Name: 트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 마우스 양수 세포에서 트랜스포존 시스템을 이용한 유도만능줄기세포 제조 방법을. 비바이러스 방식으로 재생의학 및 환자 맞춤 치료에 활용할 수 있는 안전하고 효율적인 기술입니다.

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이 작업은 CARIPARO 재단 보조금 번호 13/04 및 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza 보조금 번호 10/02의 지원을 받았습니다. 마르티나 피콜리(Martina Piccoli), 키아라 프란진(Chiara Franzin), 미켈라 포조본(Michela Pozzobon)은 Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza의 지원을 받습니다. 엔리카 베르탱(Enrica Bertin)은 카리파로 재단(CARIPARO Foundation) 보조금 번호 13/04의 지원을 받습니다. Paolo De Coppi는 Great Ormond Street Hospital Children's Charity에서 자금을 지원합니다.

모든 절차 이탈리아 법에 따라했다. 쥐의 AF 샘플은 GFP라는 C57BL / 6-Tg는 (UBC-GFP) 30Scha / J 마우스에서 13.5 일 후 교미 (DPC)에서 임신 한 쥐에서 수확했다. 1. 트랜스포존 생산 주 : 트랜스포존 발현 벡터는 표준 클로닝 방법을 사용하여 생성 하였다. 마우스 AF 세포 형질 전환 용 플라스미드 DNA 상업용 키트를 사용하여 제조 하였다. <ol><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 DH5α 박테리아의 50 μL와 플라스미드 DNA 10ng의 섞는다. 20 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 품어. </li><li> 40 초 동안 42 ° C에서 열 충격. </li><li> 2 분 동안 얼음에 microcentrifuge 관을 놓습니다. </li><li> 미리 예열 (37 ° C) 원성 국물 (LB) 배지 250 μl를 추가합니다. 30 분 동안 37 ℃ (300 RPM)를 흔든다. </li><li> 0.1 ㎎ / ㎖ 앰피 실린와 LB 플레이트에 각 변형의 30 μl를 확산. 판 건조, 37 ° C 오븐에서 반전 품어 허용ernight. </li><li> 다음날, 오후에, 각각의 변환에서, 멸균 200 μl의 팁을 사용하여, 3 식민지를 선택하고 0.1 ㎎ / ㎖ LB 앰프에 전송합니다. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 (300 RPM) 박테리아를 흔들어. </li><li> 플라스미드 정제 용 상용 장비를 사용합니다. -20 ° C에서 스톡 플라스미드. </li></ol> 2. 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 문화 <ol><li> 0.1 % 젤라틴과 6 웰 플레이트의 코팅 <ol><li> 여섯 개의 우물 각 멸균 0.1 % 젤라틴 1 ㎖를 추가 후드 코트 판. 젤라틴 1 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C)를 중합 할 수 있습니다. </li><li> 초과 폐기하고, 1 시간 동안 접시를 건조. </li><li> 실온에서 저장 판을 밀봉하고 파라 필름을 사용합니다. </li></ol></li><li> 미토 마이신 C와 MEF의 불 활성화 <ol><li> 37 ° C 조를 이용하여 4 × 10 6 MEF 세포의 병을 해동. </li><li> MEF 매체와 페트리 접시 (150mm)의 후드에서 MEF을 시드. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2에서 세포 배양. </li><li> (주) 세포가 합류 있습니다 마이 토마 이신 C (5 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터에 장소 세포 (37 ° C와 5 % CO 2) 3 시간 동안. </li><li> 마이 토마 이신 C를 세척 세포와 1 배의 인산 완충 식염수 (PBS)로 3 회 매체를 제거합니다. </li><li> 5 분 동안 37 ° C 배양기에 상업 트립신과 장소 세포 2 ㎖를 추가합니다. 후, 트립신 반응을 정지 매체를 차단 18 ml에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 BURKER 챔버를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 5 분 145 XG에 원심 분리기 세포. 상층 액을 버린다. </li><li> 씨앗 60,000 세포 / 0.1 % 젤라틴 코팅 접시에 불 활성화 MEF의 cm 2. </li><li> AF 및 / 또는 AF-만능 줄기 세포를 파종 전에, 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 세포를 배양. </li></ol></li></ol> 3. 마우스 AF 세포 분리 <ol><li> 시간 제한 교배를 설정하고 질 PLU를 확인공동 주택의 24 시간 후 GS. </li><li> 13.5 DPC 때까지 관찰하고 자궁 경부 전위를 통해 임신 댐을 희생. </li><li> 70 % 에탄올을 사용하여 동물의 복부 벽을 청소한다. </li><li> 가위를 사용하여 복강에 접근하기 위해 복부 벽의 길이를 절개 정중선 개복을 수행한다. </li><li> 집게를 사용하여 자궁을 노출. 1X PBS 얼음에 배치 멸균 가득 100mm 배양 접시에 가위 및 전송을 사용하여 자궁을 제거합니다. </li><li> 10 배 배율에서 AF를 수집하는 실체 현미경을 사용합니다. </li><li> 집게와 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거합니다. 태아 막과 그에 따른 양수 누수에 손상을 피하기 위해주의해야합니다. </li><li> 멸균 1X PBS로 가득 100mm 배양 접시에 태아를 수집하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 깨끗한 100mm 페트리 접시에 좋은 점 집게와 장소 하나 태아의 태반을 잡고. </li><li> 좋은 점 집게를 사용 골목 노른자를 제거합니다. </li><l난&gt; 좋은 점 집게를 사용하여 양막을 방해하고 15 ML 원뿔 유리 병에 인슐린 주사기를 사용하여 각 태아에 대한 AF의 30 μl를 수집합니다. </li><li> AF 컬렉션 후, 1 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 멸균 1X PBS로 각 태아 세척하고, 15 mL의에 AF를 함유하는 원뿔형 튜브를 수집한다. </li><li> 5 분 145 XG에 원심 분리기 AF. 후드 뜨는을 제거하고 펠렛 AF 세포를 시드. </li></ol> 4. 마우스 AF의 세포 배양 <ol><li> 마우스 AF 세포의 파종 <ol><li> 어느 날 전에 시드로, 마이 토마 이신 C 처리 MEF와 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트를 준비합니다. </li><li> AF 컬렉션 후, AF 배지를 사용하여 (약 1 × 10 7 세포는 태아에서 얻은 6)를 비활성화 mitotically MEF 상으로 양수로부터 얻은 세포를 시드. </li><li> 매일 매체를 변경, 37 ° C와 5 % CO 2에서 세포를 배양. </li><li> 문화 7 일, 트랜스 후아래에 설명 된 절차에 따라 AF에는 영향 셀. </li></ol></li></ol> 5. 형질, 만능 줄기-AF 세포 생성 및 문화 주 : 마우스 AF 세포 (PB-CAG-rtTA) 트랜스포존 플라스미드 트랜스 발현 플라스미드 (mPBase)과 관련하여 역방향의 테트라 사이클린 transactivator 더불어 PB-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포존 플라스미드로 형질 감염시켰다. 모든 플라스미드는 교수 안드라스 나기 (33)에 의해 제공되었다. <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 (2 μg의 전체 DNA) 0.5 mPBase의 μg의 0.5 PB-CAG-rtTA의 μg의와 PB-tetO2-IRES-OKMS 1 μg의 혼합. </li><li> 무 혈청 배지 100 μL (- DMEM 둘 베코 변형 이글 배지)로 DNA를 희석. </li><li> (플라스미드 DNA의 비율로 8 μL 형질 제 2 μg의 (DNA)의 형질 전환 제) (예를 들면, 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene) 형질 감염 시약 8 μL를 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 관 함유하는 DNA로. </li><li> 실온에서 15 분 동안 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 인큐베이션. </li><li> / 웰이 용액의 최종 부피 마우스 AF 세포를 6 웰 플레이트에 웰 당 형질 감염 시약 / DNA 혼합물을 100 μL를 적하 첨가하고 완만 한 소용돌이로 배포한다. 24 시간 동안 둡니다. </li><li> 하루 후, 독시사이클린 1.5 μg의 / ㎖ (각 웰에 대한 미디어 2 mL)으로 보충 된 신선한 만능-AF 배지로 세포를 공급하여 야마나카의 인자 (인 Oct4, Klf4, cMyc, Sox2이)의 발현을 유도한다. </li><li> 신선한 DOX 함유 배지 (포인트 5.13까지 독시 싸이클린 보충 미디어에서 세포를 유지)를, 통과하지 않고, 매일 세포를 공급. </li><li> mCherry 발현 24 시간 이내에 매일 콜로니 형성 (식민지는 일반적으로 형질 전환 후 20 30 일 사이에 표시)에 대한 세포를 관찰한다. </li><li> 하루 콜로니 피킹 전에, 마이 토마 이신 C 처리 된 MEF가있는 96- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. </li><li> 볼륨 날기의 50 μL에 하나의 식민지를 선택GA 200 μL 피펫, 개별 웰에서 96 웰 플레이트로 순차적으로 전달. </li><li> 하루 후, 상용 트립신의 50 μL를 추가하여 하나의 셀에 각 콜로니를 해리하고, 37 ℃에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 식민지를 해리하는 아래로 피펫합니다. </li><li> 독시 싸이클린 보충 신선한 만능 줄기-AF 매체의 100 μL 가득 96 웰 플레이트 코팅 된 0.1 % 젤라틴에 불 활성화 MEF와 새로운 잘으로 해리 식민지를 포함하는 트립신의 양도 50 μL. </li><li> 세포를 60-70 %의 컨 플루 언스에 도달하면, 24 웰 플레이트의 웰에 나누어. </li><li> 식민지 독시 싸이클린없는 상태로 나타날 경우 확인이 우물, 독시사이클린없이 독시사이클린 한 다른, 2 : 세포가 60-70%의 합류에 도달하면 1 분할. </li><li> IP에-AF 매체에 불 활성화 MEF에, 독시사이클린 독립적 인 만능 줄기-AF 클론을 유지하기 위해 계속합니다. </li><li> 채널 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양매일 매체를 anging. </li></ol> 6. 알칼리성 포스파타제 염색 <ol><li> 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이있을 때마다 제조사의 프로토콜은 다음 알칼리성 포스파타제 염색을 수행한다. </li></ol> 7. 면역 형광 <ol><li> 독시사이클린 독립적 만능-AF 세포의 모양이 될 때마다, 비활성 MEF있는 24 웰 플레이트의 웰에 150,000 세포 / cm 2 시드, 37 ° C, 5 % CO 2에서 48 시간 동안 세포를 성장한다. </li><li> (주의)을 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 웰 당 300 μl를 첨가하여 세포를 고정. </li><li> 0.1 % NP-40 Permeabilize 하시려면하는 세포 300 μl를 추가합니다. </li><li> 0.1 % PBS-트윈 20의 300 μL로 세포를 씻어. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 차단 완충액 (PBS 1X 10 % 말 혈청) 300 μL를 추가한다. </li><li> (1:10 인 Oct4 (1:80), Sox2이 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog를 다음 일차 항체를 사용하여0)과 SSEA1 (1:80). 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청으로 희석 SSEA1 0.3 M 글리신, 0.1 %의 PBS-트윈 -20. 1X PBS 10 % 말 혈청과 다른 모든 항체 희석. </li><li> 4 ℃에서 밤새 항체를 품어. </li><li> 0.1 % PBS-트윈-20의 300 μl를 씻어. </li><li> 1X PBS에서 10 % 말 혈청 희석 보조 항체를 사용 Alexa594 결합 염소 항 - 마우스 IgG (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭고기 방지 염소 IgG를 (1 : 200), Alexa594 - 복합 닭 항 - 토끼 IgG의를 (1 : 200) Alexa568 결합 염소 항 - 마우스 IgM의 (1 : 200). 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 1X PBS로 씻어. </li><li> 1X PBS에서 : 훽스트 용액 (10,000 1)와 얼룩 핵. </li></ol> 체외 세포 분화 8. <ol><li> 매달려 드롭 배아 체 (사채)을 형성, 분화 배지를 사용하여 배양 접시의 뚜껑에 (2,000 세포 / 20 μL) 한 방울을 육성. </li><li> 37 ° C에서 요리를 품다4 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 분화 배지에서 3 일간 현탁 배양에 100mm 박테리아 수준의 요리로 사채를 전송합니다. </li><li> 또 다른 14 일간 (DMEM에서 1:10 희석) 기저막 행렬로 코팅 된 24 잘 번호판 플레이트 사채. </li><li> T (1 : 100), αfp (1 : 200) 및 Tubb3 (1 : 500) 37 면역 형광 분석의 경우, 일차 항체를 사용합니다. </li></ol> 9. 생체 기형 종 형성 <ol><li> - / - γC - / - 생쥐 Rag2의 사지의 근육에 1 × 10 6-AF 만능 줄기 세포를 포함하는 1X PBS 100 ㎕를 주입한다. </li><li> 육주 세포 주입 후 자궁 전위를 통해 쥐를 희생. </li><li> 다음과 같은 분석을위한 쥐의 뒷다리에서, 크기에 의해 구별 종양 덩어리를 제거합니다. </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 이소 펜탄 냉동 종양의 7 ~ 10 μm의 두께 횡단면을 잘라. </li><li> 헤 마톡의에 대한D의 에오신 (HE) 얼룩 : <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 종양 조직 구성을 평가하는 HE와 얼룩. </li></ol></li><li> immunoperoxidase 얼룩의 경우 : <ol><li> 실온에서 15 분 동안 4 % PFA로 기형 섹션을 고정한다. </li><li> 0.1 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면. </li></ol></li><li> 다음 항체와 인큐베이션 : Tubb3 (1 : 100) αfp (1시 50분) 및 αSMA (1 : 100) 1X PBS에 1 % BSA에서 희석한다. 1 (Tubb3 용) 37 ° C에서 시간 또는 밤새 4 ° C에서 (다른 항체)에 대한 품어. </li><li> 20 분 동안 100 % 메탄올을 사용하여 블록 옥시다아제. </li><li> 37 ° C에서 45 분 동안 품어 HRP - 복합 (1 : 150) 이차 항체 항 - 마우스는. </li><li> 1X PBS로 씻어. </li><li> 5 분 동안 퍼 옥시 다제 (HRP) 기판 (재료 표 참조)에 품어. </li><li> 5 분 동안 수돗물로 씻어. </li><li> 9 초 동안 헤 마톡 QS로 얼룩. </li><li> 수돗물로 씻어. </li></올&gt; 세포에서 10 RNA 추출 <ol><li> 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용합니다. </li></ol> 기형 종에서 11 RNA 추출 <ol><li> 샘플을 해동 피하기 위해 봉과 박격포와 액체 질소를 사용하여 기형 종을 균질화. </li><li> 조직의 25 mg의 무게. </li><li> RNA 추출을위한 상용 시약 1 mL의 클로로포름 200 μL를 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 인큐베이션. </li><li> 13,000 XG에 원심 분리기 15 분 동안 4 ° C. </li><li> 새로운 튜브에 클리어 뜨는을 전송합니다. </li><li> RNA의 제조 업체의 프로토콜에 따라 상업 RNA 추출 키트를 사용 정화합니다. </li></ol> (12) 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 분석 <ol><li> 역전사 (RT) -polymerase 연쇄 반응 (PCR)과 올리고 (DT) 코르위한 역전사 효소를 이용하여 제 1 가닥 cDNA의 합성제조 업체의 프로토콜 땡은 50 NG / cDNA를 μL을 얻었다. 10 NG / μL의 농도의 RNase없는 물과 cDNA를 희석. </li><li> RT-PCR은 1 NG를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA 폴리머 라 아제를 사용하여 수행 / μL의 cDNA. </li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

능성의 유도를 얻기 위해 선택된 방법은 장기 이식에 대한 임상 세포의 안전을 위해 적합하다. 요즘 프로그래밍에 적합한 여러 가지 방법이 있습니다. 비 통합 방법 중에서, 센다이 바이러스 (SEV) 벡터는 감염된 세포의 핵 (40)로 통합하지 않고 대량의 단백질을 생산할 수 및 만능 줄기 세포를 수득하기위한 전략 될 수있는 RNA 바이러스이다. SEV 벡터는 병진 급 IPS 세포의 생성을위한 매력적인 후보가 될 수 있지만, 몇 가지 단점을 나타낸다. 리플리 바이러스는 유전자 서열의 특성에 민감하다. SEV 벡터가 구조적으로 복제하기 때문에, 서로 다른 전략이 측면 (41), (42)을 개선하기 위해 사용되는 경우에도, 숙주 세포로부터 제거하기 어렵다. 이 같은 레벨 2 생물 안전 캐비닛 등의 특수 처리가 필요합니다. 이 전하나의 상용 공급 업체가 사용할 수에요. 프로그래밍에 대한 임...

산전 진단은 유전 질환 (즉, 염색체 이상, monogenetic 또는 인성 / polygenetic 질환)과 선천성 기형 (즉, 선천성 횡격막 탈장, 낭포 성 폐 병변, exomphalos, 배벽 갈림 증)을 평가하는 중요한 임상 도구입니다. 양수 (AF) 세포는 임신의 두 번째 임신 중 정기적으로 예약 절차에서 획득하는 간단한 (즉, 양수 천자 및 amnioreduction) 또는 제왕 절개 섹션 1, 2입니다. 태아 또는 신생아 환자 AF 세포의 이용은 재생 의학이 소스를 사용할 수있는 가능성을 제공하고, 여러 연구자들은 AF 3, 4, 5, 6에서 분리 된 줄기 세포 집단을 사용하여 서로 다른 조직 손상 또는 질환을 치료하는 가능성을 조사7, 8, 9, 10, 11, 12. 쉽게 질병들은 종종 고정 된 시간 윈도우에서 질병 환자 AF 셀을 획득 할 가능성은 프로그래밍 목적이 셀 소스를 사용하는 아이디어에 방법을 연다. 실제로, AF 세포로부터 유래 된 유도 다 능성 줄기 (IPS) 세포는 출산 전에 적절한 환자 별 치료를 준비하기 위해, 시험관 내 약물 검사 또는 조직 공학 방법에 대한 관심의 세포 분화 될 수있다. 많은 연구가 이미 AF 세포의 능력은 세포 형태 13, 14, 15, 16, 17 &lt;넓은 범위로 재 프로그램과 차별화 될 입증/ SUP&gt; 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. 네 개의 전사 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)의 강제 표현을 통해 다카하시 및 재 프로그램 체세포의 야마나카 (28)에 의해 발견 이후, 진행 프로그래밍의 분야에서했다. 다른 방법을 고려하여, 우리는 바이러스 및 비 - 바이러스 성 방법을 구별 할 수있다. 첫번째 부분 재 프로그램 세포주의 결과와의 위험 모두 고효율이지만 레트로 바이러스 유전자 보통 불완전 침묵을 가질 바이러스 벡터 (레트로 바이러스 및 렌티 바이러스)의 사용을 예상삽입 성 돌연변이 29, 30, 31. 즉, 플라스미드 벡터, mRNA의 단백질, 트랜스포존 : 비 - 바이러스 성 방법은 다른 전략을 사용한다. 유전자 서열의 무료 만능 줄기 세포의 유도는 새는 유전자 발현 및 삽입 성 돌연변이 유발의 잠재적으로 해로운 영향을 회피하는 것을 목표로하고있다. 위에서 언급 한 모든 비 바이러스 전략 중, 피기 백 (PB) 트랜스포존 / 트랜스 시스템은 삽입 또는 절제 이벤트 (32)을 촉매하는 유전자와 트랜스 효소의 일시적인 발현을 측면에만 역전 된 말단 반복을 필요로한다. 만능 줄기 세포의 생성을위한 다른 방법을 통해 트랜스포존을 사용의 장점은 레트로 바이러스 벡터의 동일 효율을 나타내는 비 - 바이러스 벡터 방식 벡터 프리 만능 줄기 세포를 얻을 수 있다는 것이다. 이것은 reprogr위한 통합 트랜스포존 인코딩 트레이스 이하로 절단 할 수있다만능 줄기 세포 (33)의 트랜스의 새로운 일시적 발현 다음과 같은 요소를 amming. PB가 다른 세포 유형 34, 35, 36, 37 효율적임을 감안할 때, 바이러스 벡터에 대한 임상 적 접근 방식에 더 적합하며, 생체이 물을 사용하여 현재의 바이러스 생산 프로토콜 달리 이종없는 만능 줄기 세포의 생산을 허용 조건은,이 시스템은 뮤린 AF에서 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 사용된다. 여기에서 우리는 마우스 AF 세포 (IPS-AF 세포) (38)로부터 만능 만능 줄기 클론의 생산을 보여주기 위해 이미 게시 작업을 다음과 같은 세부적인 프로토콜을 제안한다.

<table><tbody><tr><td>100mm 세균 등급 페트리 접시&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td>in vitro 차별화</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체</td></tr><tr><td>Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21043</td><td>2차 항체 (면역형광)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21468</td><td>2차 항체 (면역형광)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21442</td><td>2차 항체 (면역형광)</td></tr><tr><td>Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td>2차 항체 (면역형광)</td></tr><tr><td>알칼리성 인산분해효소 키트&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>85L1</td><td>알칼리 인산가수분해효소&nbsp; 염색</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>세균 선택용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>BSA, 블로킹 솔루션용. RNA</td></tr> 추출 DH5&alpha; 세포용 PBS 1x <tr><td>클로로포름</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr>에 희석 <tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18265-017</td><td>클로닝 절차를</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 위한 박테리아 <tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965039</td><td>MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 배지용</td></tr><tr><td>독시사이클린&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D9891</td><td>외인성 인자 발현용</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 ml)&nbsp;</td><td>사르스테트&nbsp;</td><td>72.706</td><td>PB 생산의 경우&nbsp;</td></tr><tr><td>ES FBS&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10439024</td><td>마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체</td></tr><tr><td>FBS용&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>MEF 매체용</td></tr><tr><td>세밀한 포인트 펜치</td><td>F.S.T</td><td>Dumont #5&nbsp;</td><td>AF 절연</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>J.T.Baker</td><td>131</td>은 PBS 1x Glycine Bio-Rad 161-0718<td>에 희석 된 0.1 %</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>를 사용하여 차단 용액을 사용했습니다. PBS 1x</td></tr><tr><td>Haematoxylin QS</td><td>Vector Laboratories</td><td>H3404</td><td>핵 검출</td></tr>에 희석됨<tr><td>;</td><td>Bio-Optica</td><td>04-061010</td><td>기형종 Hoechst의 조직학적 분석</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>핵 검출</td></tr><tr><td>말 혈청&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td>차단 용액</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>SantaCruz</td><td>sc2005</td><td>보조 항체 (immunoperoxidase)</td></tr><tr><td>ImmPACT NovaRED&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK4805</td><td>Peroxidase substrate</td></tr><tr><td>Insulin syringe with needle (25 G)</td> <td>Terumo</td><td>SS+01H25161</td><td>양수천자 절차</td></tr><tr><td>Klf4&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-20691</td><td>토끼 다클론 IgG</td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030</td><td>마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체</td></tr><tr><td>LB 브로스 (Lennox)</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>세균 성장</td></tr><tr><td>LIF&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L5158</td><td>마우스 AF 및 iPS-AF 세포용</td></tr><tr><td>매체 Matrigel&nbsp;</td><td>BD</td><td>354234</td><td>in vitro 차별화를 위해. DMEM에서 1:10으로 희석됨</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>Peroxidase 차단</td></tr><tr><td>MULTIWELL 24 웰 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td>in vitro 분화를 위해</td></tr><tr><td>MULTIWELL 6 웰 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td>MEF, 마우스 AF 및 iPS-AF 세포 배양</td></tr><tr><td>Nanog&nbsp;</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0002P-F</td><td>토끼 다클론 IgG</td></tr><tr><td>비필수 아미노산&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S2000</td><td>차단 솔루션용. PBS 1x</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>12087-87-0</td>에 희석됨 <td>세포 투과화용. PBS 1x</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>SantaCruz</td><td>sc-5279</td><td>마우스 단클론 IgG2b</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligo (dT)에 희석됨&nbsp;</td><td></td><td>RT-PCR</td><td></td></tr> <tr><td>파라포름알데히드(용액)</td>용 <td>Sigma</td><td>441244</td> PFA용 Thermo Fisher Scientific 18418012, <td>고정성,</td></tr><tr><td>PBS PBS 10x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td>D-PBS, Ca2+/Mg2+ 없음. PBS 1x 페니실린을 얻기 위해 멸균수로 희석됨</td></tr><tr><td>- 스트렙토마이신;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15070063</td><td>MEF, 마우스 AF, iPS-AF 세포 및 분화 매체</td></tr><tr><td>페트리 디쉬 (150 mm)</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF 배양, 조직 배양</td></tr><tr><td>PiggyBac transposase 발현 플라스미드&nbsp;</td><td>Andras Nagy 교수 제공 연구실</td><td>-</td><td>mPBase</td></tr><tr><td>PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS 트랜스포손 플라스미드</td> 제공<td>: Andras Nagy 연구실</td> <td>-</td><td>PB-tetO2-IRES-OKMS</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td>플라스미드 정제용</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>플라스미드 정제용</td></tr><tr><td>역 테트라사이클린 트랜스액티베이터 트랜스포존 플라스미드&nbsp;</td><td>교수 Andras Nagy 실험실</td><td>-</td><td>rtTA</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit&nbsp 제공;</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA 추출용</td></tr><tr><td>Sox2&nbsp;</td><td>SantaCruz</td><td>sc-17320</td><td>염소 다클론 IgG</td></tr><tr><td>SSEA1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>마우스 단클론 IgM</td></tr><tr><td>SuperScript II 역전사효소&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18064-014</td><td>RT-PCR</td></tr><tr><td>T&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab20680</td><td>토끼 다클론 IgG</td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Thermo Fisher Scientific 10342020</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>세포 배양 패스에이징</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-047</td><td>세포 투과화용, PBS 1x</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td>에 희석 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596-026</td><td>RNA 추출</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubb3&nbsp; &nbsp;</td><td>프로메가&nbsp;</td><td>G712A</td><td>마우스 단클론 IgG1</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>세포 투과화용, PBS 1x&alpha에 희석;</td></tr><tr><td> FP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1368</td><td>마우스 단클론 IgG1</td></tr><tr><td>&알파&SMA&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>마우스 단클론 IgG2a</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트랜스펙션 시약 (FuGENE HD)</td><td>Promega&nbsp;</td><td>E2311</td><td>AF 세포 형질 주입</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>양수천자를 수행하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &뮤; l 팁</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>70.760012</td><td>박테리아 군집을 선택하기 위해</td></tr><tr><td>가위</td><td>F.S.T</td><td>14094-11 스테인리스 25U</td><td>양수 천자를 수행하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마</td><td>2860</td><td>임산부 댐의 복벽을 청소하기 위해</td></tr><tr><td>조직 배양 페트리 접시 (150mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td>MEF 확장용</td></tr><tr><td>미토마이신 C</td><td>Sigma</td><td>M4287-2MG</td><td>MEF 비활성화용</td></tr><tr><td>MULTIWELL 96 웰 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353071</td><td>iPS-AF 배양용</td></tr></tbody></table>

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

유도만능줄기세포(iPS)는 서로 다른 방법을 사용하여 정의된 전사 인자의 강제 발현에 의해 마우스 및 인간 체세포에서 생성됩니다. 여기서, 우리는 비바이러스 기반 트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 iPS 세포를 생산했습니다. 얻어진 모든 iPS 세포주는 in vitro 및 in vivo에서 3개의 생식층의 유도체로 분화하는 능력을 포함하여 만능 세포의 특성을 보였습니다. 이 전략은 선천적 결함에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위해 병에 걸린 태아의 세포를 사용할 수 있는 가능성을 열어줍니다.

프로그래밍의 능력을 평가하기 위해 마우스 AF 세포를 GFP 마우스의 태아로부터 수집 하였다. 세포는 솔더 (Soler) (a 독시사이클린 - 유도 방식으로 mCherry 형광 단백질에 연결된 야마나카 인자 (인 Oct4, Sox2이, cMyc 및 Klf4)를 나타내고, 원형 트랜스포존 플라스미드 PB-tetO2-IRES-OKMS, 형질 및 테트라 사이클린 transactivator 역방향했다 CAG-rtTA)은 트랜스의 발현 플라스미드 (mPBase)와 함께 플라스미드. 마우스 AF 세포는 MEF 피더 레이어를 통해 체외 확장 1 주 이후 인 Oct4, Klf4, cMyc 및 Sox2이 형질했다. 앞서 설명한대로 39 외인성 인자의 발현을 위해, 독시사이클린은 1.5 μg / ml의 농도 형질 다음날 하였다. mCherry의 발현 형질을 나타내는 독시사이클린 추가에서 24 시간 후에 볼 수 있었다. ES-같은...

이 연구에서는 비바이러스 기반 전이(transposon) 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포에서 유도 만능 줄기 세포를 생성합니다.

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

이 절차의 전반적인 목표는 트랜스포존 시스템을 사용하여 쥐 양수 세포를 분리하고 재프로그래밍하는 것입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 쉽게 수행 할 수 있다는 것입니다. 치료 환경에서 인간 질병 태아의 세포는 출산 전에 환자 특이적 치료를 다른 방법으로 준비하기 위해 약물 검사 또는 조직 공학을 위한 관심 세포로 분화될 수 있습니다.이 방법은 프로그래밍의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 트랜스포존 시스템은 다양한 세포 유형에서 효율적입니다. 바이러스 벡터와 관련된 임상적 접근에 더 적합하며 oxino-free IPS 세포를 생산할 수 있습니다.격리를 시작하려면 70% 에탄올을 사용하여 댐의 복벽을 청소하십시오. 가위를 사용하여 복강에 접근할 수 있도록 복벽의 길이를 절개하여 정중선 개복술을 수행합니다. 집게를 사용하여 자궁을 드러낸 다음 가위로 절제합니다.멸균 100xPBS로 채워진 1mm 접시에 자궁을 옮기고 얼음 위에 보관합니다. 접시를 10X 배율의 실체 현미경 아래에 놓고 집게로 자궁을 잡고 가위로 자궁 벽을 제거하면서 태아막이 손상되지 않도록 주의합니다. 멸균 1XPBS로 채워진 100mm 접시에 태아를 모아 얼음 위에 놓습니다.한 태아의 태반을 미세한 포인트 겸자로 잡고 깨끗한 100mm 접시에 옮깁니다. 여기에서 노른자 자루를 조심스럽게 제거하십시오. 겸자와 인슐린 주사기를 사용하여 양막을 방해하고 30마이크로리터의 양수를 수집합니다.유체를 15ml 원뿔형 바이알에 옮깁니다. 각 태아에 대해 이 과정을 반복하여 매번 같은 바이알에 액체를 모읍니다. 다음으로, 1%의 소 태아 혈청이 보충된 멸균 1XPBS로 각 태아를 씻고 이를 양수와 함께 15ml 원추형 튜브에 모읍니다.튜브를 145배 G에서 5분 동안 원심분리한 다음 층류 후드 아래에서 상층액을 제거합니다. 펠릿화된 세포를 2ml의 양수 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 마이오마이신-C 처리된 마우스 배아 섬유아세포 또는 MEF가 포함된 0 포인트 1% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트를 취한 다음 플레이트에 2ml의 세포를 시드합니다.섭씨 37도와 이산화탄소 5%에서 세포를 배양하고 격일로 배지를 바꿉니다. 세포가 transfection할 준비가 될 때까지 7일 동안 배양을 계속합니다. transfection을 시작하려면 1 point five millimiter microcentrifuge tube에서 1 microgram의 transposon plasmid와 zero point 5 microgram의 transposase 발현 플라스미드 및 0 point 5 microg의 reverse tetracycline transactivator plasmid를 혼합합니다.d-man을 사용하여 100마이크로리터로 희석합니다. DNA가 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 8마이크로리터의 transfection 시약을 추가합니다. 이 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양합니다.마우스 AF 세포가 있는 6개의 웰 플레이트를 취하여 웰당 100마이크로리터의 형질주입 제제 DNA 혼합물을 적가하고 웰당 2ml의 최종 부피로 완만한 소용돌이로 분배합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 5%의 이산화탄소에 그대로 두십시오. 다음 날, 배양 배지를 제거한 다음 Yamanaka의 인자의 발현을 유도하기 위해 독시사이클린 1밀리리터당 5마이크로그램이 보충된 2밀리리터의 신선한 iPS AF 배지를 세포의 각 웰에 공급합니다.이 시점부터 통과하지 않고 신선한 dox 함유 배지를 매일 세포에 공급합니다. 첫 번째 독시실신 처리 후 24시간 이내에 형광 현미경으로 세포를 관찰하여 mCherry 발현을 찾고 이 시점부터 매일 집락 형성을 확인합니다. 콜로니 형성이 관찰되면 단일 콜로니를 50마이크로리터의 세포 배양 배지로 선택합니다.다음으로, mytomycin c 처리 MEF가 있는 96웰 조직 배양 플레이트의 별도 웰로 순차적으로 옮깁니다. 다음 날, 각 웰에 50마이크로리터의 트립신을 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양하여 콜로니를 단일 세포로 해리합니다. 배양 후 액체를 위아래로 피펫으로 주입하여 군체를 추가로 분해합니다.50마이크로리터의 트립신 세포 혼합물을 불활성화된 MEF를 포함하는 새로운 웰로 옮긴 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 세포가 60-70% 합류점에 도달하면 24웰 플레이트의 새로운 웰로 분리한 다음 실온에서 배양을 계속합니다. 이 세포가 60-70% 합류점에 도달하면 세포를 1-2개의 웰로 뒤집어 하나는 독시사이클린을 포함하고 다른 하나는 독시사이클린이 없는 상태에서 콜로니가 성장하는지 확인합니다.불활성화된 MEF에서 IPS AF 콜로니와 독시사이클린 독립 배지를 5% 이산화탄소 중 섭씨 37도에서 계속 유지합니다. 세포가 염색, 이미징 및 RNA 추출을 위해 준비될 때까지 배지를 매일 교체하십시오. 여기서, 안정적인 독시사이클린 독립 유도 흉막 화능 마우스 GFP 양성 세포는 성공적인 재프로그래밍을 확인하는 데 필요한 흉막 분화능 마커를 발현합니다.R1 ES 세포를 대조군으로 사용한 RTPCR 분석은 독시사이클린의 유무에서 유도된 흉막 분화능 마커의 발현을 보여주었습니다. 하우스키핑 유전자인 베타 2 마이크로글로불린(beta two microglobulin)의 발현도 세 가지 세포 유형 모두에서 관찰되었습니다. 유도된 다능화 세포를 주입 한 마우스에서 분리 된 기형 종은 면역 염색되었습니다.알파 태아 단백질, 알파 평활근 액틴 및 베타 3 튜불린이 덩어리에서 검출되면 세포가 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세 가지 배아층 모두로 분화되었음을 확인할 수 있습니다. 또한, 체외 배아체 및 생체 내 기형종 세포의 RTPCR 분석은 중배엽, 내배엽 및 외배엽에 대한 생식층 특이적 마커 유전자의 발현을 확인합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 양수 세포를 분리하고 다시 프로그래밍하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이것은 일상적인 진단 또는 제왕 절개에서 얻은 샘플에서 인간 양수 세포에도 적용할 수 있는 간단하고 안전한 절차입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Stemgent 독스의 Inducible 마우스 TF의 Lentivirus 세트 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 셀에 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)를 재설 정할 수 있습니다. 다음은 마우스 프로그래밍 전사 요인 Oct4의 독스 - inducible 표현에 대한 프로토콜을 보여줍니다, Sox2, Klf4과 c - Myc은 표현하는 일반적인 MES pluripotency 마커 IPS의 식민지를 생성합니다.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

마우스 배아 섬유아세포는 전사 인자 Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc의 강제 발현에 의해 낮은 효율로 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있습니다. 재프로그래밍 반응의 드문 중간체는 세포 표면 제작자 Thy-1.2, Ssea-1 및 Epcam에 대한 항체 표지를 통해 분리된 FACS입니다.

재 프로그래밍 가능한 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 중간체의 세포 표면 마커 중재 정화

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 인간 성인 말초 혈액 세포에서 통합이 없는 iPSC를 효율적으로 생성하기 위한 자세한 방법을 설명합니다. 재프로그래밍 인자를 발현하기 위해 KLF4, MYC, BCL-XL 또는 OCT4 및 SOX2와 같은 4개의 oriP/EBNA 기반 에피솜 벡터를 사용하여 1mL의 말초 혈액에서 수천 개의 iPSC 콜로니를 얻을 수 있습니다.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

여기서는 화학적 후성유전학적 소거와 메카노센싱 관련 단서를 결합하여 유전자 형질감염이나 레트로바이러스 벡터가 필요 없이 포유동물 다능성 세포를 효율적으로 생성하는 방법을 제시한다. 따라서이 전략은 번역 의학에 유망하며 줄기 세포 오가노이드 기술의 주목할만한 발전을 나타냅니다.

후성유전학적 변형과 생체역학적 단서를 결합하여 포유류 다능성 세포를 생성하는 두 단계 전략

배우세요 마우스 양수 세포에서 트랜스포존 시스템을 이용한 유도만능줄기세포 제조 방법을. 비바이러스 방식으로 재생의학 및 환자 맞춤 치료에 활용할 수 있는 안전하고 효율적인 기술입니다.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

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