Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 편평한 마운트 마우스 망막 준비에서 내부 망막 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하는 것입니다. 이 방법은 뉴런의 다양성, 정상 및 병리학적 조건에서의 시냅스 연결과 같은 망막 신경생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수직 및 측면 연결이 모두 보존되어 큰 측면 구성 요소가 있는 망막 회로를 연구할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 망막이 얇고 섬세한 조직이기 때문에 세심한 주의와 인내심을 가지고 다루어야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 그러나 연습이 그것을 마스터하는 가장 좋은 방법입니다. 이 절차를 시작하려면 깨끗한 종이 타월로 마우스 안구를 굴려 혈액을 제거합니다.

그런 다음 발암된 포유류 Ringer 용액에 담그십시오. 다음으로, 23게이지 바늘로 가장자리에 구멍을 뚫고 마이크로 가위로 가장자리를 따라 잘라 안구를 이등분합니다. 그런 다음 가는 집게를 사용하여 각막과 수정체를 제거합니다.

망막 전체를 장착하려면 미세한 집게로 색소가 있는 상피에서 망막 전체를 부드럽게 벗겨내고 가장자리에서 시신경두를 향해 1.5-2mm 직교로 4번 자릅니다. 그런 다음 펀칭된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 접시에 담그고 GCL 면이 위로 향하게 하여 망막을 부드럽게 드래그합니다. 그런 다음 전체 마운트 망막을 준비할 때 시신경두를 중앙 구멍에 넣습니다.

그런 다음 망막이 있는 막을 다른 깨끗한 접시에 옮깁니다. 고운 페인트 브러시로 망막을 몰타 십자가로 부드럽게 평평하게 펴고 구멍 위에 네 모서리를 모두 놓습니다. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 마른 여과지 조각으로 닦아내고 집게와 페인트 브러시로 유리체 및 내부 제한 멤브레인을 제거합니다.

바닥에 밀봉된 유리 덮개 슬립이 있는 녹음 챔버로 어셈블리를 옮기기 전에 모든 망막 가장자리가 멤브레인에 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 멤브레인을 덮개에 고정하고 진공 그리스로 미끄러뜨린 다음 외부 용액으로 망막을 재수화합니다. 어셈블리 아래에 기포가 끼지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 챔버를 정립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 섭씨 34도의 발탄 된 외부 용액으로 챔버를 분당 약 3 밀리리터의 속도로 주입하십시오. 먼저 10x 주관적 수정체로 망막을 검사합니다.

그런 다음 60x 수침 렌즈를 사용하여 DIC 및 에피형광 설정 아래의 GCL 및 INL 뉴런을 확인합니다. tdTomato가 SAC를 발현하는 것을 시각화하려면 554나노미터의 여기 필터 및 581나노미터의 방출 필터와 함께 백색 LED 광원을 사용하십시오. 이 절차에서는 주사기 필터를 통해 내부 용액을 사용자 지정 백필 필라멘트로 필터링합니다.

그런 다음 필라멘트를 갓 뽑은 마이크로피펫에 삽입하고 용액이 은 전극선을 5mm 이상 덮을 때까지 팁 근처에 내부 용액을 분배합니다. 그런 다음 10ml 플라스틱 주사기가 연결된 튜브의 플런저를 밀거나 당겨 전극 내부의 압력을 조정할 수 있는 흡입 당김으로 마이크로피펫을 전극 홀더에 고정합니다. 다음으로, 대물렌즈 아래에 있는 피펫을 찾아 망막 위 약 100마이크로미터까지 내려갑니다.

전류 팔로워 모드에서 DC 오프셋을 사용하여 정상 DC 전압 신호를 0으로 만듭니다. 전류 클램프 모드에서 피펫 저항을 측정하려면 피펫이 수조에 있는 동안 피펫을 통해 고정 진폭의 구형파 전류를 주입합니다. Raccess 손잡이를 돌려 차이를 중화하고 판독값을 사용하여 피펫 저항을 계산합니다.

그런 다음 전극을 망막 위 약 10마이크로미터로 천천히 가져옵니다. 전극에 양압을 가합니다. 그런 다음 피펫 팁 근처에서 반사가 망막에 접근함에 따라 변하는 것을 관찰합니다.

빠르지만 부드럽게 피펫을 GCL에 밀어 넣고 즉시 양압을 낮추십시오. 피펫을 표지된 뉴런 쪽으로 이동하고 Muller 세포의 다른 뉴런, 혈관 및 끝발과 접촉하지 마십시오. 전극 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 많은 양압을 가하십시오.

다음으로, 보조개가 보일 때까지 피펫 팁을 레이블이 지정된 뉴런 근처에 놓습니다. 그런 다음 양압을 해제하고 원형질막이 피펫 팁으로 다시 튀어 오르도록 합니다. 피펫에 20-120 피코암페어의 음전류를 가하여 기가옴 밀봉을 형성하는 데 도움을 줍니다.

양압을 해제한 후 세포막이 다시 튕겨 나오도록 하는 것은 멤브레인과 피펫 개구부 사이에 자연적으로 형성된 우수한 밀봉이 기록 후 세포 형태를 보존하는 데 중요하기 때문에 중요합니다. 필요한 경우 원형질막을 피펫으로 당기기 위해 부드럽게 흡입합니다. 밀봉 형성 후 5분 동안 세포막이 파열되어 과융합으로 유출된 내부 용액이 제거될 때까지 기다립니다.

멤브레인이 파열된 후 현재 CL에 있는 동안amp 모드에서 브리지 밸런스를 켜고 Raccess 손잡이를 사용하여 조정합니다. 반전 전위에서 세포를 유지하여 전압 클램프 모드에서 흥분성 및 억제성 시냅스후 전류를 기록합니다. 기록 후 소마에서 피펫을 부드럽게 제거합니다.

챔버에서 어셈블리를 깨끗한 접시로 옮깁니다. 그런 다음 구멍을 뚫지 않고 망막을 분리했다가 다른 평평한 니트로셀룰로오스 막에 다시 부착하여 고정하는 동안 망막이 평평한지 확인합니다. 이제 조직을 염색할 준비가 되었습니다.

이러한 이미지는 GCL과 INL 모두의 콜린성 세포가 tdTomato 형광으로 안정적으로 식별될 수 있으며 DIC에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 목표로 할 수 있음을 보여줍니다. 막 전위의 진동은 전류 클램프 기록에 의해 드러날 수 있으며, 억제 및 흥분성 시냅스 전류에 의해 구동되는 진동은 전압 클램프 조건에서 셀을 각각 0 밀리 볼트와 음의 75 밀리 볼트로 유지함으로써 드러납니다. 여기서, 기록된 세포의 사후 조직학적 특성화는 IPL의 전형적인 SAC 수지상 형태 및 층화 수준을 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안, 기록 가능한 샘플을 제공하기 위해 망막막 어셈블리를 기록 챔버에 고정하고 아래에 기포를 가두지 않고 단단하고 섬세한 방식으로 재수화하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 대상 다중 세포의 진동이 동일한 시냅스 메커니즘에 의해 구동되는지 여부와 같은 추가 질문에 답하기 위해 이중 패치 클램프 기록과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 망막 신경생물학 분야의 연구자들이 광수용체 퇴행성 망막에서 인접한 망막 뉴런 간의 진동의 동시성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 유리체액을 제거하고 내부 망막 뉴런에서 표적 전체 스케일 패치 클램프 기록을 위해 망막 플랫 마운트를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.