트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

이 절차의 전반적인 목표는 트랜스포존 시스템을 사용하여 쥐 양수 세포를 분리하고 재프로그래밍하는 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 쉽게 수행 할 수 있다는 것입니다. 치료 환경에서 인간 질병 태아의 세포는 출산 전에 환자 특이적 치료를 다른 방법으로 준비하기 위해 약물 검사 또는 조직 공학을 위한 관심 세포로 분화될 수 있습니다.

이 방법은 프로그래밍의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 트랜스포존 시스템은 다양한 세포 유형에서 효율적입니다. 바이러스 벡터와 관련된 임상적 접근에 더 적합하며 oxino-free IPS 세포를 생산할 수 있습니다.

격리를 시작하려면 70% 에탄올을 사용하여 댐의 복벽을 청소하십시오. 가위를 사용하여 복강에 접근할 수 있도록 복벽의 길이를 절개하여 정중선 개복술을 수행합니다. 집게를 사용하여 자궁을 드러낸 다음 가위로 절제합니다.

멸균 100xPBS로 채워진 1mm 접시에 자궁을 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 접시를 10X 배율의 실체 현미경 아래에 놓고 집게로 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거하면서 태아막이 손상되지 않도록 주의합니다. 멸균 1XPBS로 채워진 100mm 접시에 태아를 모아 얼음 위에 놓습니다.

한 태아의 태반을 미세한 포인트 겸자로 잡고 깨끗한 100mm 접시에 옮깁니다. 여기에서 노른자 자루를 조심스럽게 제거하십시오. 겸자와 인슐린 주사기를 사용하여 양막을 방해하고 30마이크로리터의 양수를 수집합니다.

유체를 15ml 원뿔형 바이알에 옮깁니다. 각 태아에 대해 이 과정을 반복하여 매번 같은 바이알에 액체를 모읍니다. 다음으로, 1%의 소 태아 혈청이 보충된 멸균 1XPBS로 각 태아를 씻고 이를 양수와 함께 15ml 원추형 튜브에 모읍니다.

를 145배 G에서 5분 동안 원심분리한 다음 층류 후드 아래에서 상층액을 제거합니다. 펠릿화된 세포를 2ml의 양수 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 마이오마이신-C 처리된 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF가 포함된 0 포인트 1% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트를 취한 다음 플레이트에 2ml의 세포를 시드합니다.

섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 세포를 배양하고 격일로 배지를 바꿉니다. 세포가 transfection할 준비가 될 때까지 7일 동안 배양을 계속합니다. transfection을 시작하려면 1 point five millimiter microcentrifuge tube에서 1 microgram의 transposon plasmid와 zero point 5 microgram의 transposase 발현 플라스미드 및 0 point 5 microg의 reverse tetracycline transactivator plasmid를 혼합합니다.

d-man을 사용하여 100마이크로리터로 희석합니다. DNA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 8마이크로리터의 transfection 시약을 추가합니다. 이 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.

마우스 AF 세포가 있는 6개의 웰 플레이트를 취하여 웰당 100마이크로리터의 형질주입 제제 DNA 혼합물을 적가하고 웰당 2ml의 최종 부피로 완만한 소용돌이로 분배합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 5%의 이산화탄소에 그대로 두십시오. 다음 날, 배양 배지를 제거한 다음 Yamanaka의 인자의 발현을 유도하기 위해 독시사이클린 1밀리리터당 5마이크로그램이 보충된 2밀리리터의 신선한 iPS AF 배지를 세포의 각 웰에 공급합니다.

이 시점부터 통과하지 않고 신선한 dox 함유 배지를 매일 세포에 공급합니다. 첫 번째 독시실신 처리 후 24시간 이내에 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 mCherry 발현을 찾고 이 시점부터 매일 집락 형성을 확인합니다. 콜로니 형성이 관찰되면 단일 콜로니를 50마이크로리터의 세포 배양 배지로 선택합니다.

다음으로, mytomycin c 처리 MEF가 있는 96웰 조직 배양 플레이트의 별도 웰로 순차적으로 옮깁니다. 다음 날, 각 웰에 50마이크로리터의 트립신을 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 콜로니를 단일 세포로 해리합니다. 배양 후 액체를 위아래로 피펫으로 주입하여 군체를 추가로 분해합니다.

50마이크로리터의 트립신 세포 혼합물을 불활성화된 MEF를 포함하는 새로운 웰로 옮긴 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 세포가 60-70% 합류점에 도달하면 24웰 플레이트의 새로운 웰로 분리한 다음 실온에서 배양을 계속합니다. 이 세포가 60-70% 합류점에 도달하면 세포를 1-2개의 웰로 뒤집어 하나는 독시사이클린을 포함하고 다른 하나는 독시사이클린이 없는 상태에서 콜로니가 성장하는지 확인합니다.

활성화된 MEF에서 IPS AF 콜로니와 독시사이클린 독립 배지를 5% 이산화탄소 중 섭씨 37도에서 계속 유지합니다. 세포가 염색, 이미징 및 RNA 추출을 위해 준비될 때까지 배지를 매일 교체하십시오. 여기서, 안정적인 독시사이클린 독립 유도 흉막 화능 마우스 GFP 양성 세포는 성공적인 재프로그래밍을 확인하는 데 필요한 흉막 분화능 마커를 발현합니다.

R1 ES 세포를 대조군으로 사용한 RTPCR 분석은 독시사이클린의 유무에서 유도된 흉막 분화능 마커의 발현을 보여주었습니다. 하우스키핑 유전자인 베타 2 마이크로글로불린(beta two microglobulin)의 발현도 세 가지 세포 유형 모두에서 관찰되었습니다. 유도된 다능화 세포를 주입 한 마우스에서 분리 된 기형 종은 면역 염색되었습니다.

알파 태아 단백질, 알파 평활근 액틴 및 베타 3 튜불린이 덩어리에서 검출되면 세포가 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세 가지 배아층 모두로 분화되었음을 확인할 수 있습니다. 또한, 체외 배아체 및 생체 내 기형종 세포의 RTPCR 분석은 중배엽, 내배엽 및 외배엽에 대한 생식층 특이적 마커 유전자의 발현을 확인합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 양수 세포를 분리하고 다시 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이것은 일상적인 진단 또는 제왕 절개에서 얻은 샘플에서 인간 양수 세포에도 적용할 수 있는 간단하고 안전한 절차입니다.