Name: Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 학습하세요 마우스 망막 플랫 마운트에서 별 모양 무축삭 세포의 패치 클램프 기록 방법을. 이 기법은 수직 및 수평 시냅스 연결을 보존하여 망막 신경회로를 연구하는 데 활용됩니다.

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기술 지원을 해주신 Joung Jang과 Xin Guan에게 감사드립니다. 버지니아 커먼웰스 대학교(Virginia Commonwealth University)의 로리 맥퀴스턴(Rory McQuiston) 박사가 첫 번째 패치 클램프 리그를 설정하고 실험 절차에 대해 조언해 주신 것에 감사드립니다. 전압 클램프 녹음에 대한 제안을 해주신 Samuel Wu 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 EY013811, EY022228 및 비전 코어 보조금 EY002520의 지원을 받습니다. C-KC는 베일러 의과대학의 Alice R. McPherson Retina Research Foundation 기부 의장입니다.

윤리 승인 - 기관 동물 관리의 승인과 의학의 베일러 대학의위원회를 사용할 때 동물 주제와 관련된 절차, 규칙 및 연구 동물을위한 건강 지침의 국립 연구소의 규정에 따라 실시 하였다. 1. 외부 및 내부 솔루션 <ol><li> 망막 박리시 이후 전기 생리 녹음에 외부 솔루션으로 포유 동물의 링거액을 사용합니다. 기록의 날 (칼슘)없이 10 배 원액에서 포유 동물의 링거액을 준비하고 carbogenation 15 분 (95 % O 2, 5 % CO 2) 후 염화칼슘 2 드롭 현명한을 추가합니다. 최종 1X 용액은 (mM 단위로)의 NaHCO3 0.8 나 2 HPO 4 0.1의 NaH 2 PO 4,이 CaCl2를 1 황산 10 D 글루코오스 (120)의 NaCl, 5 KCl을 25. </li><li> SAC 진동을 특성화하기 위해 두 개의 내부 솔루션을 사용합니다. 테스트성인 마우스 망막 신경절 세포에 장기간 전체 셀 패치 클램프 녹음에 준비된 솔루션의 유용성과는 사용할 때까지 -20 ° C에서 500 μL 씩의 확인 배치를 저장합니다. <ol><li> 막 잠재적 인 진동을 기록, (mm 단위)가 포함 된 칼륨 기반 내부 솔루션을 사용 : 125 K-글루코 네이트, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2 % biocytin (/ w V). KOH와 7.3의 pH를 조정합니다. </li><li> (100 CS-메탄, 8 염화나트륨, 4 ATP-마그네슘, 0.5 리튬 GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 0.2 % biocytin : 흥분성과 억제 성 시냅스 후 전류를 기록, (mm 단위)가 포함 된 세슘 기반 내부 솔루션을 사용 w / V). CsOH와 7.3의 pH를 조정합니다. </li></ol></li></ol> 기록의 날 2. 준비 <ol><li> 개방 구멍 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하기 위해, 수동으로 무딘 16 G 주사기 바늘로 이루어진 사용자 정의 펀칭기로 막을 펀치 개의 깨끗한 유리 플레이트 사이의 평탄 막. 도매상에 대한, 망막 마운트 직경 중앙 구멍을 0.2 mm을 직경 1-1.2 mm이다 4 큰 구멍으로 그것을 둘러싸고 있습니다. </li><li> 전극에 내부 솔루션을로드하기위한 사용자 정의 백필 필라멘트하려면 중간에 10 μL 피펫 팁을 용해하고 냉각 및 경화 될 때까지 부드럽게 녹아 부분을 길게. 직전, 사용이 약간 긴 패치 피펫보다 때까지 필라멘트를 잘라 깨끗한 면도날을 사용합니다. </li><li> 내부 필라멘트와 붕규산 유리 관에서 프로그램 풀러에 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일 가능한 Micropipette 제조 및 즉시 사용합니다. 참고 : 열 : 기록 주머니를 들어, 우리는 다음과 같은 풀러 설정 사용 484; 당기 : 0; 속도 : 25; 시간 지연 : 1; 압력 : 400, 462 붕규산 튜브의 OD 및 ID의 램프 값은 각각 1.65 mm, 1.0 mm이다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ이다. </li><li> 한 시간 조직 수확하기 전에, 샤키하여 내부 용액의 튜브를 해동&gt; 30 분 동안 소용돌이에 겨. </li></ol> 3. 망막 해부 <ol><li> 동물이 발가락 핀치에 응답을 잃을 때까지 산소에 4 % 이소 플루 란으로 동물을 마취. 자궁 전위에 의해 동물을 희생. </li><li> 멀리 직선 지적 홍채 가위로 시신경 헤드 1-2mm의 시신경 오프 모두의 시선을 잘라. </li><li> 혈액을 제거하고 carbogenated 포유 동물 링거액에서 그들을 젖어 깨끗한 종이 타월에 눈알을 굴립니다. 23 G 바늘로 윤부에 구멍을 펀치와 마이크로 가위로 윤부를 따라 절단하여 시선을 이등분. 미세 집게를 사용하여 각막과 렌즈를 제거합니다. <ol><li> 망막 전체 마운트를 들어, 부드럽게 미세 집게와 색소 상피 오프 전체 망막 박리 및 시신경의 머리를 향해 가장자리에서 4 1.5-2 mm 직교 인하합니다. </li></ol></li><li> 접시에 천공 니트로 셀룰로오스 막 담가 부드럽게 그것을 통해 망막을 드래그GCL면을 위로. 전체 마운트 망막을 준비 할 때 중앙 홀에 시신경의 머리를 놓습니다. 또 다른 깨끗한 접시에 망막과 멤브레인을 전송합니다. 부드럽게 몰타 십자가 모양과 구멍을 통해 네 개의 모서리를 배치하기 위해 미세 페인트 브러시와 망막을 평평. <ol><li> 망막의 일부가 한 번에 조사 할 경우, 색소 상피 세포가 부착 상태를 유지하여 면도날 3-4 개로 단계 3.3에서 제조 한 각각의 아이 컵 잘랐다. carbogenated 외부 용액에 빛에서 사용되지 않는 부분을 보호하고 12 시간 내에서 사용합니다. </li></ol></li><li> 건조 필터 종이와 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 가릴와 집게로 유리체 및 내부 경계 막 및 페인트 브러시를 제거합니다. </li><li> 모든 망막 가장자리가 완전히 바닥에 밀봉 된 유리 커버 슬립으로 기록 챔버로 어셈블리를 전송하기 전에 막에 부착되어 있는지 확인하십시오. 커버 슬립과 rehydrat에 진공 그리스와 멤브레인을 고정외부 솔루션 망막 전자. 어셈블리 아래에 공기 방울 트랩에주의하지 말라. </li><li> 직립 현미경의 무대에 챔버를 설정합니다. 분당 ~ 3 ㎖의 속도로 따뜻한 (34-35 ℃) carbogenated 외부 용액으로 관류 챔버. </li><li> 미분 간섭 대비 (DIC) 및 / 또는 표면 형광 아래 GCL 및 INL 뉴런을 볼 수있는 60 배 물 침지 렌즈를 사용하여 먼저 10 배 대물 렌즈에서 망막을 검사합니다. tdTomato 발현 보안 인증을 시각화 흰색은 554 나노 미터의 여기 필터 및 581 나노 미터의 방출 필터와 조합 된 LED 광원을 사용한다. </li></ol> 평면 마운트 망막 4. 전체 셀 패치 클램프 녹음 <ol><li> 사용자 지정 백업 광고 필라멘트에 주사기 필터를 통해 내부 솔루션을 필터링합니다. </li><li> 갓 뽑아 마이크로 피펫으로 필라멘트를 삽입하고 솔루션&gt;의은 전극 와이어를 커버 할 때까지 끝 근처의 내부 솔루션을 분배5mm. 가압 또는 튜브에 연결된 10 ㎖ 플라스틱 주사기의 플런저를 당김으로써 조정될 수있는 전극 내부의 압력을 통해 흡입 극 전극 홀더 상에 마이크로 피펫을 고정. </li><li> 목적 아래 피펫을 찾아 망막 위 ~ 100 μm의 아래로 가져. 전류 종동 모드 (I = 0)에서 DC가 기립 DC 전압 신호를 제로로 오프셋을. 이 욕에있는 동안 피펫을 고정 크기의 구형파 전류를 주입 전류 클램프 (I 클램프) 모드에서 피펫 저항을 측정하고 Raccess 노브를 돌려서 차이를 중화. 옴의 법칙에 의해 피펫 저항을 계산하기 위해 Raccess 노브에 읽기를 사용합니다. </li><li> 천천히 10 μm의 망막 위의 전극에 ~를 가져온다. 전극에 긍정적 인 압력을 적용합니다. 이 망막에 접근 피펫 팁 근처의 반사 변화를보십시오. 신속하게 그러나 부드럽게 GCL에 피펫을 강제하고 긍정적 인 pressu을 감소즉시 다시. </li><li> 표지 된 신경 세포를 향해 피펫을 이동합니다. 다른 신경, 혈관과 뮐러 세포의 endfeet 접촉하지 마십시오. 전극의 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 긍정적 인 압력을 적용합니다. </li><li> 딤플이 보일 때까지 레이블 신경 세포의 중간 선 근처에 피펫 팁을 배치합니다. 긍정적 인 압력을 해제하고 세포막은 피펫 팁에 다시 반송 할 수 있습니다. </li><li> 기가 옴 밀봉의 형성을 돕기 위해 피펫 20 120 pA에 부정적인 전류를 적용합니다. 피펫으로 세포막을 당길 필요 부드러운 흡입을 적용한다. 세포막을 파열 인감 형성 후 5 분을 기다립니다. 이 누출 된 내부 솔루션은 superfusion에 의해 삭제 될 수 있습니다. 부드럽게 흡인 막 파열. </li><li> 막 파열 후 현재 클램프 모드에있는 동안, 다리의 균형을 전환하고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다. 주 : 어떤 경우 SAC 같은 작은 세포의 경우, 단지 약간의 조정이 필요하다. Alternatively, 기록 흥분성 각각 (0 MV 주위)에 (-75 MV 주변) 클로라이드의 반전 전위에서 셀과 글루타메이트를 유지하여 전압 클램프 모드 (V 클램프)의 억제 시냅스 전류. 확인하고 가끔 망막 및 / 또는 미세 조작기 드리프트를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 조정합니다. </li><li> 신선에 (예 CNQX, AP5, 피크로 톡신, tubocurarine 등) 및 채널 변조기 (예 flupirtine, 도파민 meclofenamic 산 등) 시냅스 차단제 준비 과정 및 약물 치료 전후 막 전위 또는 전류 변화를 기록 할 냉동 주식에서 실험의 날. carbogenated 링거액과 함께 약물을 희석. 관류를 통해 일괄 적으로 적용 할 수 있습니다. </li><li> 녹화 후, 부드럽게 소마에서 피펫을 제거합니다. 깨끗한 접시에 실에서 어셈블리를 전송합니다. 분리 및 천공 HOL하지 않고 다른 평평 니트로 셀룰로오스 막에 망막을 재 부착ES는 고정 동안 망막 평탄도를 확인합니다. </li><li> RT에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드에 침지하여 망막 수정. 니트로 셀룰로오스 막에서 망막을 제거하고 1X PBS로 광범위하게 그것을 씻어. 4 ° C (14)에 0.4 % 트리톤 X-100과 1X PBS에 희석 염료 결합 된 스트렙 타비 딘과 O / N 염색으로 기록 된 세포의 형태를 알 수있다. antifade 매체에서 망막을 마운트하고 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 기록 된 세포를 관찰합니다. 참고 : 휘발성과 독성이 파라 포름 알데히드를 포함하는 절차는 안전을위한 초안 챔버에서 수행되어야한다. </li></ol>

<ol><li>Choi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+bursting+of+AII+amacrine+cells+underlies+oscillations+in+the+rd1+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina.</a> J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).</li>
<li>Gregg, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nyctalopin+expression+in+retinal+bipolar+cells+restores+visual+function+in+a+mouse+model+of+complete+X-linked+congenital+stationary+night+blindness%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Nyctalopin expression in retinal bipolar cells restores visual function in a mouse model of complete X-linked congenital stationary night blindness.</a> J Neurophysiol. 98 (5), 3023-3033 (2007).</li>
<li>Hellmer, C. B., Ichinose, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+light-evoked+postsynaptic+responses+in+neurons+in+dark-adapted%2C+mouse+retinal+slice+preparations+using+patch+clamp+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Tu, H. Y., Bang, A., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dendritic+branching+in+direction+selective+retinal+ganglion+cells+in+nob1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Increased dendritic branching in direction selective retinal ganglion cells in nob1 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (13), (2014).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., Chiao, C. C., McQuiston, A. R., Chen, C. K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+membrane+potential+fluctuations+of+cholinergic+amacrine+cells+in+mice+lacking+ERG+b-waves%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Rhythmic membrane potential fluctuations of cholinergic amacrine cells in mice lacking ERG b-waves.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+maintain+eye-specific+segregation+in+nob%2C+a+mutant+with+abnormally+patterned+retinal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Failure to maintain eye-specific segregation in nob, a mutant with abnormally patterned retinal activity.</a> Neuron. 50 (2), 247-259 (2006).</li>
<li>Tu, H. Y., Chen, Y. J., McQuiston, A. R., Chiao, C. C., Chen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Retinal+Oscillation+Mechanism+in+an+Autosomal+Dominant+Photoreceptor+Degeneration+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Novel Retinal Oscillation Mechanism in an Autosomal Dominant Photoreceptor Degeneration Mouse Model.</a> Front Cell Neurosci. 9, 513(2015).</li>
<li>Borowska, J., Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intrinsic+neural+oscillator+in+the+degenerating+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An intrinsic neural oscillator in the degenerating mouse retina.</a> J Neurosci. 31 (13), 5000-5012 (2011).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+spontaneous+ganglion+cell+spike+activity+in+animal+models+of+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of spontaneous ganglion cell spike activity in animal models of retinitis pigmentosa.</a> J Ophthalmol. , (2011).</li>
<li>Stasheff, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+sustained+spontaneous+hyperactivity+and+temporary+preservation+of+OFF+responses+in+ganglion+cells+of+the+retinal+degeneration+%28rd1%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Emergence of sustained spontaneous hyperactivity and temporary preservation of OFF responses in ganglion cells of the retinal degeneration (rd1) mouse.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1408-1421 (2008).</li>
<li>Trenholm, S., Awatramani, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+spontaneous+activity+in+the+degenerating+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of spontaneous activity in the degenerating retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 277(2015).</li>
<li>Trenholm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+oscillatory+activity+arising+within+the+electrically+coupled+AII+amacrine-ON+cone+bipolar+cell+network+is+driven+by+voltage-gated+Na%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic oscillatory activity arising within the electrically coupled AII amacrine-ON cone bipolar cell network is driven by voltage-gated Na+ channels.</a> J Physiol. 590 (Pt 10), 2501-2517 (2012).</li>
<li>Chen, C. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+changes+in+displaced+cholinergic+amacrine+cells+lacking+Gbeta5%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous changes in displaced cholinergic amacrine cells lacking Gbeta5.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (7), (2015).</li>
<li>O'Brien, B. J., Isayama, T., Richardson, R., Berson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+physiological+properties+of+cat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic physiological properties of cat retinal ganglion cells.</a> J Physiol. 538 (Pt 3), 787-802 (2002).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unconventional+Glutamatergic+Circuit+in+the+Retina+Formed+by+vGluT3+Amacrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unconventional Glutamatergic Circuit in the Retina Formed by vGluT3 Amacrine Cells.</a> Neuron. 84 (4), 708-715 (2014).</li>
<li>Hoggarth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+wiring+of+distinct+amacrine+cells+in+the+directionally+selective+retinal+circuit+permits+independent+coding+of+direction+and+size%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Specific wiring of distinct amacrine cells in the directionally selective retinal circuit permits independent coding of direction and size.</a> Neuron. 86 (1), 276-291 (2015).</li>
<li>Margolis, D. J., Gartland, A. J., Singer, J. H., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+oscillations+drive+correlated+spiking+of+ON+and+OFF+ganglion+cells+in+the+rd1+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Network oscillations drive correlated spiking of ON and OFF ganglion cells in the rd1 mouse model of retinal degeneration.</a> PLoS One. 9 (1), e86253(2014).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li>
<li>Ivanova, E., Yee, C. W., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+phosphorylation+of+Cx36+gap+junctions+in+the+AII+amacrine+cells+of+RD+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased phosphorylation of Cx36 gap junctions in the AII amacrine cells of RD retina.</a> Front Cell Neurosci. 9, 390(2015).</li>
<li>Enoki, R., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+horizontally+sliced+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A method of horizontally sliced preparation of the retina.</a> Methods Mol Biol. 935, 201-205 (2013).</li>
<li>Akrouh, A., Kerschensteiner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+function+of+three+VIP-expressing+amacrine+cell+types+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphology and function of three VIP-expressing amacrine cell types in the mouse retina.</a> J Neurophysiol. 114 (4), 2431-2438 (2015).</li>
<li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li>
</ol>

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많은 실험실이 준비 15-18을 마운트 평평에서 GCL 신경 세포에서 기록했지만, 우리의 절차는 INL 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 우리는 이에 성공 일상적인 레코딩을위한 중요한 몇 가지 단계를 강조한다. 망막의 신선도 및 평탄성 기록 피펫을 관통 중요하다. 이 점에있어서, 상기 천공 된 니트로 셀룰로오스 막에 대한 망막의 확고한 부착 최우선 적시 재수 (단계 3.4-3.6)이어서 용액의 과도 흡수에 의해 달성된다. 이 짧은 기간 동안, 보통 미만 30 초, 유리체는 느슨한 젤리처럼 동작 및 박리 할 수있다. 유리체 수동 용액 17,19 또는 18,20 효소 작업에 의해 제거되어 여러 문서 절차에 비해 우리의 기술이 더 효율적이다. 또 다른 자주 사용되는 방법은 각 셀에 대해 빈 패치 피펫을 사용하여 떨어져 내 경계 막 찢어하는 것입니다21, 22를 기록합니다. 우리는 망막을 해체 두려워 인열 ...

망막은 중추 신경계에서 쉽게 접근할 수 있는 부분으로서 수십 년 동안 신경 과학 연구에서 유용한 모델이었습니다. 뉴런의 유전적 표시는 망막의 시냅스 연결을 자세히 특성화할 수 있게 해주었습니다. 망막 뉴런의 기능과 형태를 조사하는 데 사용할 수 있는 많은 방법론을 통해 패치 클램프 기록 기술은 망막에서 수직으로 전달된 신호에 대한 현재 이해에 중요한 역할을 했습니다. 이러한 신호는 광수용체의 광자 흡수에서 비롯되어 망막 신경절 세포(RGC)의 스파이크를 통해 뇌 시각 중추로 보내집니다. 지금까지 축적된 많은 지식에도 불구하고 혈관화된 포유류 망막의 신경 다양성은 해결되지 않은 상태로 남아 있으며 정상적인 시력을 제공하는 망막 회로의 완전한 인식을 방해합니다. 이것은 부분적으로는 대부분의 녹음이 더 많은 근위 망막 뉴런1-3에 접근하기 위해 측면 회로 무결성을 교환하기 위해 망막 절편에서 수행되었기 때문입니다. 따라서 망막이 시각 신호를 계산하는 방법에 대한 포괄적인 그림을 얻기 위해서는 크고 작은 측면 연결이 더 잘 보존될 수 있는 플랫 마운트에 뉴런을 기록하는 것이 바람직합니다.
탈분극 양극성 세포4-6에서 대사성 글루타메이트 수용체 6(mGluR6) 신호 경로의 결함으로 인해 광수용체에서 양극성 세포로의 시냅스 전달이 중단되거나 단순히 퇴행성망막 7-10의 광수용체 손실로 인해 많은 망막 신경절 세포가 진동 활동을 보입니다. 이러한 진동은 여러 출처에서 발생하지만, AII 무축삭 세포(AII-ACs)와 탈분극 원뿔 양극성 세포(DCBC) 사이의 간극 접합 결합과 관련된 진동이 가장 주목을 받았기 때문에 가장 잘 이해되고 있습니다1,7,11. 우리는 앞서 언급한 AII-AC/DCBC 네트워크의 약리학적 차단에도 지속되고 탈구성 망막을 가진 RhoΔCTA 및 Nob 마우스에서 OFF-type SAC의 진동을 유도하는 또 다른 소스를 찾았습니다7,8,12. 여기에서는 INL 뉴런 기록을 위해 망막 플랫 마운트를 준비하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 접근 방식은 상용 마우스 라인(Jax, 재고 번호 006410 및 007905)을 사용하여 콘트라스트 향상 광학 장치가 장착된 형광 현미경에서 식별할 수 있는 형광 단백질(tdTomato) 발현으로 콜린성 망막 뉴런을 표시합니다. 이 접근법을 통해 얻은 일부 실험 결과는 이전에 보고된 바 있다4,5,7,13.

<table><tbody><tr><td>DIC 고정 스테이지 형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51-WI</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>AM 시스템</td><td>AM2400</td><td></td></tr><tr><td>AD 컨버터</td><td>National Instrument</td><td>NI-USB-6221</td><td></td></tr><tr><td>히터 컨트롤러</td><td>Warner Instrument</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>인라인 히터</td><td>Warner Instrument</td><td>SC-20</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Rainin</td><td>Dynamax</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>필라멘트가 있는 유리관</td><td>King Precision Glass</td><td>맞춤형</td><td></td></tr><tr><td>자극기</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328-1</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>ATP-Mg</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>Sigma</td><td>G5884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E0396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>시그마</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Cs-메탄설포네이</td>트 <td>시그마</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>시그마</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Nalgene</td><td>171</td><td></td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td>Rainin</td><td></td><td></td>17013002</tr><tr><td>10 &mu; l 피펫 팁</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-130RL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-488</td><td>ThermoFisher</td><td>S-11223</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td></td></tr></tbody></table>

deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

포유류의 망막 신경 세포는 여러 종류로 이루어지는 층상 티슈이다. 그 복잡한 시냅스 네트워크 내에서 처리하는 방법을 시각적 신호를 이해하기 위해, 전기 생리 녹음 자주 개별 뉴런 사이의 연결을 연구하는 데 사용됩니다. 우리는 마우스 망막의 GCL (신경절 세포 층) 및 INL 모두 유 전적으로 표시 뉴런의 패치 클램프 기록 (내부 핵 층)에 대한 평면 장착 준비를 최적화했다. 수직 및 횡 방향 모두 연결이 전 구성에 보존되어 있기 때문에 평면 마운트에 기록 INL 신경 세포를 연구하는 많은 측면 구성 요소와 망막 회로를 허용 조각을 통해 선호한다. 우리는 콜린성 스타 버스트 무 축삭 세포 (보안 인증)으로 망막의 거울 트너가 신경 세포의 반응을 비교하기 위해이 절차를 사용하고 있습니다.

ON-와 deafferentated 마우스 망막에서 OFF 형 주머니의 대표적인 녹음은 그림 1에 나타내었다. GCL 및 INL 모두 콜린성 세포를 안정적으로 tdTomato 형광에 의해 식별 및 DIC에서 전체 셀 패치 클램프 녹음 대상이 될 수 있습니다 (그림 1A) 그들의 막 전위 (상단 트레이스) 및 (하단 흔적, 그림 1B)를 구동 시냅스 전류의 진동을 공개합니다. 억제 및 흥분성 시냅스 전류는 전압 클램프 조건 (그림 1B, 바닥 흔적)에서 각각 0 MV과 -75 MV,에서 세포를 잡고 공개됩니다. IPL을 (그림 1C)에서 전형적인 SAC 수지상 arborization 및 층화 수준은 내부적으로 투석 biocytin에 대한 사후 스트렙 타비 딘 염색으로 시각화 할 수 있습니다. 의 리듬과 막...

이 프로토콜은 평면 장착 준비에서 망막 신경 세포에 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 평편하게 고정된(flat-mount) 마우스 망막 표본의 내망막 뉴런에서 전세포 패치 클램프(whole-cell patch clamp) 기록을 수행하는 것입니다. 이 방법은 뉴런의 다양성, 정상 및 병리적 조건에서의 시냅스 연결과 같이 망막 신경생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수직 및 수평 연결이 모두 보존되어, 광범위한 수평 구성 요소를 가진 망막 회로를 연구할 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 망막이 매우 얇고 섬세한 조직이며 세심한 주의와 인내심을 가지고 다뤄야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. 하지만 숙련도를 높이는 가장 좋은 방법은 연습입니다. 이 절차를 시작하려면, 깨끗한 종이 타월로 마우스의 안구를 굴려 혈액을 제거하십시오.그 다음, 탄산가스가 포화된 포유류용 Ringer 용액에 침전시킵니다. 이어서 23게이지 바늘로 각막연에 구멍을 낸 후, 미세 가위로 각막연을 따라 절개하여 안구를 이등분합니다. 그런 다음, 미세 핀셋을 사용하여 각막과 수정체를 제거합니다.망막 전체 마운트(whole-mount)를 위해, 미세 핀셋을 사용하여 색소 상피에서 망막 전체를 조심스럽게 벗겨내고, 가장자리에서 시신경 유두 방향으로 1.5~2mm 간격의 직교 절개를 4회 실시합니다. 그 후, 펀칭된 니트로셀룰로오스 막을 디쉬에 담그고 GCL 면이 위로 향하게 하여 망막을 그 위로 조심스럽게 끌어당깁니다. 그런 다음, 전체 마운트 망막을 준비할 때 시신경 유두가 중앙 구멍에 위치하도록 배치합니다.그 후, 망막이 부착된 막을 다른 깨끗한 접시로 옮깁니다. 세밀한 붓을 사용하여 망막을 몰타 십자 모양으로 조심스럽게 펴고, 네 모서리 모두가 구멍 위에 놓이도록 배치합니다. 건조한 여과지로 니트로셀룰로오스 막을 가볍게 닦아내고, 핀셋과 붓을 사용하여 유리체와 내경계막을 제거합니다.조립체를 바닥에 밀폐된 유리 커버슬립이 있는 기록 챔버로 옮기기 전에, 모든 망막 가장자리가 막에 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 진공 그리스를 사용하여 막을 커버슬립에 고정하고 외부 용액으로 망막을 재수화하십시오. 조립체 아래에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.다음으로, 챔버를 정립 현미경의 스테이지 위에 놓습니다. 약 3 mL/min의 속도로 34 °C의 카보젠 처리된 외부 용액을 챔버에 충분히 흘려줍니다. 먼저 10배 대물렌즈로 망막을 관찰합니다.그 다음, 60x 수침 렌즈를 사용하여 DIC 및 에피형광 설정 하에서 GCL 및 INL 뉴런을 관찰합니다. tdTomato를 발현하는 SAC를 시각화하려면, 554 nanometers의 여기 필터 및 581 nanometers의 투과 필터와 함께 백색 LED 광원을 사용하십시오. 이 과정에서 내부 용액을 시린지 필터로 걸러 맞춤형 역행성 충전 필라멘트로 주입합니다.그다음, 새로 제작한 마이크로피펫에 필라멘트를 삽입하고, 내부 용액이 은 전극 와이어를 5 mm 이상 덮을 때까지 팁 근처에 분주합니다. 이후, 마이크로피펫을 전극 홀더에 고정하며, 이때 10 mL 플라스틱 주사기와 연결된 튜브의 플런저를 밀거나 당겨 전극 내부의 압력을 조절할 수 있는 흡입 풀(suction pull)을 이용합니다. 다음으로, 대물렌즈 아래에 피펫을 위치시키고 망막 위 약 100 µm 높이까지 내립니다.현재의 전류 팔로워 모드(follower mode)에서, DC 오프셋을 사용하여 정지 DC 전압 신호를 0으로 맞춥니다. 피펫이 목욕조(bath)에 있는 동안 피펫을 통해 고정 진폭의 사각파 전류를 주입하여 전류 클램프 모드에서 피펫 저항을 측정합니다. Raccess 노브를 돌려 그 차이를 중화시키고, 노브의 읽기 값을 사용하여 피펫 저항을 계산합니다.그 후, 전극을 망막 상단 약 10 micrometers 지점까지 천천히 이동시킵니다. 전극에 양압을 가합니다. 그런 다음, 피펫 팁이 망막에 접근함에 따라 팁 근처의 반사 양상이 변하는 것을 관찰하십시오.피펫을 빠르게 하지만 조심스럽게 GCL 내부로 밀어 넣은 뒤, 즉시 양압을 줄입니다. 피펫을 표지된 뉴런 쪽으로 이동시키되, 다른 뉴런, 혈관 및 뮬러 세포(Muller cells)의 종말발(endfeet)과 접촉하지 않도록 주의합니다. 전극 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 양압을 더 가합니다.다음으로, 보조개 모양의 함몰이 보일 때까지 피펫 팁을 표시된 뉴런 근처에 위치시킵니다. 그런 다음 양압을 해제하여 세포막이 피펫 팁 위로 다시 튀어 오르게 합니다. 기가옴 씰(gigaohm seal) 형성을 돕기 위해 피펫에 20에서 120 picoamps의 음전류를 가합니다.양압을 해제한 후 세포막이 다시 튀어 오르도록 하는 것이 중요한데, 이는 기록 후 세포의 형태를 보존하기 위해 세포막과 피펫 입구 사이에 자연스럽게 형성된 우수한 밀봉(seal)이 필요하기 때문입니다. 필요한 경우, 가벼운 흡입력을 가하여 형질막을 피펫 안으로 끌어당깁니다. 밀봉이 형성된 후 5분 동안 대기하여 세포막을 파열시키면, 흘러나온 내부 용액이 표면 세척(superfusion)을 통해 제거될 수 있습니다.세포막을 파쇄한 후, 전류 클램프 모드에서 브릿지 밸런스를 켜고 Raccess 노브를 사용하여 조정합니다. 전압 클램프 모드에서 세포를 역전 전위에 유지하여 흥분성 및 억제성 포스트시냅스 전류를 기록합니다. 기록이 끝나면 소마에서 피펫을 천천히 제거합니다.조립체를 챔버에서 깨끗한 접시로 옮깁니다. 그 다음, 고정 과정 동안 망막의 평평함을 유지하기 위해 구멍을 뚫지 않고 망막을 떼어내어 다른 평평한 니트로셀룰로오스 막에 다시 부착합니다. 이제 조직이 염색 준비가 되었습니다.이 이미지들은 GCL과 INL 모두에서 콜린성 세포를 tdTomato 형광으로 확실하게 식별할 수 있으며, DIC 하에서 전세포 패치 클램프 기록의 표적으로 삼을 수 있음을 보여줍니다. 막 전위의 진동은 전류 클램프 기록을 통해 확인할 수 있으며, 억제성 및 흥분성 시냅스 전류에 의해 유도되는 진동은 전압 클램프 조건에서 세포를 각각 0 mV 및 -75 mV로 유지함으로써 확인할 수 있습니다. 여기서 기록된 세포의 실험 후 조직학적 특성 분석 결과, IPL 내에서 전형적인 SAC 수지상 돌기 형태와 층판 수준이 나타남을 보여줍니다.이 절차를 시도할 때, 기록 가능한 샘플을 얻기 위해 망막막 어셈블리를 기록 챔버 내에 견고하고 정교하게 고정하고, 아래쪽에 공기 방울이 갇히지 않도록 주의하며 재수화하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 대상 다중 세포의 진동이 동일한 시냅스 메커니즘에 의해 유도되는지 등 추가적인 질문에 답하기 위해 듀얼 패치 클램프 기록과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발은 망막 신경생물학 분야의 연구자들이 광수용체 변성 망막에서 인접한 망막 뉴런 간의 진동 동기성을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.이 영상을 시청한 후에는 유리체를 제거하고 망막 신경절 세포의 표적 전규모 패치 클램프 기록을 위한 망막 플랫 마운트(flat-mount)를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 electrophysiological 레코딩을위한 마우스 망막의 어두운 적응 조각을 생성하는 절차를 설명합니다.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

이 비디오는 플랫 마운트 마우스 망막에서 전기 생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 기술을 보여줍니다. 전극이 있는 얇은 유리 피펫을 사용하여 망막 내의 별방울 무축삭 세포(SAC)에 접근합니다. 씰을 형성한 후 흡입이 가해져 멤브레인을 파열하고 전체 세포 패치 클램프 구성을 형성합니다. 마지막으로, SAC 시냅스 수용체를 통한 이온의 흐름은 구성을 사용하여 측정됩니다.

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from a Flat-Mount Mouse Retina

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

이 비디오 문서에서는 세포 기관을 패치하는 셋업 절차 및 방법 전체 마운트 마우스 망막의 신경절 세포에서 동적 클램프 레코딩을 구현하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 흥분성과 억제 시냅스 입력의 정확한 기여도 조사 및 신경 스파이크에 대한 상대적인 크기와 타이밍을 할 수 있습니다.

마우스 망막 신경절 세포의 시냅스와 인공 컨덕턴스와 동적 클램프 구현

우리는 쥐의 눈에서 망막 절편을 준비하고 망막 뉴런의 빛 반응을 기록하는 방법을 보여줄 것입니다. 전체 절차는 어두운 환경에서 수행됩니다.

녹화 패치 클램프 기술을 사용하여 어두운 적응 마우스 망막 슬라이스 준비에 신경 세포의 시냅스 응답 빛-유발

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

우리는 망막 표면에 평행하게 절편의 평면과 성인 포유류 망막의 수평 슬라이스 준비를 개발했다. nonradially 중심 망막 신경 세포의 수지상 필드 패치 클램프 및 이미징 기술과 신호 처리의 연구를 허용, 절단되지 않았다.

전기 생리 연구 성인 마우스 망막의 수평 슬라이스의 준비

이 연구는 광수용체 세포체를 제거함으로써 면역조직화학, in situ hybridization 및 전기생리학 실험을 위해 더 빠른 항체 확산과 내부 망막 뉴런에 대한 패치 피펫 접근을 개선할 수 있는 대체 편평 장착 망막 제제를 제시합니다.

척추동물 망막의 내부 핵층 뉴런 연구를 위한 개선된 평판 준비로서의 망막 분할

학습하세요 마우스 망막 플랫 마운트에서 별 모양 무축삭 세포의 패치 클램프 기록 방법을. 이 기법은 수직 및 수평 시냅스 연결을 보존하여 망막 신경회로를 연구하는 데 활용됩니다.

Deafferentated 마우스 망막의 플랫 마운트 준비에 별 모양 무 축삭 세포의 패치 클램프 녹음

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