3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

이 프로토콜의 전반적인 목표는 표준 실험실 장비를 사용하여 생물학적 표본의 고해상도 3D 디지털 이미지를 신속하게 획득하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 형태학적 특징의 시각화와 역학을 통해 발달 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 실험실 장비를 사용하고 최소한의 사전 경험이 필요하다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Jungang Huang입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배아를 해부 및 고정한 후 고정제를 투명용액으로 교체하고 1-2주 동안 실온의 로커에서 표본을 부드럽게 회전시킵니다. 배양이 끝나면 표본을 10% 포르말린으로 옮기고 로커에 2일 더 둡니다.

세 번째 날에는 PBS에서 샘플을 5분씩 3회 세척합니다. 그런 다음 실온에서 상행 에탄올 시리즈로 샘플을 탈수하고 각 농도에 대해 2시간 동안 부드러운 로커에서 탈수합니다. 100% 에탄올 탈수 후 검체를 빛으로부터 보호된 염색 용액으로 1시간 동안 옮깁니다.

그런 다음 용액을 새 염색 용액으로 교체하여 검체를 밤새 라벨링합니다. 다음 날 아침, 갓 준비한 침투 용액과 염색 용액을 1-1 부피 혼합물에 샘플을 섭씨 4도의 로커에서 최소 3시간 동안 담그십시오. 배양이 끝나면 배아를 침투 용액으로 옮겨 3시간 동안 다시 흔들며 배양합니다.

그런 다음 상층액을 새 침투 용액으로 교체하여 섭씨 4도에서 3일 더 흔듭니다. 넷째 날에는 배아를 임베딩 몰드에 넣고 주형을 얼음 위에 놓습니다. 용액 B를 침투 용액과 혼합한 다음 금형을 섭씨 4도의 차가운 임베딩 용액에 부드럽게 담그십시오.

약 3시간 후 팁을 사용하여 용액이 응고되었는지 확인하고 시편을 금형 밖으로 밀어냅니다. 여분의 임베딩 재료를 잘라낸 다음 새 금형에서 시편 블록을 십자 방향으로 재배치합니다. 다음으로, 전체 설정을 흄 후드의 얼음 위에 놓습니다.

금형이 잠길 때까지 새 금형에 임베딩 용액을 부드럽게 추가합니다. 그런 다음 금형 위에 블록 홀더를 놓습니다. 3-4시간 후 임베딩 주형을 벗겨내고 블록을 경사 조명이 있는 실체 현미경 아래에 놓아 블록 내 표본의 위치를 확인합니다.

블록 면에서 시편 주위에 그리드 선을 표시하고 선을 가이드로 사용하여 과도한 임베딩 재료를 트리밍합니다. 표본을 이미지화하려면 먼저 블록을 마이크로톰에 고정하고 표본의 새로운 표면 절단을 얻습니다. 그런 다음 표본의 블록 면을 수평으로 향하게 실체 줌 현미경을 장착하고 현미경과 함께 제공되는 컴퓨터를 켭니다.

다음으로, 이미지 획득 소프트웨어를 시작하고 이미징 소프트웨어의 라이브 뷰 모드를 사용하여 광학 장치를 블록 면에 초점을 맞춥니다. 블록 면이 view파인더의 중앙에 오도록 필요에 따라 현미경과 마이크로톰을 정렬합니다. 이 절차의 가장 중요한 단계 중 하나는 마이크로톰의 고정된 홈 위치에서 이미지를 획득하는 것입니다.

줌을 조정하여 전체 블록 면이 뷰파인더 내에 있는지 확인합니다. 그런 다음 녹색 형광 단백질 필터를 선택합니다. 표본 조직이 나타날 때까지 블록을 미리 절단하고 필요에 따라 이미지의 초점을 다시 맞춥니다.

노출 시간을 수동으로 측정하고 설정한 후 각각의 새로운 절단 후 블록 면의 이미지를 획득 및 저장하고 중요한 이미지 획득 매개변수를 기록합니다. 이미징 세션이 끝나면 모든 이미지 파일을 JPEG 형식으로 내보내고 변환한 다음 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지를 반전시키고 필요에 따라 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다. 지침에 따라 처리된 모든 이미지를 3D 시각화 소프트웨어에 업로드합니다.

자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 정렬하고 3D 및 2D 결과를 표시합니다. 이 대표적인 이미지에서, 배아일의 전체 마운트 표면 보기에서, 15.5 마우스 배아가 방금 시연된 바와 같이 준비되고 이미지화되었습니다. 수염 패드와 발달 중인 모낭을 포함한 피부의 상세한 형태학적 특징을 관찰할 수 있습니다.

중요한 것은 이 방법으로 이미지화된 배아 15.5일 표본의 가상 단면도 해상도가 표준 조직학적 단면도와 유사하다는 것입니다. 일단 마스터하면 세정 용액으로 전처리 한 후 전체 절차를 올바르게 수행하면 일주일 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 침투 및 포매 단계에서 염색 용액을 빛으로부터 4도로 보호하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 스케일 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 세포 유형의 특정 분포 패턴에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형태 분석을 위해 생물 표본의 고해상도 3D 이미지를 획득하기 위해 실험실 장비를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 고정, 얼룩 및 침투 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드에서 작동하고 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.