멀티 플루오르 담즙 산 및 사용

이 절차의 전반적인 목표는 자연적으로 발생하는 비방사성 불소로 담즙산을 라벨링하여 MRI로 담낭 내 담즙산 농도를 측정하여 살아있는 동물의 담즙산 수송에 접근하는 것입니다. 이 접근법은 담즙산 흡수 장애를 치료해야 하는 만성 설사를 앓고 있는 개인을 식별할 수 있는 잠재력이 있습니다. 이 접근 방식의 주요 장점은 전리 방사선에 노출될 필요가 없고 임상 연구와 실습 모두에 대한 큰 번역 잠재력이 있다는 것입니다.

이 방법에 대한 아이디어는 미국에는 장내 담즙산 수송 장애를 감지하기 위한 실용적인 임상 검사가 없다는 것을 알게 되었을 때 처음 떠올랐습니다. 먼저 1밀리리터 주사기에 적절한 양의 불소 표지된 담즙산 원액을 채우고 20게이지, 1.5인치, 곡선형 전구 끝이 있는 위 위 침을 부착합니다. 그런 다음 엄지와 검지를 사용하여 목 뒤쪽의 느슨한 피부로 마우스를 단단히 잡고 나머지 손가락으로 허리와 꼬리의 피부를 잡습니다.

동물을 똑바로 세우고 입의 측면과 천장을 따라 위 바늘을 식도로 통과시키고 위로 내려갑니다. 적절한 실험 종점에서 치골에서 xipoid까지 복부 정중선 절개를 한 다음 복막 내벽을 통해 해당 절개를 하여 횡격막을 뚫지 않고 복부 장기를 노출시킵니다. 다음으로, 5인치 클램프를 사용하여 xiphoid process를 들어 올려 상복부를 노출시킵니다.

겸자와 뭉툭한 도구를 사용하여 간을 절개하고 옆으로 움직여 담낭을 드러냅니다. 그런 다음 총담관을 가로질러 4인치 클램프를 놓고 인대를 절단하여 담낭의 상극을 횡격막에 연결하여 담낭이 복부의 오른쪽으로 이동할 수 있도록 합니다. 간이 열상되거나 부주의로 담낭이 비워지는 것을 방지하기 위해 개복술 후 가능한 한 빨리 총담관을 조심하고 고정하십시오.

출혈 후 적출된 혈액을 1.5ml 헤파린 튜브에 옮겨 원심분리합니다. 아세토니트릴의 4개 부분으로 혈장을 침전시키고 혈액 샘플을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 액체 크로마토그래피와 질량 분광법으로 상층액을 분석합니다.

담낭을 빼내려면 주변 조직을 둔기로 절개한 다음 클램프 아래의 총담관을 절제합니다. 적출된 담낭의 무게를 잰 다음 조직을 1.5ml 미세 원심분리기 튜브에 넣고 간을 제거합니다. 조직을 추출하려면 75%의 아세토니트릴과 25%의 물을 첨가하고 얼음 위의 개별 크기의 21개의 유리 조직 균질화기에서 약 100mg의 간과 전체 담낭을 균질화합니다.

시료를 1.5ml Eppendorf 튜브와 원심분리기로 옮깁니다. 그런 다음 추출물을 적절하게 희석하고 액체 크로마토그래피와 질량 분광법을 사용하여 담즙산 함량을 정량화합니다. 적절한 실험 종료점에서, 마취된 마우스의 왼쪽 안쪽 허벅지 안쪽을 세척하고 24게이지 x 0.75인치 바늘 카테터를 허벅지를 통해 복강으로 피하하 삽입합니다.

바늘을 제거하고 복강 내 카테터를 제자리에 둡니다. 마우스를 MRI 스캐너 동물 침대로 옮기고 온도 조절 열 패드를 부착합니다. 카테터를 72인치 멸균 튜브에 연결하고 튜브를 멸균 1ml 주사기에 연결하여 절차 내내 마취를 유지합니다.

스캐너 근처에 금속이 없는지 확인한 후 불소 양성자 이중 조정 선형 볼륨 MRI 코일을 사용하여 무선 주파수 신호를 송수신합니다. 그런 다음 빠른 로우 앵글 샷 시퀀스를 사용하여 시스템을 보정하고 동물의 위치를 확인하기 위한 세 슬라이스 두피 이미지를 얻습니다. 실험을 시작하려면 신호등 버튼을 클릭하여 샘플의 크로스뷰에서 이완 및 향상 시퀀스를 통한 신속한 획득을 사용하여 다중 슬라이스 양성자 자기 공명 이미지를 획득합니다.

마지막으로, 분광계 제어 도구 창에서 GOP 버튼을 클릭하여 동일한 영역에서 두 번째 빠른 로우 앵글 샷 시퀀스를 사용하여 불소 이미지를 획득합니다. 이 방법을 사용하면 담즙산의 생리학적 수준과 일치하지 않는 간 또는 혈장에서 관찰되는 수준보다 1,000배 더 높은 다중 불소화 담즙산(MFBA)의 고도로 선택적인 농도를 담낭에서 측정할 수 있습니다. 담즙산 장 간 순환의 생리적 연결성에 대해 예상한 바와 같이, MFBA의 최대 담낭 농도는 경구 투여 후 4-7시간 후에 뚜렷하게 나타납니다.

실제로, MFBA 구강 위절 후 2시간 반에서 4시간 후에 총담관으로 보이는 곳에서 나오는 불소 신호와 담낭에서 나오는 더 강력한 신호가 관찰됩니다. 7-8시간 30분이 지나면 총담관 신호가 더 이상 감지되지 않고 담낭 불소 신호가 인접한 MFBA 팬텀에서 나오는 신호와 동일한 강도로 증가합니다. 담즙산의 장 흡수가 감소된 정점 나트륨 의존성 담즙산 수송체 결핍 마우스에서는 통제된 야생형 동물에 비해 MFBA 농도가 약 22배 감소합니다.

실제로, 야생형 마우스의 담낭에서는 강력한 불소 신호가 감지되는 반면, 정점 나트륨 의존성 담즙산 수송체가 결핍된 동물에서는 해당 불소 신호가 없으며, 이는 MFBA가 생리적 담즙산과 유사하게 처리된다는 것과 MFBA MRI를 사용하여 담즙산의 장 흡수 장애를 감지할 수 있음을 확인합니다. 숙달되고 적절하게 수행되면 개복술, 채혈, 담낭 및 간 절개를 20분 이내에 완료할 수 있습니다. MRI 중 신호 획득은 1시간 30분에서 2시간 정도 소요됩니다.

개발 및 상용화 이후, 이 기술은 작은 동물과 인간 모두의 생리학 및 질병에서 장 담즙산 수송의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 외국으로 표시된 담즙산을 작은 동물에게 투여하는 방법과 MRI 또는 장기 절개를 통해 간과 담낭의 담즙산 흡수를 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.