MBMEC 배지를 각 웰의 하단 격실에 추가하고 TEER 측정을 진행할 준비가 될 때까지 인서트가 있는 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. CD4 양성 T 세포를 자극하기 위해 바닥이 둥글고 둥근 96웰 플레이트를 원하는 최종 농도로 정제된 항마우스 CD3 항체로 섭씨 37도에서 3시간 동안 사전 코팅합니다.

T 세포를 분리한 후 PBS로 사전 코팅된 플레이트를 두 번 세척합니다. 다음으로, 정제된 항-CD28 항체를 원하는 최종 농도로 분리된 T 세포에 첨가하고 잘 혼합합니다. 그런 다음 T 세포를 분리하고 2-3일 동안 섭씨 37도로 둡니다.

TEER 측정을 설정하려면 TEER 기기의 24웰 모듈을 층류 후드에 놓습니다. 뚜껑을 제거하고 겸자를 사용하여 MBMEC가 있는 삽입물을 기기에 놓습니다. 다음으로, 810 마이크로 리터의 신선한 매체를 모듈 웰의 하부 구획에 피펫으로 넣고 인서트와 모듈 웰의 벽 사이에 조심스럽게 추가하십시오.

그런 다음 뚜껑을 닫고 기기를 인큐베이터에 넣으십시오. 기기를 컴퓨터에 연결합니다. 그런 다음 기기 컨트롤러를 켜고 소프트웨어를 엽니다.

팝업 창에서 New Measurement"Check show TER"및 show Ccl" 상자를 선택합니다. 그런 다음 시작을 누릅니다. 첫 번째 측정을 완료한 후 결과 탭에서 모든 웰 확인"을 선택하여 모든 TEER 및 Ccl 값을 확인합니다.

그런 다음 파일을 저장합니다. 다음으로, Ccl이 안정적이고 제곱센티미터당 1마이크로패럿 미만이며 TEER이 최대 수준에 도달했을 때 T 세포와 MBMEC를 공동 배양할 시점을 선택합니다. 절대 TEER 및 Ccl 값을 주의 깊게 검사하고 MBMEC가 이러한 웰의 체크를 해제하여 충분히 단층이 합류하지 않은 웰을 제외합니다.

우물을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 평균 우물에 우물 추가를 선택하여 나머지 우물을 그룹화합니다.팝업 창에서 이름을 지정하고 그룹화할 모든 개별 우물에 대해 동일한 작업을 수행합니다. 그런 다음 모든 평균 웰을 확인하여 모든 웰이 공동 배양 전에 동일한 초기 조건을 갖는지 확인합니다. 실험 탭에서 일시중지를 누릅니다.

기기를 분리하고 인큐베이터에서 꺼냅니다. 그런 다음 층류 후드의 뚜껑을 제거합니다. 그런 다음 상부 웰 격실의 인서트에서 매체의 일부를 제거합니다.

150마이크로리터의 배지를 조심스럽게 피펫팅하여 MBMEC에 T 세포를 추가합니다. 그런 다음 기기를 다시 연결하고 측정 재개를 누릅니다. 24시간이 지나면 실험 탭에서 중지를 누르고 파일을 저장합니다.

다음은 MBMEC 분리 5일 후 PECAM-1 및 Cldn-5의 면역형광 염색에서 방추형 형태를 보여줍니다. 다음은 T 세포를 추가하기 전에 개별 웰을 그룹화하기 전과 후의 TEER 및 Ccl 값입니다. 이 유정의 MBMEC는 다른 유정만큼 TEER이 높게 발달하지 않았기 때문에 실험에 파란색 곡선은 사용되지 않았습니다.

이 실험에서, 마크 35 내지 55 특이적 CD4 양성 T 세포를 5일 동안 항원 특이적 방식으로 자극하였다. 나이브 T 세포와 전염증성 사이토카인, 인터페론 감마 및 TNF-알파는 각각 음성 및 양성 대조군으로 작용했습니다. 여기서, T세포는 동일한 양의 항-CD3 및 항-CD28 항체에 의해 자극되었으며, 3일 동안 배양된 세포는 단 2일 동안 배양된 T 세포에 비해 장벽 파괴 경향이 더 컸습니다.

본 연구 결과는 상층액이 아닌 자극된 T세포가 MBMEC에 상당한 손상을 일으켰음을 보여주며, 이는 T세포와 MBMEC의 직접적인 접촉이 장벽 파괴에 결정적임을 나타냅니다. 반면, T세포 배양에 그랜자임 b 억제제 2를 추가하면 MBMEC 무결성이 크게 회복되었으며, 세포 용해 분자가 MBMEC 손상을 유발하고 이후 TEER 감소를 유발하는 중요한 역할을 한다는 점을 지적합니다. 이 실험은 한 번 마스터하면 제대로 수행되면 12일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 T 세포와 내피 세포의 공동 배양을 설정하기 위한 올바른 시점을 선택하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 면역형광 현미경 검사, 유세포 분석 및 확률 에세이와 같은 다른 에세이를 사용할 수 있습니다. 다음과 같은 추가 질문을 해결하기 위해: 이 상호 작용이 밀접 접합 분자 발현 투과성 및 T 세포 형질전환 정도에 어떤 영향을 미치는가? 개발 후 이 기술은 신경면역학 분야의 연구자들이 생쥐에서 중추신경계의 자가면역 질환을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 혈액-뇌장벽 무결성 및 투과성과 관련하여 활성화된 T 세포와 내피 세포 간의 직접적인 영향을 평가하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.