Name: 3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 고해상도 에피스코픽 현미경을 이용한 생물학적 표본의 3차원 영상 획득 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 복잡한 형태학적 특징을 시각화하고 정량 분석하는 데 활용됩니다.

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기술 지원에 대해 Yichen Huang, Chunming Guo 및 Zhenfang Zhou 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NIDDK(1R01DK091645-01A1, XL) 및 미국심장협회(AHA, 13GRNT16950006, XL)의 지원을 받았습니다.

모든 동물의 사용은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다. 1. 샘플 준비 <ol><li> 시간 제한 짝짓기 <ol><li> 같은 케이지에서 함께 C57BL6 야생 형 남성과 여성을 배치합니다. </li><li> 상대 플러그의 형성 초기에 다음날 아침에 확인합니다. 결합 플러그 (일명, 질 또는 교미 플러그) 차단 질을 강화 된 젤라틴 증착이다. </li><li> 배아 일 0.5 (E0.5)와 같은 플러그 날짜를 설정합니다. </li></ol></li><li> 마우스 배아의 분리 <ol><li> CO 2 질식에 의해 임신 한 여성을 안락사. </li><li> 흡수 패드 부정사 쥐를 넣고 70 % 에탄올로 복부를 스프레이. </li><li> 피부를 들어 올려 수술 가위를 사용하여 꼬리 복부에서 초기 5mm 절개를합니다. 잘라 완전히 내부 장기를 노출 복부 피부를 제거 </li><li> 버지니아 근처 잘라GINA는 전체 자궁을 제거합니다. </li><li> 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 잘라. 각 세그먼트 또는 수태 안에 하나의 배아를해야한다. </li><li> 1 배 얼음처럼 차가운 인산 완충 식염수 (PBS)에서 자궁 세그먼트를 유지합니다. </li></ol></li><li> 배아 해부 <ol><li> 입체경 아래에 얼음처럼 차가운 PBS와 별도의 접시에 각각의 수태를 놓습니다. </li><li> 순차적으로 미세 해부 집게를 사용하여 자궁 조직, 태반 후 태아의 세포막을 제거합니다. </li><li> 1 배 얼음 차가운 PBS 큰 전송 피펫을 사용하여 함께 50 ML 튜브에 해부 배아를 전송합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해 집게와 직접 배를 따기 마십시오. </li></ol></li><li> 정착 <ol><li> 정착액의 10 샘플 볼륨보다 24 시간 동안 4 ° C에서 10 % 중성 완충 포르말린 용액의 해부 배아를 수정합니다. </li></ol></li><li> 전처리 <ol><li> 어음 솔루션을 준비 : 4M 우레아, 증류수 10 % 글리세롤 4 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS). </li><li> 어음 솔루션과 정착액을 교체합니다. </li><li> 이주 - 조심스럽게 1 시간 동안 실온에서 로커에 시료를 회전한다. 두 번째와 세 번째 날에 한 번 클리어 솔루션을 교환한다. 시편 천천히 명확하고 반투명하게된다. </li><li> 10 % 포르말린으로 지우기 솔루션을 교체하고 2 일 동안 로커에 둡니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 5 분마다 1X PBS로 3 회 전처리 샘플을 씻으십시오. </li><li> 부드러운 로커에 실온에서 상승 에탄올 시리즈 샘플 탈수. E15.5 태아를 들어, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 및 100 % 에탄올, 2 시간의 각 단계를 포함하는 상승 에탄올 시리즈를 사용한다. 이전 배아, 배양 시간을 증가시킬 필요가있다. </li></ol></li><li> 더럽히는 것 <ol><li> 에오신 Y 품목 소금과 0.02 0.1375 g을 추가 염색 용액을 제조아 크리 딘 오렌지 헤미 (아연 클로라이드) 100 % 에탄올 50ml로 소금 75g. 2 시간 동안 교반한다. 필터 종이 필터. 실온에서 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오. </li><li> 1 시간 동안 염색 용액에 시료를 전송합니다. </li><li> 신선한 염색 솔루션 및 얼룩 하룻밤로 교체하십시오. </li></ol></li><li> 침투 <ol><li> 침투 솔루션을 준비 : JB-4 삽입 키트의 해결 방법 100 ㎖, 촉매 C 1.25 g, 에오신 Y 품목 소금의 0.275 g 및 아 크리 딘 오렌지 헤미 (염화 아연) 염 0.055 g을 결합한다. 2 시간 동안 얼음 버킷 (200 RPM) 혼합 교반 한 후 여과지로 걸러. </li><li> 4 ° C에서 침투 솔루션을 저장하고 알루미늄 호일로 덮어 빛을 피하십시오. </li><li> (1 : 1) 염색 솔루션 : 솔루션을 침투하기 위해 배아를 전송, 4 ° C에서 로커에 적어도 3 시간 동안 배양한다. </li><li> 솔루션을 침투하기 위해 배아 전송하고 3 시간 동안 배양추운 방에 로커에 대한 연구. </li><li> 한 번 매일 침투 솔루션을 대체, 3 일 이상 부드러운 로커에 추운 방에 둡니다. </li></ol></li></ol> 2. 퍼가기 <ol><li> 얼음에 해결 B 및 침투 솔루션을 유지합니다. </li><li> 바로 삽입하기 전에 (용액 B 및 침투 솔루션 1:25) 임베딩 솔루션을합니다. </li><li> 포함 금형 동양 시편은, 부드럽게 삽입 금형에 차가운 임베딩 솔루션을 붓는다. 다시 방향 필요한 경우 핀. </li><li> 퍼가기 솔루션이 응고되어 있는지 여부를 조사하기 위해 핀을 사용합니다. 시편 블록을 밀어하고, 필요한 경우 트림. </li><li> 교차 방향을 얻기 위하여 별도의 금형을 사용하여 시험편 블록의 방향. </li><li> 매립 금형의 상단에 블록 홀더를 넣습니다. 금형 및 블록 홀더 솔루션을 포함하기로 침수 될 때까지 조심스럽게 금형에 임베딩 솔루션을 붓는다. </li><li> 보조 용기에 시료를 유지하고 맡겨흄 후드에서 4 시간 - 3 얼음. </li><li> 4 °의 C에서 응고 표본을 저장합니다. </li><li> 매입 형을 벗겨. 블록의 시험편의 위치를 ​​검사하도록 경사 조명하여 실체 현미경 블록을 넣는다. 시편 주변 블록의 얼굴에, 마크 그리드 선. </li><li> 참조로 표시된 눈금 선을 이용하여 물질을 매립 접근 양을 제거 할 수있는 블록을 낸다. </li></ol> 3. 이미지 인식 <ol><li> 마이크로톰에 시편 블록을 고정하고 신선한 잘라 표면을 구하십시오. 설정 섹션 두께 (예를 들어, e9.5-10.5, 1.5 μm의, e11.5-12.5, 2.0 μm의, e13.5-15.5, 2.5 μm의, E16.5-이전, 3 μm의). 마이크로톰의 홈 위치에서 시료 / 블록을 유지합니다. </li><li> 수평 시편의 블록 표면에 직면 스테레오 줌 현미경을 탑재합니다. </li><li> 컴퓨터와 현미경 켜고 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 시각화 및 블록면에 광학 초점이미징 소프트웨어의 &#39;라이브 뷰&#39;모드에서. </li><li> 블록 얼굴이 뷰 파인더의 중심에 있도록 필요한 경우 현미경 마이크로톰을 맞 춥니 다. </li><li> 전체 블록 얼굴이 뷰 파인더 안에 들어 오도록 줌을 조정합니다. </li><li> 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 (여자 470 ± 20 nm의, 다이크로 익 495 nm의, 방출 525 ± 25 nm의)를 선택하고 필요한 경우 집중할. </li><li> 수동 측정하고 노출 시간을 설정 (예를 들면, 80-400 미니 초). </li><li> 각 신선한 잘라 후 블록 얼굴의 이미지를 획득하고 가능하면 자동으로 이미지를 저장합니다. </li><li> 해상도, 단면 두께 및 줌을 포함하여 기록 중요한 매개 변수. </li><li> 전체 표본, 수출을 마무리하고 필요한 경우 JPEG 형식으로 모든 이미지 파일을 변환 한 후. </li><li> 이미징 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지를 반전하고, 밝기 및 대비를 조정합니다. </li><li> 별도의 폴더에있는 모든 처리 된 이미지를 저장합니다. </li></ol> 4. 3D심상 <ol><li> 지침에 따라 3 차원 시각화 소프트웨어에 대한 모든 처리 된 이미지를 업로드합니다. </li><li> 입력 해상도와 부분 두께는 체적 데이터 (즉, 복셀 크기)의 모든 이미지를 변환 및 3D 파일을 저장합니다. </li><li> 자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 맞 춥니 다. 필요한 경우 수동으로 개별 이미지를 조정합니다. </li><li> 새 파일 이름으로 정렬 된 이미지를 저장합니다. </li><li> 3 차원 시각화 소프트웨어를 사용하여 시험편의 형태 학적 특징을 분석한다. </li></ol>

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여기서는 급격한 차원 시각화 및 복잡한 구조의 형태 학적 분석을 위해 호환되는 직렬 HREM 화상 취득 루틴 실험실 장비를 사용하여 변형 된 프로토콜을 제시한다. 고해상도 이미지 대신 개별 섹션의 블록 표면에서 직접 수행되기 때문에, 미세한 형태 적 특징은 유지하고 신속 차원 시각화 프로그램에서 디지털로 복원된다. 3D 영상을 시각화하고 복잡한 형태 적 특징을 이해하는데 상당한 장점을 제공한다. 대부분의 3D 영상 기술은 특수 장비 1-4에 따라 달라집니다. 반대로 EFIC 및 HREM 촬상는 디지털 카메라 및 마이크로톰 (14)를 구비 한 입체 현미경을 포함한 표준 실험실 장비를 이용한다. 현미경 마이크로톰 간의 기능적 결합 화상 취득의 자동화 전체 이미지 획득 프로세스의 자동화를 실현 가능하게한다. 그러나, 우리는 것을 보여 주었다기능 커플 링은 8 의무적이 아니다. 그것은 휴식 정지 위치에서 표준 마이크로톰의 블...

3D 이미징 기술의 출현은 태아 발달 중 상세한 형태학적 특징에 대한 체계적인 분석의 가능성을 열었습니다. 현재 마이크로 자기 공명 영상(마이크로 MRI), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영, 고주파 초음파, 광 간섭 단층 촬영, 광학 프로젝트 단층 촬영 및 주교 현미경1-4를 포함한 다양한 3D 이미징 방식을 사용할 수 있습니다. 각 양식에는 해상도, 대비, 속도, 비용, 자궁 용량 및 가용성에 대한 고유한 기능이 있습니다.
Episcopic fluorescence image capture (EFIC) 및 high-resolution episcopic microscopy (HREM)는 episcopic 현미경 이미징 방법입니다4. 여기에서 고해상도 연속 이미지는 조직 절편 대신 블록 면에서 연속적으로 캡처됩니다. 결과 이미지는 조직 왜곡을 최소화하거나 전혀 없이 상세한 형태학적 특징을 충실하게 반영합니다. 획득한 체적 데이터는 정확한 형태 분석에 적합한 고해상도 3D 이미지로 쉽게 변환됩니다. 상대적으로 저렴한 비용과 높은 해상도로 인해 HREM과 EPIC는 인간 선천적 결함2,4-8의 마우스 모델의 전신 평가를 위한 우수한 대안이 되었습니다.
EFIC 및 HREM 방법 모두 표본이 적절한 매체에 삽입되어야 합니다. EFIC는 내장된 조직에서 방출되는 자가형광을 감지합니다. 이 때문에 높은 수준의 자가형광을 방출하는 표본으로 제한되지만 초기 단계의 배아와 같이 상대적으로 자가형광이 약한 표본은 제외됩니다9. 자가형광의 의존성을 극복하기 위해 HREM 이미징을 위해 검체를 eosin과 같은 형광 염료로 염색합니다. 염료 및 염색 방법의 선택은 또한 HREM이 조직 구조 및 형태학의 맥락에서 분자 신호를 감지하는 데 더 적합하게 만듭니다4,10.
이 기사에서는 말기 마우스 배아의 전신 평가에 적합한 개선된 HREM 프로토콜을 제시합니다. 염색을 용이하게 하기 위해 조직 침투를 증가시키는 전처리 단계를 포함하여 오래된 마우스 배아의 HREM 이미징을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>생쥐</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>C57BL6</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>200 프루프, 절대, ACS/USP/코셔 등급</td></tr><tr><td>포르말린</td><td>시그마</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마</td><td>U5128</td><td>클리어링 솔루션</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td>클리어링 솔루션</td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이</td>트 <td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td>클리어링 용액</td></tr><tr><td>Eosin Y Disodium Salt</td><td>Fisher scientific</td><td>BP241925</td><td>침투 용액</td></tr><tr><td>Acridine Orange hemi (염화 아연) 소금</td><td>Sigma</td><td>A6014</td><td>침투 용액</td></tr><tr><td>Whatman 종이</td><td>GE</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 임베딩 키트 - Solution A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A-800</td><td>침투 솔루션</td></tr><tr><td>JB-4 임베딩 키트 - Solution B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B-30</td><td>임베딩 솔루션</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; 임베딩 키트 - Catalyst</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618-12</td><td>침투 용액</td></tr><tr><td>임베딩 금형</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23185-1</td><td>16 x 8mm</td></tr><tr><td>Peel-A-Way 샤프 임베딩 금형</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18986-1</td><td>22 mm x 22 mm 정사각형, 12 mm x 12 mm로 잘림</td></tr><tr><td>JB-4&nbsp; 플라스틱 블록 홀더</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>일회용 졸업 전송 파이프</td><td>VWR</td><td>414004-014</td><td></td></tr><tr><td>Petrl Dish</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>배아 해부</td></tr><tr><td>펜치 Inox 팁</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5015</td><td>배아 해부</td></tr><tr><td>Graefe 조직 집게</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-5153</td><td>배아 해부</td></tr><tr><td>섬세한 수술용 가위</td><td>&nbsp; ROBOZ</td><td>RS-6700</td><td>배아 해부</td></tr><tr><td>14ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Magic Touch Iceware International Corp.</td><td>R19-343</td><td></td></tr><tr><td>100ml(3.4온스) 정전기 방지 폴리스티렌 계량 보트</td><td>VWR</td><td>89106-766</td><td></td></tr><tr><td>330 ml (11.2 oz.) 정전기 방지 폴리스티렌 계량 보트</td><td>VWR</td><td>89106-770</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>MP 생물 의학</td><td>102892</td><td>PBS 용액</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P0662</td><td>PBS 용액</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기</td><td>성 시그마</td><td>P5405</td><td>PBS 용액</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9390</td><td>PBS 솔루션</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Illuminator</td><td>Carl Zeiss</td><td>HXP 200C</td><td></td></tr><tr><td>형광 스테레오 줌 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 광원</td><td>Leica</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>일회용 마이크로톰 블레이드</td><td>VWR</td><td>95057-832</td><td></td></tr><tr><td>단일 에지 디스펜서</td><td>Personna</td><td>62-0330-0000</td><td></td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td>pro 2012</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS6 v13.0</td><td></td></tr><tr><td>Amira 3D 소프트웨어</td><td>Visage 이미징</td><td>5.4</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell T7600, 2x900GB SAS 하드 드라이브 및 64GB DDR3 RDIMM 메모리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>잠금 플랫폼 쉐이커</td><td>VWR</td><td>40000-304</td><td></td></tr><tr><td>표준 핫 플레이트 교반기</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr></tbody></table>

3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 episcopic 현미경을 사용하여

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

HREM(High-Resolution episcopic Microscopic) 기술을 사용하면 고해상도 디지털 체적 및 3차원(3D) 형태 데이터를 빠르게 수집할 수 있습니다. 여기에서는 전체 마우스 배아를 이미지화하는 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜은 시료 준비, 임베딩, 이미지 획득 및 마지막으로 3D 시각화의 네 가지 주요 섹션으로 구성됩니다. 이 기술은 표본을 형광 염료로 염색하도록 요구하는데, 이는 크거나 밀도가 높은 표본에 문제가 될 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 기존 프로토콜을 개선하여 요소와 도데실황산나트륨을 함유한 용액으로 검체를 전처리하여 염료의 조직 침투를 향상시켰습니다. 이 프로토콜은 표준 실험실 환경에서 쉽게 조정할 수 있도록 일상적인 실험실 장비와 시약만 사용합니다. 우리는 그 결과로 생성된 고해상도 3D 이미지가 마우스 배아 내부 장기의 상세한 형태학적 특징을 충실하게 요약하여 형태 분석을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 우리는 함께 표준 실험실 장비를 사용하여 소형 및 대형 표본의 고해상도 3D 이미지를 획득하는 상세하고 개선된 프로토콜을 제시합니다.

우리는 E9.5과 E13.5 8 사이의 마우스 배아의 높은 품질의 HREM 이미지를보고했다. 후반 개최 배아의 이미지 품질은, 그러나, 크게 때문에 형광 염료 에오신의 제한된 조직 침투의 손상. 염색 효율을 높이기 위해, 형광 영상 (11)에 호환되는 여러 전처리 방법을 시험 하였다. 특히, E15.5 마우스 배아는 무서 / 전자 A2 (12) 또는 전신 13 CUBIC 중 하나를 처리 하였다. 또한 단순화 화학식 상기 반제 용액 (4 M 우레아, 10 % 글리세롤 및 4 % 도데 실 황산나트륨)을 테스트했다. 모든 전처리 방법은 염색 효율을 증가했다. 배아는 지우기 솔루션 치료 1 주 이후 반투명되었다. 명백한 조직 손상은 치료 후 검출되지 않았다. 예비 처리 된 배아는 embedde되기 전에 탈수, 염색 및 침투를 포함하는 단계를 통해 처리 된플라스틱 매립 매체 (D). (3) (이미지 ...

우리는 쥐 배아의 3차원(3D) 이미지를 획득하기 위해 고해상도 에피스코픽 현미경을 사용하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 개선된 프로토콜은 변형된 조직 준비 방법을 사용하여 형광 염료의 침투를 향상시켜 소형 및 대형 표본 모두에 대한 형태 분석을 가능하게 합니다.

3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 표준 실험실 장비를 사용하여 생물학적 시료의 고해상도 3D 디지털 이미지를 신속하게 획득하는 것입니다. 이 방법은 복잡한 형태학적 특징의 시각화와 역동성을 통해 발생생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표준 실험실 장비를 사용하며 사전 경험이 거의 없어도 수행 가능하다는 점입니다.시연은 저희 연구실의 대학원생인 Jungang Huang이 진행하겠습니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 배아를 해부하고 고정한 후, 고정액을 투명화 용액으로 교체하고 상온의 로커(rocker) 위에서 시료를 1~2주 동안 천천히 회전시키십시오. 배양 기간이 끝나면 시료를 10% formalin으로 옮겨 로커 위에서 이틀 더 둡니다.셋째 날에, 샘플을 PBS로 5분씩 세 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 완만한 록커를 사용하여 각 농도당 2시간씩 에탄올 농도를 높여가며 샘플을 탈수합니다. 100% 에탄올 탈수가 끝나면, 표본을 빛이 차단된 상태에서 염색액으로 옮겨 1시간 동안 둡니다.그 후, 시료를 하룻밤 동안 표지하기 위해 용액을 신선한 염색액으로 교체합니다. 다음 날 아침, 갓 제조한 침투액과 염색액을 1:1 부피 비율로 혼합한 용액에 시료를 담근 후, 4 °C의 로커(rocker)에서 최소 3시간 동안 반응시킵니다. 배양이 끝나면 배아를 침투액으로 옮겨 3시간 동안 추가로 로킹 배양합니다.그 후 상층액을 신선한 침투액으로 교체하고 4°C에서 3일 더 쉐이킹 장치로 흔들어 줍니다. 넷째 날에 배아를 임베딩 몰드 내에서 방향을 잡고 몰드를 얼음에 놓습니다. 용액 B를 침투액과 혼합한 다음, 몰드를 4°C의 차가운 임베딩 용액에 조심스럽게 담급니다.약 3시간 후, 팁을 사용하여 용액이 응고되었는지 확인하고 몰드에서 시편을 밀어냅니다. 과도하게 부착된 매립 재료를 다듬은 후, 시편 블록을 새로운 몰드에 수직 방향으로 다시 배치합니다. 다음으로, 전체 장치를 흄 후드 내의 얼음 위에 둡니다.몰드가 잠길 때까지 임베딩 용액을 새로운 몰드에 조심스럽게 추가합니다. 그런 다음 몰드 위에 블록 홀더를 배치합니다. 3~4시간 후, 임베딩 몰드를 제거하고 사선 조명이 있는 실체 현미경 아래에 블록을 놓아 블록 내 시편의 위치를 결정합니다.블록 표면에 시편 주변으로 격자선을 표시하고, 이 선들을 가이드로 삼아 과도한 임베딩 재료를 다듬습니다. 시편을 이미지화하려면, 먼저 블록을 마이크로톰에 고정하고 시편의 신선한 표면을 절단합니다. 그런 다음 스테레오 줌 현미경을 시편의 블록 표면을 향하도록 수평으로 설치하고, 현미경과 연결된 컴퓨터의 전원을 켭니다.다음으로, 이미지 획득 소프트웨어를 실행하고 이미지 소프트웨어의 라이브 뷰 모드를 사용하여 광학 장치의 초점을 블록 면에 맞춥니다. 블록 면이 뷰파인더의 중심에 오도록 현미경과 마이크로톰을 필요에 따라 정렬하십시오. 이 절차에서 가장 중요한 단계 중 하나는 마이크로톰의 고정된 홈 위치에서 이미지를 획득하는 것입니다.줌을 조절하여 블록 전체 단면이 뷰파인더 안에 들어오도록 합니다. 그런 다음 녹색 형광 단백질 필터를 선택하십시오. 시료 조직이 나타날 때까지 블록을 미리 절단한 후, 필요에 따라 이미지의 초점을 다시 맞춥니다.노출 시간을 수동으로 측정 및 설정한 후, 매번 새로운 절편을 제작할 때마다 블록 단면의 이미지를 획득하여 저장하고, 중요한 이미지 획득 파라미터를 기록하십시오. 이미지 획득 세션이 끝나면 모든 이미지 파일을 JPEG 형식으로 내보내어 변환하고, 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 모든 원본 이미지의 색상을 반전시키며, 필요에 따라 이미지의 밝기와 대비를 조정하십시오. 지침에 따라 처리된 모든 이미지를 3D 시각화 소프트웨어에 업로드하십시오.자동 모드를 사용하여 모든 이미지를 정렬하고, 3D 및 2D 결과를 보여줍니다. 방금 시연한 방식으로 준비하고 촬영한 배아 15.5일차 생쥐 배아의 전체 마운트 표면 보기 대표 이미지입니다. 수염 패드와 발달 중인 모낭을 포함하여 피부의 상세한 형태학적 특징을 관찰할 수 있습니다.중요한 점은, 이 방법으로 촬영한 배아 15.5일차 표본의 가상 단면 해상도가 표준 조직학적 단면과 유사하다는 것입니다. 숙련된 경우, 투명화 용액을 이용한 전처리 후 전체 과정은 적절히 수행된다면 1주일 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 침투 및 포매 단계 동안 염색 용액을 4°C에서 차광하여 보관해야 함을 유념하는 것이 중요합니다.본 절차 이후, 세포 유형의 특이적 분포 패턴에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 스케일 염색(scale staining)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 생물학적 표본의 형태 측정 분석을 위해 실험 장비를 사용하여 고해상도 3D 이미지를 획득하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 고정, 염색 및 침투 용액을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 본 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 내에서 작업하고 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

비 - 파괴적인 볼륨 시각화는 가장 효율이 X - 선 마이크로 컴퓨터 tomography (CT) 어떤의 단층 기술에 의해 형성될 수 있습니다.

고해상도 3D 영상의 전 VIVO</em마이크로 중부 표준시로> 생물 학적 샘플

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

사차원 (4D) 영상은 척추 신경 터미널을 살고있는 엔도 좀의 두 가지 유형 사이의 행동과 상호 작용을 연구하기 위해 사용된다. 이 작은 구조의 이동은 같은 엔도 좀의 융합과 세포 외 유출 등의 이벤트의 확인을 허용, 세 가지 차원을 특징으로한다.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

우리는 고해상도 각막 현미경 검사법을 사용하여 디지털 볼륨 데이터 생성을 허용하기 위해 다양한 종의 생검 물질, 생체 모델 유기체의 태아 및 기타 유기 조직의 샘플을 처리하기위한 간단하고 견고한 프로토콜을 제공합니다.

고해상도 무시 무시 현미경 (HREM) - 유기 재료의 시각화 및 처리를위한 간단하고 강력한 프로토콜

최근 우리 라이브 셀에 기본 속눈썹 안쪽 translocating 다양 한 단백질에 대 한 전송 경로의 3 차원 (3D) 공간 위치 매핑. 여기 실험 설정, 생물 학적 샘플의 과정 및 접근을 새로 이미징 3D 슈퍼 해상도 형광에 대 한 데이터 분석에 적용이 종이 세부 기본 속눈썹 살고 있습니다.

라이브 주 Cilium에서 고속 슈퍼 해상도 속도 현미경의 응용

이 프로토콜은 살아있는 3차원 이미징을 위해 세균 샘플을 준비하고 장착하는 방법과 이러한 이미지에서 대장균의 3차원 모양을 재구성하는 방법을 설명합니다.

정확한 세포 표현과 정확한 단백질 국소화를 위한 세균 세포의 3차원 이미징

여기에서는 축 신장 및 세분화의 맥락에서 마우스 배아의 세 가지 및 네 차원 이미지 데이터를 시각화하고 분석 할 수있는 계산 도구 및 방법을 설명하고, 토토 광학 투영 단층 촬영에서 얻은 다중 광자 현미경을 사용하여 라이브 이미징 및 전체 마운트 면역 형광 염색을 수행합니다.

척추동물 축 신장 및 세분화를 연구하기 위한 세 가지 및 네 차원 시각화 및 분석 접근법

헤드 플레이트 및 단일 광자 및 이광자 현미경과 호환되는 광학 설계와 통합될 경우, 마이크로프리즘 렌즈는 머리가 고정된 상태에서의 잘 제어된 실험이나 자유롭게 움직이는 동물의 자연스러운 행동 작업을 포함하여 다양한 조건에서 수직 컬럼의 신경 반응을 측정하는 데 상당한 이점을 제공합니다.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

학습하세요 고해상도 에피스코픽 현미경을 이용한 생물학적 표본의 3차원 영상 획득 방법을. 이 기술은 발달생물학 연구에서 복잡한 형태학적 특징을 시각화하고 정량 분석하는 데 활용됩니다.

3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

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