Name: 준비 및 생체 액티비티 기반 프로브의 사용을위한 N -acylethanolamine 산 아미 다제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 배우세요 ARN14686 활성 기반 프로브를 합성하여 NAAA 효소의 활성 형태를 세포 추출물과 조직 섹션에서 검출하는 방법을. 이 기법은 염증성 및 신경퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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저자는 이탈리아 제노바에 있는 Istituto Italiano di Tecnologia의 Nikon 이미징 센터(NIC@IIT)에 감사를 표합니다.

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효소 활성은 미세 RNA 전사, 단백질 합성, 단백질 전좌, 번역 후 변형 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 포함하여 다양한 수준에서 조절된다. 종종, 효소의 발현 혼자의 활동을 설명하지 않습니다. ABPP는 천연 상태의 단백질의 활성을 연구하기 위해 개발되었다. 두 가지 기능이 요구된다 : 공유 관심 효소 리포터 태그의 활성 부위에 결합하는 화학 프로브는 프로브 - 표지 효소를 검출. 프로브 설계 및 합성 과정의 중요한 포인트입니다. 프로브는 대상에 대한 충분한 친화력 및 선택성이 있어야합니다. 또한, 기자 태그의 존재는 참여 대상에 영향을주지해야합니다. 이 문제는 주로 대상이 잡힌 후에 리포터 태그를 도입 한 두 단계 ABP의 디자인에 의해 극복된다. 태그없는 프로브, 생체 내 연구에 특히 적합하다하는 단백질 활성최소한의 변경으로 외부 살아있는 세포 또는 유기체에 평가 될 수있다. NAAA 프로브 ARN14686은 위에서 설명한 요구 사항을 충족하도록 설계...

일반적 산탄 분석 1,2- 효모 용 액체 크로마토 그래피 질량 분석 플랫폼을 포함하는 발현 패턴의 상호 작용 및 기능 단백질을 조사하는 방법을 사용하는 두 개의 하이브리드 방법 3,4 및 시험 관내 분석에서 그들이 것을 한정 그 나라의 상태에서 단백질의 활성을 평가할 수 없습니다. 활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)이 갭을 채우기 위해 사용될 수있다. 이 방식에서, 작은 분자에 공유 표적 탐지 가능 리포터 그룹에 결합되는 관심있는 효소의 활성 부위에 결합 할 수있는 프로브. 클릭 화학 (CC)를 사용하여 리포터 프로브에 통합 될 수 있거나 또는 표적 결합이 5,6 발생한 후에 도입 될 수있다. 후자의 방법은 SUC 바이오 직교 반응을 통해 리포터 시약 다수 개질 될 수있는 단자 알킨 또는 아 지드와 같은 적합한 화학 그룹을 포함하는 프로브를 사용해야구리 (I)와 같은 시간 [3 + 2] 사이클로 7-9 또는 슈타 우 딩거 결찰 10, 11 Huisgen을 촉매 반응. 최근에는 체외위한 제 ABP와 같은 시스테인 가수 분해 효소, NAAA (12)의 생체 검출의 화합물 ARN14686 개시된. NAAA는 항 염증 핵 수용체 PPAR 알파 13 ~ 15의 내인성 작용제이다 oleoylethanolamide (OEA) 및 팔미 토일 (PEA)을 포함하여 포화 및 불포화 FAES,의 가수 분해 비활성화를 촉매한다. NAAA 주로 선천성 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 시사뿐만 B 림프구 (14,16)와 같이, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현된다. 효소는 비활성 형태로 거친 소포체에서 합성 및 autoproteolytic기구 (17)에 의해 세포의 산성 구획에 활성화됩니다. autoproteolytic 분열은 (C13를 새 N 말단 시스테인을 생성마우스 및 쥐에서 1, 인간의 C126), 즉 FAE의 친핵체 책임은 (18, 19)을 가수 분해한다. NAAA 활동의 약리 억제는 FAES 16,20,21 증가 세포 수준에 찬성 FAE 합성 / 분해의 균형을 변경합니다. 여러 β-락톤 및 β - 락탐 유도체는 높은 효능 및 선택성 16,22-26와 NAAA 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 억제제는 촉매 시스테인 16,27,28의 S의 -acylation을 통해 작용한다. (- [(S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트 4- cyclohexylbutyl- N) 16 화합물 ARN14686은 전신적 활성 세린 유래 β 락탐 NAAA 억제제의 화학 구조, ARN726에 기초하여 설계되었다. ARN726의 4 부틸 사이클로 헥실 그룹은 아 지드 베어링 기자 태그 이후 CC의 접합을위한 터미널 알킨 태그를 베어링 C9 포화 지방족 체인으로 대체되었다. 우리 minimall하는 두 단계 ABP 디자인을 선택따라서 Y NAAA 용 프로브의 친화력을 유지하면서 원래의 지지체의 구조를 변화. 또한, 부피가 태그의 도입을 피하는 등의 프로브가 직접 ABP보다 생체 내 치료에 적합 할 수있다. ARN14686 높은 효능으로 NAAA 억제 효소 촉매 (12)의 시스테인과 공유 부가 물을 형성함으로써 (hNAAA IC 50 = 6 nM의, rNAAA IC 50 = 13 ㎚). 살아있는 쥐의 실험 프로브가 NAAA가 폐에 표현 캡처 선택적 있음을 보여 주었다. 높은 프로브 농도 (시험 관내에서 10 μM, 10 밀리그램 / 정맥 주사, 정맥 ㎖) (12)를 사용할 때 산성 세라 미다, NAAA와 33~34% ID를 공유하는 다른 시스테인 아미 다제는 또한 낮은 친 화성 대상으로 확인되었다. 우리는 또한 완전한 프로 인트 보조제 (CFA) (29)의 투여 후 염증이 쥐의 조직에서 활동 NAAA의 존재를 연구하는 ARN14686을 사용했다. 여기에서는 preparati위한 프로토콜 개요ARN14686 (그림 1)과 NAAA 활성화 생체의 조사에의 응용의에. 예를 들어, 우리는 CFA 투여 후 쥐의 발에 NAAA을 시각화하는 실험 절차를 설명합니다. 이 실험에서, 단백질은 프로브의 IV 주입 후 발 조직으로부터 추출되고, ABP 표지 프로테옴 비오틴 지드와 CC 받는다. 비오틴 샘플을 스트렙 타비 딘 비드를 사용하여 농축하고, 단백질 블롯 행한다. 다른 응용 프로그램에서, 우리는 프로브 처리 된 마우스에서 마우스의 폐에서 형광 현미경으로 활성화 NAAA의 현지화를 설명합니다. 이 경우, 조직을 절단하고, 절편을 로다 민 첨가 CC 실시된다. 워크 플로 방식은도 2에 도시되어있다.

<table><tbody><tr><td>1,1'-설포닐디미다졸&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>367818</td><td>유해한</td></tr><tr><td>2-dipyridylcarbonate</td><td>Fluorochem</td><td>11331</td><td>유해한</td></tr><tr><td>2-methylbutan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>가연성, 독성, 수중 환경에 유해</td></tr><tr><td>4-(Dimethylamino)pyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107700</td><td>독성</td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td>가연성, 부식성</td></tr><tr><td>아세토니트릴&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>인화성, 독성</td></tr><tr><td>활성탄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>161551</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td>유해한</td></tr><tr><td>아지드-PEG3-비오틴</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ104P4</td><td></td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Fluor 545</td><td>Jena Biosciences</td><td>CLK-AZ109</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bio-spin columns</td><td>Biorad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Blocking buffer</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>927-40000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td>Higly toxic</td></tr><tr><td>Bovin serum albumine (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol 블루</td><td>시그마 Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance III 400</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>시그마 Aldrich</td><td>419931</td><td>건강 위험</td></tr><tr><td>Ceric 암모늄 나이트레이트&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22249</td><td>산화, 유해한</td></tr><tr><td>클로랄 수화물</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8383</td><td>독성이 매우 강한</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>209198</td><td>독성</td></tr><tr><td>시클로헥사디엔</td><td>시그마 알드리치</td><td>125415</td><td>가연성, 건강 위험</td></tr><tr><td>시클로헥산</td><td>시그마 알드리치</td><td>34855</td><td>가연성, 유해한, 건강 위험, 환경 위험</td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마 알드리치</td><td>34856</td><td>유해한, 건강 위험</td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>시그마 알드리치</td><td>296082</td><td>가연성, 유해한</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>아크로스 유기물</td><td>348441000</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드d6(DMSO-d6)시</td><td>그마 알드리치</td><td>175943</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>2860</td><td>가연성, 유해한</td></tr><tr><td>에틸 아세테이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>34858</td><td>가연성, 유해한</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Irdye 680-LT 스트렙타비딘</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-68031</td><td></td></tr><tr><td>IRDye680-LT 스트렙타비딘&nbsp;</td><td>Licor</td><td>925-68031</td><td>단백질 복합체를 침전시키기 위해 사용하기 전에 간단히 원심분리</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34966</td><td>고독성</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>가연성, 독성, 건강 위험</td></tr><tr><td>N-(3-Dimethylaminopropyl)-N&prime; -ethylcarbodiimide hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7750</td><td>유해</td></tr><tr><td><부식성>N,N-diisopropylethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td>가연성, 부식성, 독성</td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>가연성, 유해</td></tr><tr><td>N-Cbz-L-Serine</td><td>Fluorochem</td><td>M03053</td><td>유해한</td></tr><tr><td>Nikon A1 컨포칼 현미경 Nikon</td><td></td><td></td><td>사용 설명서 읽기</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% 비스트리스 젤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td>팔라듐 온 카본</td><td>Sigma Aldrich</td><td>330108</td><td></td></tr><tr><td>p-anisidine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A88255</td><td>독성, 건강 위험, 환경 위험</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>441244</td><td>독성, 호흡기 유해, 부식성, 위조 가능</td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3265</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 안티페이드 마운턴트와 DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td>기포 형성을 피하십시오</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨 (SDS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>독성, 부식성, 위조 가능한</td></tr><tr><td>소듐 하이드라이드&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>452912</td><td>가연성</td></tr><tr><td>황산나트륨</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Starion FLA-9000 이미지 스캐너</td><td>FUJIFILM</td><td></td><td>사용자 매뉴얼</td></tr><tr><td>Streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20349</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마 Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tert-부탄올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td>독성, 인화성</td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>186562</td><td>가연성, 유해, 건강 위험</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Acros Organics</td><td>424542500</td><td>독성, 50°C에서 따뜻함; C, 트리스를 용해시키다</td></tr><tr><td></td><td>: 시그마 알드리치</td><td>RDD008</td><td></td></tr><tr><td>트리스 (2- 카르 복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>트리스 [(1- 벤질 -1H-1,2,3- 트리아졸 -4- 일) 메틸] 아민 (TBTA)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 -x100</td><td>시그마 알드리치</td><td>x100</td><td>독성</td></tr><tr><td>트윈 -20</td><td>시그마 알드리치</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Ultra turrax IKA T18 염기성 조직 균질화 장치</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Undec-10-yn-1-ol</td><td>Fluorochem</td><td>13739</td><td>유해한</td></tr><tr><td>요소</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>독성, 50°C에서 따뜻함; C를 용해시킵니다.</td></tr></tbody></table>

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; n</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

활동 기반 단백질 프로파일 (ABPP)는 효소의 활성 부위를 타겟팅하는 화학 프로브의 사용을 통해 복잡한 프로테옴 관심 효소의 동정하는 방법이다. 프로브에 도입 된 리포터 태그의 겔 형광 검사, 단백질 오, 형광 현미경, 액체 크로마토 그래피 질량 분석에 의해 효소 표지의 검출을 허용한다. 여기, 우리는 준비 및 복합 ARN14686의 사용, 선택적으로 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다제 (NAAA)를 인식하는 클릭 화학의 활동 기반 프로브 (CC-ABP)을 설명합니다. NAAA는 팔미 토일 (PEA)과 oleoylethanolamide (OEA)과 같은 내인성 페 록시 솜 증식 제 - 활성화 수용체 (PPAR) - 알파 작용제를 비활성화하여 염증을 촉진 시스테인 가수 분해 효소이다. NAAA은 리소좀의 산성 pH에서 autoproteolysis에 의해 활성화되는 비활성 전체 길이 proenzyme으로 합성된다. 현지화 연구 시간NAAA은 주로 B 림프구뿐만 아니라, 대 식세포 및 다른 단핵구 유래 된 세포에서 발현되는 것으로 나타 집결지. 우리는 ARN14686 감지하고 단백질 얼룩과 형광 현미경으로 설치류 조직에서 활동 NAAA 생체을 정량화 할 수있는 방법의 예를 제공합니다.

ARN14686는 NAAA 억제제 ARN726의 발판을 기반으로 설계되었다. ARN726의 4-tert- 부틸 시클로 헥 실기가 C9 포화 지방족 쇄 말단 알킨 태그 (도 1) 방위로 치환 하였다. 알킨 태그는 형광 또는 CC 통해 비오틴 분자를 추가하는 두 단계의 표시 절차의 이용을 허용하기 위해 도입되었다. 이 특징은 생체 외 및 생체 내 NAAA을 프로빙 매우 다용도 공구 ARN14686 렌더링한다. 여기, 우리는이 분자의 잠재력을 대표하는 ARN14686의 두 가지 응용 프로그램을 보여줍니다.이 여기에보고 된 실험 절차의 방식이다 그림. 프로브의 정맥 투여 후, 두 개의 서로 다른 검출 방법을 사용할 수 있습니다 단백질 얼룩으로 활...

여기서는 활동 기반 프로브의 제조 및 사용을 설명 (ARN14686, 운데 10 ynyl- N - [(3- S) -2- oxoazetidin -3- 일] 카르 바 메이트)의 검출 및 정량화를 허용 염증성 효소 N -acylethanolamine 산 아미 다 아제의 활성 형태 (NAAA), 모두 생체 외 및 생체있다.

준비 및<em&gt; 생체</em&gt; 액티비티 기반 프로브의 사용을위한<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine 산 아미 다제

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 N-acylethanolamine acid amidase(NAAA)에 특이적인 활성 기반 프로브인 ARN 14 six eight six의 합성을 보여주고, 세포 추출물 및 조직 절편 내에서 촉매 활성이 있는 효소를 검출하는 데 이를 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 염증성 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 생리적 및 병리적 조건에서 NAAA의 활성화에 대한 통찰력을 제공함으로써, NAAA의 생체 내 기능에 관한 의문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 프로브와 NAAA의 반응 이후 간단한 조작만으로 효소의 생체 내 활성화 상태에 대한 신뢰할 수 있는 정보를 얻을 수 있다는 점입니다.또 다른 장점은 특이적 항체와 달리 본 프로브는 효소의 활성 형태만을 검출하므로 형광 현미경 관찰 상태 확인에 유용하다는 점입니다. 이 방법의 시각적 시연은 적절한 합성부터 최종 응용 단계까지 전체 과정을 완성하기 위해 필요한 다양한 전문 지식이 결합되어 있어 매우 중요합니다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 350 mg의 undecynenol과 3.5 mL의 건조한 dichloromethane을 녹입니다.그런 다음 이 용액에 25 mg의 DMAP와 530 mg의 DPC를 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반합니다. 16시간 후 용액에 20 mL의 dichloromethane을 첨가합니다.혼합물을 분별 깔때기에 옮깁니다. 물 15 milliliters를 첨가합니다. 혼합물을 흔들어준 후 두 층이 분리될 때까지 기다립니다.다음으로 콕을 열어 하단의 유기층을 수집한 후, 콕을 닫고 유기층을 다시 분별 깔때기로 옮깁니다. 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 용액 15 milliliters를 첨가합니다. 분별 깔때기를 흔들어준 후 두 층이 분리될 때까지 기다립니다.황산나트륨으로 유기층을 건조시킨 후, 면물을 통해 층상 둥근 바닥 플라스크로 여과합니다. 그다음 회전 증발 농축기를 사용하여 감압 하에 유기층을 완전히 증발시킵니다. 플라스크의 무게를 측정하여 1.7:1의 비율로 혼합된 두 pyridyl undecynyl carbonate와 undecynol two oxypyridine carboxylate 오일 600 mg을 얻습니다.10 mL 라운드 바텀 플라스크에 60 mg의 oxo asetydenol ammonium asetate를 2 mL의 건조한 dichloro

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