Name: 간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: 학습하세요 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍(LSCD) 모델을 만드는 간단한 기계적 절차를 통해 안구 손상 없이 질병 과정을 연구하고 새로운 치료법의 효능을 평가하는 방법을.

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저자는 영상에서 그녀의 관대 한 지원, 루스 Zelkha, MS 감사합니다. 이 연구는 ME에 임상 과학자 개발 프로그램 상 K12EY021475에 의해 지원되었다, ARD, 국립 안과 연구소, NIH, 그리고 실명을 방지하기 위해 연구에서 무제한 부여에서 핵심 보조금 EY01792에 R01의 EY024349-01A1을 부여합니다. ARD 연구에서 실명 예방에 대한 경력 개발 상을받는 사람입니다.

동물에서 수행 모든 절차는 비전 연구에서 동물 사용을위한 비전 및 안과 문 연구 협회을 준수합니다. 6 개월 된 남성 / 여성 C57BL / 6J 야생형 마우스에 열네 4 ~ 사용 하였다 : 열 부상 모델 쥐와 대조군 4 개의 (unwounded 각막을). 1. 동물 준비 <ol><li> 는 A 100 ㎎ / ㎏의 케타민 복강 내 주사, 5 밀리그램 / kg 자일 라진 혼합물로 마우스를 마취. 마취 효과를 찍은 후, 마취의 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집어; 동물은 반응하지 않아야합니다. </li><li> 이전 각막 손상의 유무를 확인하기 위해 실험을 실시하기 전에 슬릿 램프 아래에서 눈을 검사한다. </li><li> 눈 상에 1 % 염산 tetracaine에 방울을 주입. 60 후 - 90 초, 감각의 부재를 확인하기 위해 각막 반사를 테스트합니다. Proparacaine 염산염 0.5 %를 대신 사용할 수있다. </li><li> 하면 각막 감각의 손실이특정 부드럽게 눈과 눈 주위의 머리에 5 % 포비돈 - 요오드 한 방울을 배치합니다. 1 분 후, 드롭 닦아 또는 공구 팁과 간섭 모발을 방지하기 위해 눈 주위의 머리에 확산. </li></ol> 2. 각막 상피를 연마 <ol><li> 수술 장갑과 가운을 착용 할 것. 멸균 회전 버 멸균 핀셋 : 필요한 도구를 준비합니다. 더 나은 제어를 위해, 구부러진 핀셋을 사용합니다. 절차 동안 멸균 시트에 도구를 놓습니다. </li><li> 절곡 핀셋을 사용하여, 비강 측으로부터 덮개를 잡아 부드럽게 눈 proptosing 의해 눈을 안정화. 너무 많은 압력을 사용하지 마십시오. </li><li> 수술 현미경 배로 멸균 회전 숫돌을 사용 윤부 주변 360 면도. 라운드 당 6 초 - 5의 속도로 윤부 주위에 이동합니다. 주 : 버가 하나의 고정 속도를 가지고있다. 그러나, 기존의 속도로 회전하는 상기 &quot;최종 너트&quot;완전 체결한다. </li><li> 회전 버와 윤부하는 윤부에서 전체 각막 상피를 제거합니다. 더 나은 결과를 위해, 원형 방식으로 도구를 이동하고 각막 표면에 다소 평행의 팁의 측면에서 작동하도록 유지. 다시 칫솔질하지 않음으로써 상피 세포가 이미 제거 된 영역을 기질을 손상하지 않도록주의하십시오. 눈에 어떤 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러쉬를 청소합니다. </li><li> 각막에 멸균 인산 완충 생리 식염수 방울을 주입하고 부드럽고 깨끗한 티슈로 모든 분리 된 상피 시트를 닦아. </li><li> 어떤 경우 나머지 상피 면도. </li><li> 수술하는 동안 마우스 꼬리에주의를 기울이십시오. 참고 : 움직임이 발생하면, 마취 깊이가 퇴색하고 추가 주입이 필요합니다. 차 주입 볼륨의 3 분의 2로 한 세 번째는 충분합니다. 마취 약물 치료와 동물을 과다 복용하지 마십시오. </li><li> 또 다른 눈에 사용하기 전에 모든 도구를 소독. </li></ol> 3. 확인 완료 상피 제거 <ol><li> 각막에 1 ㎎ / ㎖ 플루 오레 신 나트륨 한 방울을 적용합니다. 30 초 후 각막을 청소하고 상피 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해 코발트 블루 필터를 현미경으로 검사합니다. 참고 : 상피 결손과 각막 영역이 녹색으로 가시화된다. </li></ol> 4. 후 작업 관리 <ol><li> 가열 담요에 동물을 넣고 복구 아래에있는 동안 (그 새장에, 예를 들면) 안전한 장소에 보관합니다. 의식이있는 사람의 회사에서 의식이없는 동물을 보관하지 마십시오. </li><li> 1 % 에리스로 마이신 안과 연고를 적용합니다. 이것은 또한 눈의 건조를 방지 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 일주일 동안 항생제 매일 계속합니다. </li><li> kg 프레 노르 핀 피하 절차 후 다시 12 시간 후 / 0.1 mg을 주입한다. 이틀 동안 두 번 하루에 주사를 계속합니다. </li><li> 마취에서 완전히 회복 될 때까지 45 분 - 30 동물을 관찰한다. 노트: 복부 표면에 호흡 근육의 가벼운 운동은 복구 아래에있는 동안 동물의 건강을 나타냅니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개할 것이 없다고 선언합니다.

이 문서는 LSCD의 마우스 모델을 만들 수있는 재생 가능한 비교적 간단한 기술에 대해 설명합니다. 주목할 가치가이 모델의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 먼저, 화학 11, 12를 사용하는 모델과는 달리, 부상 주로 하부 각막 기질 또는 다른 인공 구조물을 최소화 손상 표면 상피 (및 기저막)를 포함한다. 따라서, 절차가 복잡하고 어려워 윤부 줄기 세포를 대상으로하는 간섭의 결과를 평가할 수있는 양으로 만 한정 염증 및 흉터있다. 리 등의 알에 의해 흥미로운 최근 연구. 수술, 화학 치료법의 다른 조합과 상기 회전 숫돌의 사용을 비교 (10)는 또한 안전하고 토끼 LSCD을 만드는 더 효과적 버어 알았다. 두번째 모델은 적어도 최대 세 달 1 안정적인 것으로 보인다. 이 모델 생성의 사용을 포함회전 버, 마우스 상처 연구를 수행하는 사람들에게뿐만 아니라, 각막 작업 임상의에게 친숙한 악기. 무딘 주걱을 사용을 통해 그 장점은 부상이 ...

각막 상피 ​​세포는 각막의 명확성 및 완전성을 유지하기 위해 필요하다. 그것은 지속적으로 각막과 결막의 교차점에서 윤부 - 좁은 영역에 존재하는 상피 줄기 세포에 의해 수명이 다할 때까지 갱신됩니다. 이러한 자기 갱신 윤부 줄기 세포는 모두 일반적으로 부상 한 후, 각막 상피의 재생에 중요한 역할을한다. 이러한 줄기 세포의 일부 또는 전체 고갈 재발 성 각막 미란, 통증, 각막 흉터 및 신생 혈관, 술잔 세포의 모양을 초래할 것이다 치료, 각막 실명을 떠나는 경우. 이 조건은 윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)로 알려져 있고, 특발성 일 수있다; 유전; 나 때문에 화학 물질 또는 열 손상, 장기간 콘택트 렌즈 착용, 만성 염증 1-6에 인수했다. LSCD에 대한 연구는 적절한 동물 모델을 필요로 그뿐만 아니라 모방 인간의 질병이 있지만 최소한으로 재현 및 지속다른 각막과 안구 구조에 손상 마운트. 이 모델은 치료를 평가하는 분자 및 세포 수준에서 질병의 메커니즘을 명확하게하는 것이 필요하다. 회전 숫돌을 사용하여, 하나 앞에 설명한 바와 같이, 하나의 용이 상기의 이점을 제공하며 3 개월 이상 지속 LSCD의 마우스 모델을 개발할 수있다. 이 연구의 목표는 LSCD의 단순한 재현, 지속 가능한 마우스 모델을 제시하는 것입니다. 회전 버 균등 기본 기질 1 부상없이 상피를 제거하는 편리한 도구입니다. 이는 상처 치유 연구 각막 미란 (7, 8)을 유도하기 위해 사용되어왔다. 마우스에 LSCD를 작성하는 저작물을-제시 기술은 이전에보고되지 않았습니다. 이전보다 복원 오와 함께, 덜 유니폼 부상, 특히 윤부 및 더 많은 변수 표현형 (1), (9)에 무딘 주걱 결과와 상피를 긁어 방법을 소개F 정상 각막 상피 1. 무딘 스크레이퍼 달리 회전 버어도 7, 8, 10 등의 상피 기저막을 제거한다. 줄기 세포를 절단 할 수있는 다른보고 된 방법들은 근본적인 안구 구조에 불필요한 손상을 유도 할뿐만 아니라, 심각한 염증 및 이후 각막 혼탁 또는 원인이 아니라, 수산화 나트륨, N- 헵탄 및 염화 벤잘 코늄 등의 화학 물질의 사용을 포함 상피 편평 상피 화생 11-15. 회전 버 이러한 심각한 합병증과 연관되지 않습니다. 수술 단독으로 또는 화학 물질 10, 11, 16를 사용하여, 윤부 상피를 제거, 수행하는 것이 더 어렵다 작은 눈 (마우스 등) 얇은 각막 윤부 상피 세포와 동물에서 최고의 옵션이 아닙니다. 또한, 놀랍게도, limbectomy는 여전히 10 뒤에 윤부 상피의 일부를 남겨 둘 수 있습니다. 아래 설명 된 기술은 신생 혈관의와 LSCD가 발생합니다환자의 전체 LSCD의 프리젠 테이션을 모방하고 3 개월 이상 1 지속 개발 conjunctivalization. 이 마우스에서 LSCD 또는 상처 치유의 병태 생리, 면역학, 잠재적 인 치료를 연구하는 것을 목표로하는 사람들에게 적합하다. 아마도, 일부 수정과,이 절차는 쥐 또는 토끼 (10)에서 수행 할 수 있습니다. 상기 회전 숫돌을 효율적 상피를 제거으로서, 각막 상피는 마모 / 상처와 관련된 모든 치료 또는 분자 생물학 연구에 관한 모든 연구에 이용 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>회전 버: AlgerBrush II 러스트 링 제거제&nbsp;</td><td>Rumex International Co, Clearwater, FL</td><td>16-141</td><td>0.5mm 버. 다른 회사에서도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>외과 현미경</td><td>Wild Heerbrugg, 스위스</td><td>Wild M691</td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>Nikon, 태국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon FS-2 슬릿 램프</td><td>Nikon, 일본</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyclonal anti-CK12 항체</td><td>Santa Cruz Blotechnology, CA,</td> <td>SC-17101</td><td>1:100 농도</td></tr><tr><td>단클론 anti-CK8 항체</td><td>TROMA-I-s, Iowa City, IA</td><td>AB_531826</td><td>1:50 집중</td></tr></tbody></table>

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

윤부 줄기 세포 결핍증 (LSCD)가 고장 나 각막 상피는 결막로 치환 한 후, 윤부 상피 줄기 세포의 상실의 상태이다. 환자는 재발 성 각막 결함, 통증, 염증, 시력의 손실을 겪고 있습니다. 이전 LSCD의 쥐 모델을 설명하고 다른 두 모델에 비교 하였다. 목적은 두 모방 인간 표현형 및 질병의 병태 생리학 연구와 새로운 치료법을 평가하는 것을 가능하게하기에 충분히 긴 지속 LSCD 일관된 마우스 모델을 제조 하였다. 여기서,이 기술은 더 상세하게 설명한다. 회전 버와 전동 도구는 각막 표면의 녹 반지를 제거하거나 환자의 군 날개 침대를 원활하게하기 위해 설계되었습니다. 원하는 LSCD 모델을 만들 수있는 적절한 장치입니다. 그것은으로, 작은 눈에 작업에 적절하게 좋은 팁과 쉽게 사용할 수, 사용하기 쉬운 도구입니다마우스입니다. 그 응용이 눈에 불필요한 외상 방지 종종 화학적 손상 모델의 경우와 같이 그것을 원하지 않는 손상을 초래하지 않는다. 무딘 스크레이퍼 반대로, 상기 기저막과 상피 세포를 제거한다. 이 프로토콜에서, 윤부 영역은 두 번으로 연마 한 후, 전체 각막 윤부 상피에서 윤부를 면도 하였다. 기질 부상을 방지하기 위해주의 상피가 이미 제거 된 후 각막 표면을 브러시하지 않도록주의한다.

이 기술을 수행 한 후 한 달 이내에, 각막의 100 %가 피상적 인 혈관 신생 개발 (그림 1A합니다. 사진 밝은 필드와 코발트 블루 필터에서 슬릿 램프에 연결된 카메라로 촬영했다). 눈의 18/20 (90 %)에서, 혈관 신생이 전체 각막 표면 (도 1A)을 포함했다. 2/20 (10 %)에서, 혈관 신생 3-4 각막 사분면에서 관찰 되었으나, 여전히 각막 중심에 도달했다. LSCD의 발전을 확인하려면, 전체 마운트 면역 염색 1을 수행 하였다. 이 단계는 프로토콜의 일부가 아닌 목표와 관심에 따라 변경 될 수 있습니다. 세 가지 변화는 LSCD의 지표로 간주되었다 : 사이토 케라틴 (CK)의 부재 (12), 정상 각막 상피 세포 17, 18에 해당하는 중간...

다음 문서에서는 효과적으로 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD)의 지속 가능한 마우스 모델을 만들 수있는 쉬운, 재생 가능한 기술을 제공한다. 이 동물 모델 시험 및 윤부 줄기 세포 질환에 대한 치료 효능을 비교하기에 유용하다.

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

이 절차의 전반적인 목표는 재현 가능하고 지속 가능하며 영구적인 각막 가장자리 줄기세포 결핍 마우스 모델을 구축하는 것입니다. 이 간단한 기법은 표준 화학적 손상 모델로는 달성하기 어려운, 안구에 원치 않는 손상을 입히지 않으면서도 각막 가장자리 줄기세포 결핍의 일관된 동물 모델을 제공합니다. 이 모델은 세포 및 분자 수준에서 질병 과정을 장기적으로 연구하는 데 유용합니다.또한 새로운 치료법의 효능을 테스트하거나 비교하는 데 사용합니다. 마우스에게 마취제를 투여한 후, 발가락을 집어 마취 깊이가 적절한지 확인하십시오. 세극등으로 눈을 관찰하여 이전의 각막 손상이 없는지 확인하십시오.1% tetracaine hydrochloride 한 방울을 눈에 점안하고 60초 동안 기다립니다. 다음으로, 5% povidone iodine을 눈과 그 주변 털에 부드럽게 도포합니다. 1분 후, 도구의 팁이 털에 걸리지 않도록 점안액을 닦아내거나 눈 주변의 털에 펴 바릅니다.멸균된 회전 버(rotating burr)와 멸균된 굽은 핀셋 한 쌍을 준비하여 시술 과정 동안 멸균 시트에 놓아둡니다. 이제 굽은 핀셋을 사용하여 비측에서 눈꺼풀을 잡아 안구를 고정하고, 안구를 부드럽게 돌출시킵니다. 이때 너무 강한 압력을 가하지 않도록 주의하십시오.수술용 현미경 하에서 멸균 회전 버(rotating burr)를 사용하여 각막 주변부(limbal area) 주위를 두 번 깎아냅니다. 회전 버의 측면 팁을 이용하여 각막 주변부에서 주변부까지 전체 각막 상피를 원형으로 제거합니다. 기질 손상을 방지하기 위해, 상피가 이미 제거된 각막 부위를 다시 깎지 않도록 주의하십시오.눈에 압력을 가하지 마십시오. 필요에 따라 브러시 팁을 세척하십시오. 각막 위에 멸균 PBS 한 방울을 떨어뜨리고, 부드러운 세척 티슈로 떨어진 상피 세포층을 닦아내십시오.그런 다음, 남아 있는 상피가 있다면 이를 면도합니다. 수술 중 적절한 마취 깊이가 유지되는지 확인하기 위해 마우스의 꼬리를 주의 깊게 관찰하십시오. 각막 위에 Flourescein sodium 한 방울을 떨어뜨립니다.30초 후에 각막을 세척하고, 코발트 블루 필터를 장착한 현미경으로 관찰하여 상피층이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 시술 후, 동물을 가열 패드가 깔린 케이지에 넣고 마취에서 완전히 회복될 때까지 30-45분 동안 관찰합니다. 그동안 눈에 1% Erythromycin 안약을 도포하고, 일주일 동안 매일 항생제 도포를 지속합니다.또한, Buprenorphine 0.1mg/kg을 즉시 및 시술 12시간 후에 피하 주사하고, 이틀 동안 하루에 두 번 주사를 계속합니다. 이것은 시술 한 달 후의 각막 표현형입니다. 각막 주변부 줄기세포 결핍의 특징인 광범위한 신생혈관 형성을 확인할 수 있습니다.정상 각막은 Cytokeratin 12를 발현하지만, Cytokeratin 8이나 술잔세포(goblet cells)는 나타나지 않습니다. 각막연 줄기세포 결핍증에서는 Cytokeratin 8과 술잔세포가 각막에 나타나며, Cytokeratin 12는 소실됩니다. 이 기술을 숙달하면 한 달 이내에 마우스 각막 표면의 거의 전체를 덮는 각막 신생혈관 형성을 유도할 수 있으며, 이는 최대 3개월까지 안정적으로 유지됩니다.이미 상피가 제거된 각막 부위를 다시 브러싱하지 않는 것이 중요합니다. 이는 원치 않는 기질 염증과 혼탁을 유발할 수 있습니다. 윤부 줄기세포 결핍이 발생한 후, 실험적 치료 방법을 테스트하고 비교할 수 있습니다.또는, 부상 직후에 치료를 시작할 수 있습니다. 이 영상에서는 생쥐의 각막연조직 및 각막 상피를 효과적으로 제거하여 각막연줄기세포 결핍을 유도하는 방법을 보여줍니다. 일부 수정을 거쳐 다른 동물 모델에도 적용할 수 있습니다.

a-simple-mechanical-procedure-to-create-limbal-stem-cell-deficiency

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

방법은 생쥐에서 인간의 retinoblastoma 종양을 전파하기 위해 설명되어 있습니다. 종양 세포에 직접 면역 결함 생쥐의 눈을에 주입하고 있습니다. 이차 종양이 성공적으로 직접적으로 인간의 종양과 교양 tumorspheres에서 수확을 모두 세포를 사용하여 설립되었습니다.

면역 결함 마우스의 확립과 인간 Retinoblastoma 종양의 전파

생체내 bioluminescence과 자기 공명 영상에서 (I), 그리고 (ii) 해부 histological 분석 :이 문서를 사용하여 쥐 두뇌에있는 세포 이식의 multimodal 이미징을위한 이벤트를 최적화된 순서를 설명합니다. 하나의 동물에서 이러한 이미징 modalities를 결합하면 높은 해상도, 민감도와 특이성과 세포 이식 평가를하실 수 있습니다.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

망막하 주사는 쥐의 눈에 있는 망막 색소 상피에 효과적인 유전자 전달을 위한 수술 기술입니다.  여기에서는 실험용 마우스에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 쉽고 복제 가능한 방법을 설명합니다.

마우스 망막 색소 상피의 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터의 윤부 접근 - 망막 주입

이 기사에서는 R26R-Confetti 마우스를 사용하여 다중 색상 계통 추적 실험을 설계하고 수행하는 원칙을 설명합니다. 당사는 다른 관심 조직에 대해 변형될 수 있는 각막 상피 세포를 추적하기 위한 특정 프로토콜을 제공합니다.

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

이 프로토콜은 이종-및 피더 세포 무료 문화 조건 하에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 각 막 limbal 상피 줄기 세포를 분화 하는 간단한 2 단계 방법을 소개 합니다. 여기에 제시 된 셀 문화 방법 각 막 세포 치료 이용에 적용 가능한 임상 질 세포의 비용 효율적인, 대규모 생산...

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

이 프로토콜은 마우스 모델에서 정확하고 재현 가능한 각막 및 윤부 알칼리 손상을 유도하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 고도로 구부러진 쥐의 각막과 변두리에 고르게 분포된 손상을 허용하기 때문에 유리합니다.

마우스 모델에서 펀치-트레핀 기술을 사용한 각막 및 변막 알칼리 손상 유도

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

우리는 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 통해 심각한 각막 염증을 일으키는 쥐 모델을 개발했습니다. 이 연구는 염증 상태에서 각막 염증 패턴, 상피 증식 및 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다.

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

여기서는 콜라겐제 A와 트립신을 이용한 순차적 소화를 통해 전체 마우스 각막에서 고품질 단세포 현탁액을 얻는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 높은 RNA 무결성을 가진 생존 가능한 단일 세포를 생성하여 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 유세포기체 y와 같은 후속 응용과 호환됩니다.

마우스 각막에서 단일 세포 현탁액을 채취하는 프로토콜

학습하세요 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍(LSCD) 모델을 만드는 간단한 기계적 절차를 통해 안구 손상 없이 질병 과정을 연구하고 새로운 치료법의 효능을 평가하는 방법을.

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

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