Name: 진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 진공 안정 이미징 창을 이용한 폐의 장기 고해상도 생체 내 현미경 기법으로, 마우스 모델에서 단일 세기 해상도로 최대 12시간 동안 종양 세포와 기질 상호작용을 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 암 전이 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 NIH-CA100324, 아인슈타인 국립 암 연구소(Einstein National Cancer Institute)의 암 센터 지원 보조금 P30CA013330, JWP R01CA172451 및 통합 이미징 프로그램(Integrated Imaging Program)의 지원을 받았습니다. 이 기술은 알버트 아인슈타인 의과대학(Albert Einstein College of Medicine)의 Gruss-Lipper Biophotonics Center와 Integrated Imaging Program에서 개발되었습니다. 우리는 이 작업에 대한 이러한 센터의 지원에 감사드립니다. 저자는 아인슈타인 기계 공장의 Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon 및 Anthony Leggiadro에게 숙련되고 시기적절한 장인 정신을 보여주고, 창문 디자인 도면을 아낌없이 공유해 준 Matthew Krummel의 실험실, 현미경 검사에 대한 전문 지식과 증폭기 권장 사항에 대해 Kevin Elicieri와 Jeremy Bredfeldt, 유익한 토론을 해준 Allison Harney와 Bojana Gligorijevic에게 감사드립니다.

저자는 공개할 것이 없습니다.

단백질 및 항체로 형광 표지 기능 태그와 함께 생체 광학 영상에서 높은 해상도는 전이성 캐스케이드에 대한 우리의 이해를 증가 극적으로했다. 이는 직접적인 시각화 및 단일 셀 및 종양 세포의 서브 세포 매개 숙주 세포 및 미세 정량화있게되었다. 기본 종양 내에서이 영상은 성장 침입 또는 보급 6,7 중 하나의지지 이산 미세 환경의 발견, 예를 들어, 주도하고있다. 침략의 경우, 생체 내 이미징은 intravasation 7,50에서 대 식세포 및 종양 세포의 공동 migrational 스트리밍의 우선적 인 역할을 공개했다. 폐와 같은 보조 사이트, 종양 세포의 하나의 작은 그룹이 도착했을 때, 전이의 초기 단계에서 종양 세포 행동의 역학을 이해하는 사전 미세 전이의 시드 단계를 포함 및상기 혈관 내피 세포와 상호 작용 만 고해상도 광학 영상을 이용하여 달성된다. 표준 임상 이미징을 모세관 층...

고해상도 생체 내에 광학 영상은 단일 셀 및 하위 세포 매개 변수 측정 및 정량화 될 수 있도록 다수의 생물학적 과정을 이해하는데 중요한 것으로 입증되었다. 암 연구에서, 종양 및 기질 세포의 생체 내에 영상은 그대로 동물에만 존재하는 많은 미세 환경의 상호 작용 6-11의 발견하게되었다. 생체 내에서 단일 세포 해상도 광학 영상을 이용하여 유방암 intravasation 및 종양 세포의 보급과 관련된 미세 환경에 대한 발견은 심지어 예후 유방암 환자의 12-16 치료에 대한 반응에 대한 신규 마커하게되었다. 그대로 내부 중요한 장기 내에서 깊은 볼에 사용할 수있는 최고의 영상 기술은 전체 기관의 뛰어난 전망을 제공하고 임상 증상을 생산하기도 전에 병리을 표시 할 수있는 임상 양상 (MRI, PET, CT)입니다. 그들은 수없는, 시간owever 때문에 단일 셀 해상도의 부족으로 종양의 진행을 구동 전이의 초기 단계와 세포 메커니즘을 공개합니다. 그 때까지는 폐 전이가이 양식에서 볼 수 있습니다, 그들은 잘 설립 및 확산된다. 그들은 훨씬 이전에 이미 도달 생존의 초기 단계 촬상 19 예상보다 도착 파종 성 종양의 폐에 도달하거나 17 생존하지 않거나 초기 휴지 18 남아 세포 및 관찰의 90 %가 중요하게되는 예상 주어 원거리 사이트에 시딩 전이성 종양 성장의 반복 과정을 이해. 폐에서 이러한 관측을 수행하면 그러나 매우 어려운 입증했다; 영상화 연구의 대부분은 단지 하나의 시점에서 폐로보기를 제공 체외 이식편 또는 제제 (20-23)을 이용했다. 이러한 준비는 유용한 정보를 제공 할 수 있지만rmation, 그들은 미세 환경의 다양한 구성 요소 사이에 발생하는 상호 작용, 원인과 결과 관계, 역학의 완전한 이해를 제공하지 않습니다. 적절한 순환 시스템 (및 항상성 수반 불균형)과 신체의 면역 시스템의 나머지 부분에서 단절의 부족은 내리기이 제제는 생체 내에서 그대로 조직에서 생성 결론을 확인 할 수 있습니다. 많은 그룹은 Wearn과 독일은 흉막 층 (24)을 노출 외과 적 먼저 테리 이식 이미징 창 (25)을 활용하는 첫번째 인에 그대로 폐 2,4,5,24-33의 생체 내에 이미징을 수행했습니다. 폐의 고해상도 영상은 크게 폐의 지속적인 움직임에 의해 방해되고, 몇몇 기술은 이러한 한계를 극복하기 위해 개발되었다. 바그너와 Filley 27 개 폐의 자연적인 움직임을 연구바그너는 조직 (28)를 고정하기 위해 자신의 창 수술 준비에 진공을 이용하면서 상대적으로 고정 된 영역에 걸쳐 이식 창을 찾기 위해 자신의 수술 프로토콜을 설계했습니다. 기관지 클램프, 순차적 인 가사와 게이트 이미징, 오버 샘플링 수집, 폐 엽 진공 (34)의 접착 : 그 이후, 다양한 기술은 이미지에 포함 폐를 활용하고있다. 이러한 각각의 장단점을 갖고 어떤 하나의 기술은 서로 34 우량 등장하지 않았다. 예를 들어, 기관지 클램핑 순차적 무호흡증은 폐에서 가스의 정상적인 교환을 변경하고 무기폐의 원인이 될 수 있습니다. 정문 이미징 및 오버 샘플링 된 인수는 이러한 단점을하지만 고속 또는 전문 영상 장비 널리 액세스 할 수 없습니다 필요하지 않습니다. 결국 폐 모두 접착제 및 진공 기술은 상술 한 문제점을 모두 피할 수 있지만,주의가 탁하지 않은 경우 전단력에 의한 손상을 나타낼 수있다엉. 최근, 진공 창 소형화되었고 공 초점 및 다 광자 현미경 4,5,33 우수한 고해상도 화상을 사용하여 마우스에서 사용되도록 획득 된이. 표 1은 이러한 오랜 역사를 요약 및 신규를 설명 그 종이를 강조 생체 내에 폐 촬상 창 사용의 발전. 이 프로토콜은 가능한 가장 높은 세포 내 해상도 라이브, 그대로 폐의 이미지 전이에 장시간 경과 광자 생체 내에 현미경의 사용을 설명합니다. 이미지는 고 개구 수 대물 렌즈 복수 광전자 증 배관 (PMT) 검출기를 구비 한 다 광자 현미경을 사용하여 최대 12 시간 동안 획득된다. 형질 전환 마우스 모델은 형광 고 분자량 덱스 트란과 형광 단백질 형질 전환 된 종양 세포 (혈관과 종양 세포가 respectivel 레이블을 함께 형광 라벨 기본 식세포에 사용된다와이). 형광 표지 된 세포의이 선택은 종양 세포 내피 세포 - 대 식세포 상호 작용과 역학의 시각화 할 수 있지만,이 프로토콜은 형광 또는 비 형광 마우스의 변형을 위해 작동합니다. 인수 후, 잔류 드리프트 운동 (있는 경우) 레이블이없는 순환 혈액 세포에 의한 점멸 제거하기 위해 35, 36 및 사용자 지정 매크로 시간 평균에게 혈관 채널을 플러그인 피지를 사용하여 제거된다. 이 프로토콜은 촬상 전이에 초점을 맞추고 있지만, 기술은 폐 고해상도 단일 셀 이미징 관찰 다른 여러 생물학적 과정에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>니켈 도금 황동 진공 레귤레이터 1/8 NPT 여성, 게이지 포함, 0 - 20" Hg 진공 청소기</td><td>McMaster Carr</td><td>4172K12&nbsp;</td><td>진공 레귤레이터</td></tr><tr><td>1/4" 호스 ID x 1/8" NPTF 남성 파이프용 황동 가시 호스 피팅 어댑터</td><td>McMaster Carr</td><td>5346K13</td><td>진공 조절기 호스 어댑터</td></tr><tr><td>Pyrex 브랜드 필터링 플라스크와 튜뷸레이션; 고무 마개 No. 4용 넥 툴링; 용량: 50 ml</td><td>Corning Life Sciences Glass</td><td>5360-50</td><td>진공 플라스크</td></tr><tr><td>라운드 글라스 커버슬립 두께 #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia.&nbsp;</td><td>테드 펠라, Inc.</td><td>260368</td><td>커버 슬립</td></tr><tr><td>Exel International 일회용 Safelet I.V. 카테터; 22 g x 1 in.&nbsp;</td><td>Exel International</td><td>26746</td><td>기관 카테터</td></tr><tr><td>PERMA-HAND 블랙 브레이디드 실크 봉합사, ETHICON LIGAPAK 디스펜싱 릴 사이즈 2-0</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>스트링</td></tr><tr><td>리퀴드 슈퍼 글루, 클리어, 0.14 oz</td><td>Hendel Corp.</td><td>LOC1647358</td><td>Cyano-acrylate 접착제</td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine isothiocyanate&ndash; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1287-500MG</td><td>155 kD Dextran</td></tr><tr><td>실험실 투명 Tygon PVC 튜브, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" 벽 두께, 25피트 길이</td><td>McMaster Carr</td><td>5155T12</td><td>얇은 튜브 및 루어</td></tr><tr><td>균열 저항성 폴리에틸렌 튜빙용 튜빙, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" 벽 두께, 흰색, 50피트 길이&nbsp;</td><td>맥마스터 카</td><td>5181K24&nbsp;</td><td>두꺼운 튜빙</td></tr><tr><td>Depillatory Lotion</td><td></td> <td>Nair-Micro</td><td></td></tr> <tr><td>Medical Tubing 95 경도계 LDPE</td><td>Scientific Commodities Inc.</td><td>BB31695-PE/1</td><td>꼬리 정맥 카테터용 튜브</td></tr><tr><td>30G x 1인치 BD PrecisionGlide 바늘</td><td>BD</td><td>305128</td><td>꼬리 정맥 카테터용</td></tr><tr><td>바늘 Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>867WCNOGLUE</td><td></td></tr><tr><td>투명 폴리카보네이트 바베드 튜브 피팅, 3/32" x 1/16" 튜브 ID용 직선 감소</td><td>McMaster Carr</td><td>5117k51</td><td>튜브 간 커넥터</td></tr><tr><td>원홀 고무 스토퍼 Fisher</td><td>Scientific</td><td>14-135F</td><td>스토퍼 진공 플라스크용</td></tr><tr><td>SHARP 정밀 배리어 팁, P-100, 100 &마이크로용; l</td><td>덴빌 사이언티픽 Inc.</td><td>P1125</td><td>피펫 팁</td></tr><tr><td>실험실 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>Puralube</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>008897</td><td>안과 연고</td></tr><tr><td>쌍둥이 자리 소작 키트</td><td>하버드 장치</td><td>726067</td><td>소추 펜</td></tr><tr><td>Graefe 마이크로 해부 겸자; 톱니 모양의; 약간의 곡선; 0.8mm 팁 너비; 4" 길이</td><td>Roboz 수술용</td><td>RS-5135&nbsp;</td><td>집게</td></tr><tr><td>초미세 마이크로 해부 가위 4" 직선 샤프/샤프 24 mm</td><td>Roboz 수술</td><td>RS-5912</td><td>날카로운 가위</td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위 4" 직선 둔기/둔기</td><td>Roboz 수술</td><td>RS-5980</td><td>무뚝뚝한 가위</td></tr><tr><td>물티슈</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td>마구</td></tr><tr><td>PhysioSuite 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>PhysioSuite</td><td>바이탈 모니터</td></tr><tr><td>1ml 주사기, 투베르큘린 슬립 팁</td><td>BD</td><td>309659</td><td>주사기</td></tr><tr><td>시아노 아크릴레이트</td><td>스테이플</td><td>LOC1647358</td><td>커버 슬립 접착제</td></tr><tr><td>석유 젤리</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086291</td><td>방수</td></tr><tr><td>어댑터 Luer Cannulla 1.5 - 2.2mm</td><td>하버드 장치</td><td>734118</td><td>카테터 커넥터</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT 맥박 산소 농도계</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>맥박 산소 농도계</td></tr><tr><td>이소에시아(이소플루란)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>250ml</td></tr><tr><td>산소</td><td>TechAir</td><td>OX TM</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PVC 볼 밸브, 푸시 투 커넥트, 1/4 In</td><td>Grainger</td><td>3CGJ7</td><td>진공 밸브</td></tr><tr><td>소형 동물 인공호흡기</td><td>하버드 장치</td><td>683</td><td>대안은 Kent Scientific에서 구할 수 있습니다: MouseVent</td></tr><tr><td>OptiMEM Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 형질주입 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J Mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>026051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>다광자 현미경</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>맞춤형 스코프의 대안</td></tr><tr><td>FV1000용</td><td>환경 인클로저</td><td>정밀 플라스틱</td> 챔버 <td>맞춤형 인클로저</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>레이저 파워 미터</td><td>코히어런트</td><td>필드MaxIITOP</td><td></td></tr><tr><td>레이저 파워 미터 헤드</td><td>Coherent</td><td>PM10</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-Clover 형광 단백질 벡터</td><td>Addgene</td><td>40259</td><td></td></tr><tr><td>G418 황산염 선택적 항생제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo 형광-활성화 세포 분류기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>XDP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>40 &마이크로; m Mesh</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>60mm 배양 접시</td><td>코닝</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>10cm 배양 접시</td><td>코닝</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>잭슨 연구소</td><td>000664&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>김 와이프</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>06-666-A&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window

이러한 폐, 간, 뼈 등의 보조 사이트에 전이가 약 90 % 1의 사망률과 외상 이벤트입니다. 이러한 사이트 중 폐 인해 몸, 섬세한 자연과 적절한 생리 유지에 중요한 역할 내에서 밀폐 된 위치로 생체 내에 광학 영상을 사용하여 평가하기가 가장 어렵다. 임상 양상 (양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 공명 영상 (MRI) 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT)이)이 조직의 비침 이미지를 제공 할 수있는 반면, 한 번의 픽셀과 초기 시드 이벤트를 시각화하는데 필요한 해상도를 결여 거의 천 세포로 구성. 단지 종양 세포의 도착 후 이벤트가 생존과 이후의 성장에 결정적 전이성 폐 시드 가정의 현재 모델. 이 단일 세포 분석이 실시간으로 생체 내에 이미징 도구 시딩 CEL의 표현형을 정의하기 위해 필요하다는 것을 의미LS는이 모델을 테스트합니다. 폐의 고해상도 광학 영상은 다양한 생체 제제를 사용하여 수행되었지만, 이러한 실험은 전형적으로 단일 시간 시점 분석하고 (인해 대폭 변화된 환경 온도 풍부, 사이토 카인 등 아티팩트 가능한 잘못된 결론에 취약 ) 흉강 및 순환 시스템 3에서 제거한. 최근 작품은 진공 그러나 영상 창 2,4,5 안정화 사용 가능한 그대로 폐의 시간 경과 생체 내에 광학 영상입니다 보이고있다 일반적인 영상 시간은 약 6 시간으로 제한되어있다. 여기에서 우리는 12 시간의 기간에 걸쳐 이러한 윈도우를 이용한 폐의 장기간 생체 내에 촬영 된 영상을 수행하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법을 사용하여 얻어진 시간 경과 이미지 시퀀스는 폐의 시각화 및 세포 - 세포 상호 작용의 정량, 막 역학과 혈관 관류 수 있습니다. 우리는 더 라폐의 미세 혈관의 전례 명확한 도면을 제공하는 영상 처리 기술을 방접원을 그리다.

이 방법으로 얻을 수있는 결과의 유형을 설명하기 위해, 수술 전에 시점 변화에 MacBlue 마우스 (44)의 꼬리 정맥에 형광 단백질 클로버 표지 E0771-LG 종양 세포 주입. 수술 후, 155 가와사끼 로다 민 표지 된 덱스 트란은 혈관과 시간 경과 영상이 수행 된 표시하는 IV를 주입 하였다. 쥐 24 시간 후 분사를 이미징 할 때, 하나의 세포는 대 식세포와 단핵 세포와의 상호 작용, 혈관의 안쪽에 볼 수 있습니다. 이것의 예는도 2A (보조 영화 1)에 나타낸다. 그것은 일시적 거주자의 대 식세포 (시안)과 상호 작용으로 여기에 12 μm의 깊이가 폐 혈관에 박혀 독방 종양 세포 (녹색)의 단일 광학 부분은 5 시간 20 분에 걸쳐 이미징된다. 혈관은 고 분자량 덱스 ...

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

Metastasis to secondary sites such as the lung, liver and bone is a traumatic event with a mortality rate of approximately 90% 1. Of these sites, the lung ...

이 방법의 전반적인 목표는 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 손상되지 않은 폐의 장기적, 고해상도, 단일 세포 이미징을 수행하는 것입니다. 이 방법은 전이의 초기 단계에서 기질과 종양 세포 사이에 어떤 상호작용이 일어나는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이론적으로 살아있는 온전한 폐를 최대 12시간 동안 단일 세포 해상도로 시각화할 수 있다는 점입니다.먼저 2-0 봉합사 3인치 길이를 기관 카테터의 부싱 위 1/4인치 지점에 이중 매듭으로 묶습니다. 그 다음, 마취된 마우스의 눈에 안연고를 도포하고 제모 크림을 사용하여 가슴 중앙선부터 등 1/4 지점까지, 그리고 겨드랑이부터 갈비뼈 케이지 바로 아래까지 동물의 왼쪽 부위 털을 제거합니다. 잔여 로션을 닦아내고 노출된 피부를 70% ethanol로 소독합니다.다음으로, 동물에게 기관 내 삽관을 실시합니다. 그리고 앞니 아래의 코끝 부분에 2-0 봉합사를 묶습니다. 카테터가 빠지지 않도록 주의하며 동물을 수술 구역으로 이동시킨 후, 인공호흡기를 켭니다.인공호흡기를 기관 카테터에 연결합니다. 그런 다음 카테터를 코 부분에 테이프로 고정하고, 왼쪽 앞다리를 카테터에 고정합니다. 발가락 꼬집기(toe-pinch)에 반응이 없음을 확인한 후, 날카로운 가위를 사용하여 왼쪽 흉벽 위의 피부를 1cm² 크기로 제거합니다.유선 지방패드를 들어 올리고 노출된 혈관을 소작합니다. 다음으로 지방패드를 절제하고 갈비뼈까지 근육층을 제거하되, 앞다리 기저부의 액와정맥을 절단하지 않도록 주의합니다. 포셉을 사용하여 여섯 번째 갈비뼈를 들어 올립니다.그 다음, 날카로운 가위를 5도 정도의 낮은 각도로 잡고 피부 절개창 가장자리 근처의 갈비뼈를 자릅니다. 흉벽의 절개창을 넓혀 폐엽 전체가 드러나도록 갈비뼈 4개를 연속해서 제거합니다. 그런 다음 마우스를 현미경 이미지 촬영 스테이지 위로 조심스럽게 옮깁니다.진공 상태가 아닐 때, 진공 윈도우의 내부 챔버를 PBS로 채웁니다. 마우스를 뒤집어 노출된 폐가 진공 이미징 커버슬립 윈도우 위에 오도록 위치시킵니다. 천천히 진공을 켭니다.티슈 페이퍼를 반으로 두 번 접어 만든 구속 하네스를 마우스의 가슴 위에 얹고 하네스를 스테이지 플레이트에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 동물의 발에 펄스 옥시미터를 부착합니다. 이어서 스테이지 위에 환경 챔버를 배치하고 히터를 켜서 마우스를 생리학적 온도로 유지합니다.동물이 적절한 위치에 놓이면, 25배 95 수치구경 대물렌즈를 커버슬립 근처로 가져옵니다. 에피형광 모드에서 fitzy 채널을 관찰하여 폐 조직의 초점을 맞춥니다. 다음으로, 멸균 시린지에 종양 세포 현탁액 100 µL를 채우고, 꼬리 정맥 카테터에서 PBS 시린지를 제거한 후 종양 세포 시린지를 연결합니다.종양 세포를 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다. 그런 다음 PBS 주사기를 꼬리 정맥 카테터에 다시 연결하고, 현미경 접안렌즈를 통해 폐 조직 전체에 종양 세포가 위치하는지 확인합니다. 이제 PBS 주사기를 100 µL의 rhodamine dextran이 충전된 주사기로 교체하고, 꼬리 카테터를 통해 마우스에 dextran을 천천히 주입합니다.덱스트란 투여 후 50 µL의 멸균 PBS로 플러싱합니다. 그 다음, 이전에 확인한 각 종양 세포 위치에서 이미지를 획득하여 혈관의 흐름과 무결성을 시각화합니다. 주입 24시간 후에는 혈관 내에서 대식세포 및 단핵구와 상호작용하는 단일 종양 세포를 시각화할 수 있습니다.이미징의 안정성이 매우 뛰어나 시야의 순차적인 Z-스택을 획득하고 3차원 재구성을 생성할 수 있습니다. 여기서는 주입 12일 후, 단일 전이성 병변의 폐 표면 아래 15 microns 지점에서 205분 동안 890 micron의 시야를 덮는 5x5 모자이크 이미징 필드가 제시되어 있습니다. 넓은 시야에도 불구하고, 모자이크를 구성하는 하부 프레임의 고해상도 덕분에 염색체 분리로 입증되는 단일 세포의 유사분열과 같은 세포 내 사건을 포착할 수 있습니다.고분자량의 형광 표지 덱스트란을 혈관 내로 주입하면 혈관 내강이 표지되지만, 표지되지 않은 순환 적혈구와 백혈구가 덱스트란을 가릴 수 있습니다. 폐의 미세 모세혈관에서는 이러한 폐쇄로 인해 덱스트란 신호가 깜빡거리고 혈관 경계의 정의가 소실됩니다. 본 프로토콜에서 제공하는 높은 공간적 안정성은 블러링 없이 혈액 채널의 시간 평균화를 가능하게 하여, 일시적인 폐쇄 현상을 복원해 줍니다.그 후 다른 신호 채널들을 혈관 구조 위에 겹쳐서 혈관 경계를 명확하게 확인할 수 있습니다. 이 기술에 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 큰 혈관을 절단하기 전 반드시 전기 소작을 하고, 폐 조직을 전혀 건드리지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.이 절차를 통해 종양 세포 전이 및 증식의 초기 단계를 시각화할 수 있습니다. 이 영상을 시청함으로써 진공 안정화 영상 창을 이용하여 온전한 폐에서 생체 내 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 그들이 병원균을 phagocytose 또는 호중구 세포 트랩 (그물) 생성하는 동안 감염된 폐의 호중구 granulocytes의 역학의 관​​찰에 대한 2 광자 현미경을 사용하는 방법, 표시합니다.

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

이 비디오에서는 세포 역학의 장기적인 시각화를 위해 안정화된 창을 통해 쥐 췌장의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

Intravital Imaging: 안정화된 이미징 창을 통해 마우스 췌장의 세포 수준을 관찰하는 방법

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

여기에서, 우리는 폐의 고해상도, 인트라비티 이미징을 가능하게 하는 뮤린 흉부에 대한 영구적으로 깃드는 광학 창의 외과 이식을 위한 프로토콜을 제시합니다. 창의 영속성은 폐에 있는 동적 세포 프로세스의 연구 결과, 특히 보급된 종양 세포의 전이성 진행과 같이 천천히 진화하는 그들에 적합합니다.

폐에 암 전이를 조사하기위한 영구적 인 창

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

배우세요 진공 안정 이미징 창을 이용한 폐의 장기 고해상도 생체 내 현미경 기법으로, 마우스 모델에서 단일 세기 해상도로 최대 12시간 동안 종양 세포와 기질 상호작용을 관찰할 수 있습니다. 이 방법은 암 전이 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

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