진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

이 방법의 전반적인 목표는 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 손상되지 않은 폐의 장기적, 고해상도, 단일 세포 이미징을 수행하는 것입니다. 이 방법은 전이의 초기 단계에서 기질과 종양 세포 사이에 어떤 상호작용이 일어나는지와 같은 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이론적으로 살아있는 온전한 폐를 최대 12시간 동안 단일 세포 해상도로 시각화할 수 있다는 점입니다.

먼저 2-0 봉합사 3인치 길이를 기관 카테터의 부싱 위 1/4인치 지점에 이중 매듭으로 묶습니다. 그 다음, 마취된 마우스의 눈에 안연고를 도포하고 제모 크림을 사용하여 가슴 중앙선부터 등 1/4 지점까지, 그리고 겨드랑이부터 갈비뼈 케이지 바로 아래까지 동물의 왼쪽 부위 털을 제거합니다. 잔여 로션을 닦아내고 노출된 피부를 70% ethanol로 소독합니다.

다음으로, 동물에게 기관 내 삽관을 실시합니다. 그리고 앞니 아래의 코끝 부분에 2-0 봉합사를 묶습니다. 카테터가 빠지지 않도록 주의하며 동물을 수술 구역으로 이동시킨 후, 인공호흡기를 켭니다.

인공호흡기를 기관 카테터에 연결합니다. 그런 다음 카테터를 코 부분에 테이프로 고정하고, 왼쪽 앞다리를 카테터에 고정합니다. 발가락 꼬집기(toe-pinch)에 반응이 없음을 확인한 후, 날카로운 가위를 사용하여 왼쪽 흉벽 위의 피부를 1cm² 크기로 제거합니다.

유선 지방패드를 들어 올리고 노출된 혈관을 소작합니다. 다음으로 지방패드를 절제하고 갈비뼈까지 근육층을 제거하되, 앞다리 기저부의 액와정맥을 절단하지 않도록 주의합니다. 포셉을 사용하여 여섯 번째 갈비뼈를 들어 올립니다.

그 다음, 날카로운 가위를 5도 정도의 낮은 각도로 잡고 피부 절개창 가장자리 근처의 갈비뼈를 자릅니다. 흉벽의 절개창을 넓혀 폐엽 전체가 드러나도록 갈비뼈 4개를 연속해서 제거합니다. 그런 다음 마우스를 현미경 이미지 촬영 스테이지 위로 조심스럽게 옮깁니다.

진공 상태가 아닐 때, 진공 윈도우의 내부 챔버를 PBS로 채웁니다. 마우스를 뒤집어 노출된 폐가 진공 이미징 커버슬립 윈도우 위에 오도록 위치시킵니다. 천천히 진공을 켭니다.

티슈 페이퍼를 반으로 두 번 접어 만든 구속 하네스를 마우스의 가슴 위에 얹고 하네스를 스테이지 플레이트에 테이프로 고정합니다. 그런 다음 동물의 발에 펄스 옥시미터를 부착합니다. 이어서 스테이지 위에 환경 챔버를 배치하고 히터를 켜서 마우스를 생리학적 온도로 유지합니다.

동물이 적절한 위치에 놓이면, 25배 95 수치구경 대물렌즈를 커버슬립 근처로 가져옵니다. 에피형광 모드에서 fitzy 채널을 관찰하여 폐 조직의 초점을 맞춥니다. 다음으로, 멸균 시린지에 종양 세포 현탁액 100 µL를 채우고, 꼬리 정맥 카테터에서 PBS 시린지를 제거한 후 종양 세포 시린지를 연결합니다.

종양 세포를 꼬리 정맥에 천천히 주입합니다. 그런 다음 PBS 주사기를 꼬리 정맥 카테터에 다시 연결하고, 현미경 접안렌즈를 통해 폐 조직 전체에 종양 세포가 위치하는지 확인합니다. 이제 PBS 주사기를 100 µL의 rhodamine dextran이 충전된 주사기로 교체하고, 꼬리 카테터를 통해 마우스에 dextran을 천천히 주입합니다.

덱스트란 투여 후 50 µL의 멸균 PBS로 플러싱합니다. 그 다음, 이전에 확인한 각 종양 세포 위치에서 이미지를 획득하여 혈관의 흐름과 무결성을 시각화합니다. 주입 24시간 후에는 혈관 내에서 대식세포 및 단핵구와 상호작용하는 단일 종양 세포를 시각화할 수 있습니다.

이미징의 안정성이 매우 뛰어나 시야의 순차적인 Z-스택을 획득하고 3차원 재구성을 생성할 수 있습니다. 여기서는 주입 12일 후, 단일 전이성 병변의 폐 표면 아래 15 microns 지점에서 205분 동안 890 micron의 시야를 덮는 5x5 모자이크 이미징 필드가 제시되어 있습니다. 넓은 시야에도 불구하고, 모자이크를 구성하는 하부 프레임의 고해상도 덕분에 염색체 분리로 입증되는 단일 세포의 유사분열과 같은 세포 내 사건을 포착할 수 있습니다.

고분자량의 형광 표지 덱스트란을 혈관 내로 주입하면 혈관 내강이 표지되지만, 표지되지 않은 순환 적혈구와 백혈구가 덱스트란을 가릴 수 있습니다. 폐의 미세 모세혈관에서는 이러한 폐쇄로 인해 덱스트란 신호가 깜빡거리고 혈관 경계의 정의가 소실됩니다. 본 프로토콜에서 제공하는 높은 공간적 안정성은 블러링 없이 혈액 채널의 시간 평균화를 가능하게 하여, 일시적인 폐쇄 현상을 복원해 줍니다.

그 후 다른 신호 채널들을 혈관 구조 위에 겹쳐서 혈관 경계를 명확하게 확인할 수 있습니다. 이 기술에 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 약 1시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 큰 혈관을 절단하기 전 반드시 전기 소작을 하고, 폐 조직을 전혀 건드리지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

이 절차를 통해 종양 세포 전이 및 증식의 초기 단계를 시각화할 수 있습니다. 이 영상을 시청함으로써 진공 안정화 영상 창을 이용하여 온전한 폐에서 생체 내 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해주셔서 감사하며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.