방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

이 방법의 전반적인 목표는 박층 크로마토그래피와 HPLC를 사용하여 호중구 세포 외 트랩이 방출되는 동안 호중구의 지질 조성 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 호중구 세포 외 트랩 또는 줄여서 NET 형성이라고 하는 형성에 관여하는 메커니즘에 대한 자세한 정보를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 따라하기 쉬운 프로토콜을 활용하여 호중구의 일반적인 기능에서 지질의 역할에 대한 정보를 제공한다는 것입니다.

인간 혈액 유래 세포의 분리는 우리 연구실의 전 박사 과정 학생인 Ariane Neumann에 의해 입증될 것입니다. 그리고 그녀는 Friederike Reuner의 도움을 받을 것입니다. 지질 분석을 위한 세포 준비는 제 연구실의 박사후 연구원인 Graham Brogden과 생화학 프로그램의 석사 과정 학생인 Diab Husein에 의해 시연될 것입니다.

인간 혈액 유래 호중구를 혼합하지 않고 화염 근처에서 20mL의 디아트리조산나트륨/덱스트란 용액에 약 20mL의 혈액을 층을 형성하여 분리합니다. 제동 없이 g470회에서 30분간 원심분리기. 혈액 단계를 용액의 밀도 등급과 혼합하지 않는 것이 중요합니다.

원심분리 단계와 단핵 단계 후에는 세포의 오염 또는 불특이적 활성화를 방지하기 위해 세포를 조심스럽게 제거해야 합니다. 단핵 세포와 황색을 띤 플라즈마 층을 제거합니다. 다형성 핵 세포 또는 PMN 상을 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 1X 인산염 완충 식염수로 최대 50 mL를 채웁니다.

제동과 함께 470회 g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 5mL의 멸균수에 5초 동안 다시 현탁시켜 적혈구를 용해시킵니다. 즉시 튜브에 1X PBS를 50mL로 채우고 샘플을 원심분리합니다.

상등액을 제거할 때 펠릿은 흰색이어야 합니다. 여전히 빨간색이면 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 펠릿을 Roswell Park Memorial Institute 또는 RPMI 배지 1000마이크로리터에 다시 현탁시킵니다.

광학 현미경으로 Trypan Blue 염색과 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. RPMI에서 mL당 200만 개의 세포 농도로 세포 현탁액을 준비합니다. 20mL의 혈액에서 약 2,500만 개의 호중구를 채취할 수 있습니다.

지질 분석을 위해 호중구를 약리학적으로 치료하려면 준비된 세포 1,500만 개를 사용합니다. 반응 튜브의 샘플을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 배양합니다. 시료를 원심분리한 후 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 300마이크로리터의 HBSS에 다시 현탁시킵니다.

동일한 파라미터를 사용하여 샘플을 다시 원심분리한 후 1:1 클로로포름:메탄올 용액 1mL에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1mL 주사기에서 샘플을 10회 밀어 넣어 다시 부유한 펠릿을 26게이지 캐뉼라로 균질화합니다. 인간 말초 혈액 유래 호중구에서 지질을 분리하려면 준비된 호중구를 얼음 위에 올려 놓습니다.

PTFE 밀봉이 있는 15mL 나사 캡 유리관에 호중구를 피펫으로 넣고 1분 동안 흔들어 균질화합니다. 그런 다음 2mL의 메탄올을 첨가하고 1분 후에 1mL의 클로로포름을 첨가합니다. 1분 더 흔든 후 유리관을 실온에서 50rpm으로 30분 동안 회전시킵니다.

다음으로, 용액을 섭씨 7도에서 1, 952 회 g으로 10 분 동안 원심 분리하여 단백질 분획을 펠릿화합니다. 단백질 함유 펠릿은 남겨두고 새로운 15mL 유리 스크류 캡 튜브에 상등액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 향후 정량화를 위해 펠릿을 섭씨 20도에서 보관하십시오.

클로로포름 1mL를 넣고 1분 정도 기다립니다. 그런 다음 이중 증류수 1mL를 넣고 유리 나사 캡 튜브를 샘플과 함께 30초 동안 뒤집습니다. 이전과 같이 샘플을 원심분리한 후, 상부상을 제거하고 흐린 층을 제외한 아래까지 폐기합니다.

진공 농축기에서 샘플을 섭씨 60도의 진공 농축기로 건조시키고 필요할 때까지 섭씨 20도에서 보관합니다. 시작하려면 해당 유리 챔버에 각 용액을 최대 5mL까지 채웁니다. 각 챔버의 실행 속도를 높이기 위해 모든 종류의 여과지를 추가하십시오.

첫 번째 실행 용액에서 20x10cm HPTLC 실리카겔 60 유리판을 사전 배양합니다. 흐르는 용액이 접시 상단에 도달하면 섭씨 110도에서 110분 동안 건조시킵니다. 진공 농축기로 건조시킨 후 이전에 얻은 지질 펠릿을 원하는 부피의 1:1 클로로포름:메탄올 용액에 용해시키고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 용해합니다.

그런 다음 자와 부드러운 연필을 사용하여 원하는 샘플 수와 하나 이상의 표준물질에 대한 로딩 지점을 표시합니다. 첫 번째 실행 솔루션의 경우 약 4cm, 두 번째 실행 솔루션의 경우 약 6cm로 실행 거리를 표시합니다. 샘플을 로드하려면 새 샘플을 로드하기 전에 10마이크로리터 주사기를 1:1 클로로포름:메탄올로 세 번 세척합니다.

각 샘플을 10마이크로리터씩 적하 방향으로 로드하여 가능한 한 작은 영역에 샘플을 집중시키려고 합니다. 용액 1이 실행되는 첫 번째 챔버에 플레이트를 수직으로 놓습니다. 균일한 마이그레이션 속도를 달성하기 위해 플레이트가 유리 챔버의 벽과 평행한지 확인하십시오.

플레이트가 유리 챔버의 뒤쪽 벽과 평행하게 배치되고 지질이 효율적으로 분리되도록 용매 선단이 너무 멀리 흐르지 않도록 주의하십시오. 용매 라인이 첫 번째 표시에 도달하면 플레이트를 제거하고 건조시킨 다음 두 번째 용액에 놓습니다. 두 번째 실행 솔루션과 세 번째 실행 솔루션에 대해 유사한 단계를 반복합니다.

용매 전면이 플레이트 상단에 도달할 때까지 플레이트를 용액에 그대로 두십시오. 그런 다음 플레이트를 제거하고 실온에서 1분 동안 건조시킵니다. 플레이트를 황산구리 용액에 7초 동안 놓습니다.

접시를 완전히 말린 후 섭씨 170도의 오븐에서 7분 동안 굽습니다. 오븐에서 접시를 꺼내 식히십시오. HPLC를 수행하려면 컬럼을 기기의 가드 카트리지에 부착하고 섭씨 32도까지 가열합니다.

메탄올을 분당 1mL 및 65bar의 유속으로 이동상으로 사용합니다. UV 검출기를 202나노미터로 측정하도록 설정하여 각 샘플의 콜레스테롤 양을 정량화합니다. 샘플을 분석하기 전에 HPLC 기계를 철저히 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜레스테롤 표준 곡선을 설정합니다.

마지막으로, HPLC 기기에 로드하기 전에 나사식 상단 빨간색 PTFE/흰색 실리콘 뚜껑이 있는 호박색 1.5mL 유리병에 담긴 1:1 클로로포름:메탄올 500마이크로리터에 샘플을 다시 현탁시킵니다. 다음은 HPTLC 플레이트에 있는 호중구의 지질 프로필입니다. 지질은 이동 거리를 표준물질과 비교하여 식별할 수 있습니다.

또한 두 개의 큰 피크를 보여주는 HPLC 크로마토그램도 표시됩니다. 2분 직전의 첫 번째 피크는 클로로포름입니다. 5분에 두 번째로 큰 피크는 콜레스테롤입니다.

다음은 HPLC와 HPTLC에 의해 결정된 콜레스테롤 표준 곡선입니다. HPLC에 의해 얻어진 표준 곡선은 HPTLC 표준 곡선에 비해 더 넓은 농도 범위에서 선형입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 혈액 유래 호중구를 분리하고 지질 조성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 위험한 클로로포름:메탄올 노출로부터 손을 보호하기 위해 니트릴 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 향후 실험은 NET 형성과 관련된 메커니즘 및 아직 완전히 이해되지 않은 일반적인 호중구 기능에 대한 추가 정보를 제공할 것입니다. 1차 인간 혈액 유래 세포를 연구하려면 윤리적 허가가 필요하며 인간 병원체에 대한 노출 위험을 피하기 위해 해당 생물 안전 실험실에서 작업하는 것과 같은 적절한 안전 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.

마지막으로, 본 연구의 목적은 선천면역계를 기반으로 감염에 대한 새로운 치료 표적을 찾는 것이며, 특히 지질 조성은 호중구가 감염에 대해 항균 작용을 하는 이유를 이해하는 데 도움이 될 것이기 때문에 매우 흥미롭습니다.