준비 및

이 실험 절차의 전반적인 목적은 N-acylethanolamine acid amidase(NAAA)에 특이적인 활성 기반 프로브인 ARN 14 six eight six의 합성을 보여주고, 세포 추출물 및 조직 절편 내에서 촉매 활성이 있는 효소를 검출하는 데 이를 사용하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 염증성 및 신경 퇴행성 질환과 같은 다양한 생리적 및 병리적 조건에서 NAAA의 활성화에 대한 통찰력을 제공함으로써, NAAA의 생체 내 기능에 관한 의문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 프로브와 NAAA의 반응 이후 간단한 조작만으로 효소의 생체 내 활성화 상태에 대한 신뢰할 수 있는 정보를 얻을 수 있다는 점입니다.

또 다른 장점은 특이적 항체와 달리 본 프로브는 효소의 활성 형태만을 검출하므로 형광 현미경 관찰 상태 확인에 유용하다는 점입니다. 이 방법의 시각적 시연은 적절한 합성부터 최종 응용 단계까지 전체 과정을 완성하기 위해 필요한 다양한 전문 지식이 결합되어 있어 매우 중요합니다. 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 350 mg의 undecynenol과 3.5 mL의 건조한 dichloromethane을 녹입니다.

그런 다음 이 용액에 25 mg의 DMAP와 530 mg의 DPC를 첨가합니다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반합니다. 16시간 후 용액에 20 mL의 dichloromethane을 첨가합니다.

혼합물을 분별 깔때기에 옮깁니다. 물 15 milliliters를 첨가합니다. 혼합물을 흔들어준 후 두 층이 분리될 때까지 기다립니다.

다음으로 콕을 열어 하단의 유기층을 수집한 후, 콕을 닫고 유기층을 다시 분별 깔때기로 옮깁니다. 혼합물에 포화 탄산수소나트륨 용액 15 milliliters를 첨가합니다. 분별 깔때기를 흔들어준 후 두 층이 분리될 때까지 기다립니다.

황산나트륨으로 유기층을 건조시킨 후, 면물을 통해 층상 둥근 바닥 플라스크로 여과합니다. 그다음 회전 증발 농축기를 사용하여 감압 하에 유기층을 완전히 증발시킵니다. 플라스크의 무게를 측정하여 1.7:1의 비율로 혼합된 두 pyridyl undecynyl carbonate와 undecynol two oxypyridine carboxylate 오일 600 mg을 얻습니다.

10 mL 라운드 바텀 플라스크에 60 mg의 oxo asetydenol ammonium asetate를 2 mL의 건조한 dichloromethane에 녹입니다. 얼음 수조에서 용액을 0 °C까지 냉각한 후, 81 µL의 diazapropalethylamine을 한 방울씩 첨가합니다. 다음으로, undecynol two oxypyridine carboxylate가 포함된 350 mg의 조혼합물을 2 mL의 건조한 dichloromethane에 녹입니다.

용해된 혼합물을 용액에 첨가하고 실온에서 15시간 동안 교반합니다. 그런 다음 회전 증발기를 사용하여 감압 하에 용매를 완전히 증발시킵니다. 자동 컬럼 크로마토그래피 장치를 이용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 화합물을 정제합니다.

먼저 시료를 실리카 겔에 흡착시킵니다. 사이클로헥센으로 컬럼을 평형화한 후, 카트리지에 시료를 로딩합니다. 사이클로헥산 내의 에틸 아세테이트 농도를 0에서 100%까지 높여 시료를 용리시키고, 피크를 시험관에 수집합니다.

회전 증발기를 사용하여 감압 하에 화합물에 해당하는 분획의 용매를 완전히 증발시켜 40 mg의 흰색 고체를 얻습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 사전 정제한 후, 5 mM 스톡의 azide polyethylene glyco biotin 11.3 µL를 추가하고 볼텍싱합니다. 그런 다음, 새로 조제한 50 mM TCEP 스톡 11.3 µL를 샘플에 추가하고 볼텍싱합니다.

1.7 mM TBTA의 갓 준비한 작업 용액 34 µL와 50 mM 황산구리 스톡 용액 11.3 µL를 미리 혼합한 후, 이 용액 45.3 mL를 시료에 첨가하고 볼텍싱합니다. 라벨이 부착된 용기를 사용하십시오. 반응물을 25 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다.

1시간 동안 배양한 후 단백질 침전을 관찰하고 반응물을 혼합합니다. 샘플을 4°C에서 6,500 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거한 후 차가운 methanol 750 µL를 첨가하고, 프로브형 소니케이터를 사용하여 5초 동안 초음파 처리하여 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 샘플을 4°C에서 6,500 ×g로 4분 동안 원심분리합니다. 그리고 주사기와 바늘을 사용하여 상층액을 제거합니다. 차가운 methanol로 2회 더 세척한 후, 단백질 펠릿에 PBS에 희석된 2.5% SDS 325 µL를 첨가합니다.

샘플을 5초 동안 세 번 초음파 처리합니다. 그다음 65 °C에서 5분 동안 샘플을 가열합니다. 초음파 처리 후, 상온에서 6,500 ×g로 5분 동안 샘플을 원심 분리합니다.

그다음 상층액을 깨끗한 15 milliliter 튜브로 옮기고, 상층액에 PBS 1.4 milliliters를 첨가하여 SDS 농도를 0.5%로 희석합니다. streptavidin 농축을 위해서는 먼저 PBS를 사용하여 샘플의 부피를 4.2 milliliters로 맞춥니다. 그런 다음 cut end tip을 사용하여 미리 세척된 50% streptavidin agarose 슬러리 40 microliters를 첨가합니다.

혼합물을 실온에서 2시간 동안 회전시키며 배양합니다. 1,400 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 비드 펠렛이 마르지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 잔류 상층액을 사용하여 비드를 1 mL 스핀 컬럼으로 옮기고, PBS에 1% SDS를 포함한 용액 1 mL를 사용하여 중력 방식으로 컬럼을 세척합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 6 M urea로 비드를 계속 세척한 후 PBS로 세척하십시오. 그런 다음 500 µL의 PBS를 사용하여 세척된 비드를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 샘플을 1,400 ×g에서 2분 동안 원심분리한 후, 주사기와 바늘을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입하십시오.

레진 결합 단백질을 용출시키려면, 레진 펠릿에 25 µL의 용출 버퍼를 추가하고 실온에서 15분간, 이어서 95 °C에서 15분간 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 조직 절편에 약 400 µL의 클릭 화학 반응 믹스를 추가합니다. 이때 선택한 클릭 화학 반응 믹스의 부피가 절편을 충분히 덮을 수 있는지 확인하십시오.

그런 다음 조직 절편을 빛이 차단된 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 PBS로 5분간 세척하고, 이어서 차가운 methanol로 5분간 세척합니다. 다음으로 조직 절편을 PBS 내의 1% Tween 20 및 0.5 mM EDTA 용액으로 2분씩 총 3회 세척합니다.

마지막으로 슬라이스를 PBS로 5분 동안 한 번 더 세척합니다. 공기 중으로 건조시킨 후 DAPI가 포함된 항퇴색 마운팅 용액(antifade mountant)을 한 방울 첨가합니다. 커버 슬립으로 시료를 덮고 폴리시로 밀봉합니다.

프로브 합성을 위해 undecynenol을 촉매량의 four dimethyl aminyl pyridine 존재 하에 dipirydyl carbonate로 활성화하여 혼합 카보네이트를 생성하며, 이를 aminyl lactam과 반응시킵니다. 프로브의 헤드 부분인 beta lactam은 NAAA 활성 부위와 반응하며, 말단 알카인은 클릭 화학을 통해 리포터 태그로 기능화될 수 있습니다. ARN 14 six eight six는 protein block을 통해 쥐의 염증성 발 세포 추출물에서 NAAA 활성화를 검출하는 데 사용되었습니다. 정상 쥐에서는 NAAA 신호가 검출되지 않습니다.

반대로, 완전 프라운드 보조제(complete Freunds Adjuvant)를 처리한 쥐에서는 활성 NAAA에 해당하는 뚜렷한 밴드가 관찰됩니다. ARN 14686의 또 다른 응용 분야는 형광 현미경을 이용한 조직 이미징입니다. 여기서 빨간색 세포는 활성 NAAA 양성인 폐포 대식세포를 나타냅니다.

고배율에서 관찰할 수 있듯이, NAAA는 확산된 소포 구조에 국소화되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 단백질 블롯과 형광 현미경법을 통해 조직 내 활성 NAAA를 검출하기 위해 ARN 14686을 합성하고 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 본 프로토콜은 특정 표적에 특화되어 있지만, 여기서 설명하는 프로브 응용 방법은 NAAA 이외의 다른 표적에 특이적인 다양한 활성 기반 프로브에 맞춰 쉽게 조정될 수 있습니다.