Name: 방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 학습하세요 호중구 지질 구성 분석 방법으로 HPTLC와 HPLC를 사용하여 NET 형성 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 면역학 연구에 유용한 인체 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준을 분석합니다.

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이 작품은 아리안 뉴만에게 제공 수의학, 하노버, 독일의 대학의 &quot;동물 및 인수 공통 감염의&quot;아카데미에 대 한 Tiergesundheit (AFT) 및 박사 과정에서 친교의 친교에 의해 지원되었다.

이 프로토콜의 말초 혈액의 수집은 지역의 인간 연구 윤리위원회에 의해 승인되었다. 모든 사람을 대상으로 자신의 동의서를 제공했다. 밀도 구배 원심 분리에 의해 인간 혈액 유래 호중구 1 격리 <ol><li> 인간의 혈액 유래 호중구의 분리 <ol><li> 층 ~ 불꽃 근처 혼합없이 나트륨 diatrizoate / 덱스 트란 용액의 20 mL의 혈액 상을 20㎖. </li><li> 브레이크없이 470 XG에서 30 분 동안 원심 분리기. </li><li> 단핵 세포와 황색 플라즈마 층을 제거한다. (;도 1 및 2 셀을 집적하여 두 번째 단계) 새로운 50ml의 튜브 및 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 50 ㎖로 채워 다형 핵 세포 (PMN)의 위상을 옮긴다. </li><li> 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 상등액을 제거하고 멸균 5 ㎖ FO에 펠렛을 재현 탁R 5 초는 적혈구를 용균합니다. </li><li> 즉시 470 X g에서 10 분 동안 50 ㎖의 1X PBS와 원심 분리기까지 채운다. </li><li> 상층 액을 제거합니다. 펠렛은 흰색이어야한다. 여전히 빨간색이면 반복 1.1.5와 1.1.6 단계를 반복합니다. </li><li> 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 매체의 1,000 μL에 펠렛을 재현 탁. 광학 현미경 하에서 혈구에 트리 판 블루 염색법을 이용하여 세포 수를 카운트. </li><li> 2 × 106 / ㎖의 농도로 RPMI에 세포 현탁액을 준비한다. 약 2.5 × 10 7 호중구가 혈액을 20 ㎖에서 수확 될 수있다. </li></ol></li><li> 지질 분석을위한 호중구의 약리학적인 치료 <ol><li> 단계 1.1.9에서 5 × 10 7 세포를 사용합니다. 1.5 mL의 반응 관에 300 μL의 총 부피의 10 mM의 MβCD 25 나노 PMA의 존재 또는 부재하에 순수한 Hank&#39;s 균형 염 용액 (HBSS) 배지에서 세포 수를 조정한다. </li><li> 에서 샘플을 품어37 ° C에서 2 시간, 5 % CO 2의 반응 튜브. </li><li> 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 HBSS 300 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 브레이크 (470) XG에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 10 시간 및 종료 1 ml 주사기로 시료를 흡인함으로써, 26-G 캐 뉼러로 균질화하고, -20 ° C에서 샘플들을 저장하는 (1) 클로로포름 / 메탄올 1 mL 중 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 면역에 의해 NET 정량 호중구의 약리학적인 치료 <ol><li> 준비 커버 글라스로 48 웰 플레이트를 폴리 -L- 라이신이 코팅. <ol><li> 각 웰에 한 8 mm 유리 커버 슬립을 배치 멸균 0.01 % 폴리 -L- 라이신의 55 μL를 추가 ~ 실온 (RT)에서 20 분 배양한다. </li></ol></li><li> 1X PBS 200 μL로 두 번 씻으십시오. 필요한 때까지 냉장고에 잘 당 1X PBS 200 μL와 접시를 저장합니다. </li><li> 차efully 각 커버 슬립의 중심에 웰당 단계 1.1.9에서 세포 현탁액 (2 × 100분의 5 μL) 100 μL를 추가한다. </li><li> 최종 10 mM의 MβCD 또는 최종 25 나노 PMA 중 하나를 잘 당 100 μL를 추가합니다. </li><li> 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 37 ° C에서 2 시간, 5 % CO 2 부화. </li><li> 브레이크 (370) XG에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 4 %의 155 μL PFA로 세포를 고정 파라핀 플라스틱 필름들을 포장하고, 4 ℃ 또는 실온에서 10 분 동안 밤새 보관. 참고 : MβCD에 의해 유도 NET 형성에 데이터의 경우, 노이만 등의 알을 참조하십시오. 15. </li></ol></li></ol> 2. 지질 분리 및 인간의 혈액 유래 호중구 분석 <ol><li> 후 Bligh 및 다이어 22 Brogden 외에 기초하여 인간 말초 혈 유래 호중구로부터 지질을 분리. (23) <ol><li&gt; 단계 1.2.6에서 호중구를 타고 얼음에 배치합니다. </li><li> 얼음에서 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE)으로 봉합하여 15 ㎖의 스크류 캡 유리관 (메탄올, 클로로포름 용액에 존재) 호중구 피펫 1 분간 흔들어이를 균질화. 플라스틱 표면에 결합로부터 지질을 방지하기 위해, 유리 튜브를 사용한다. 사용 PTFE 고무 / 플라스틱 오염을 방지하기 위해 캡. </li><li> 메탄올 2 mL를 넣고 클로로포름 1 ㎖를 1 분 후에 하였다. 1 분 동안 다시 흔든다. </li><li> 유리 튜브 RT에서 30 분 동안 50 rpm으로 회전. </li><li> 7 ℃에서 용액을 10 분 동안 1,952 XG 원심 분리하여 단백질 분획을 펠렛. </li><li> 조심스럽게 뒤 단백질 함유 펠렛을 떠나, 새로운 15 ML 글래스 나사 캡 튜브에 뜨는을 가만히 따르다. 미래의 정량 -20 ° C에서 펠렛을 저장합니다. </li><li> 클로로포름 1 mL를 넣고 1 분간 기다린 이중 증류수 1 mL를 첨가하고 30 초 동안 샘플 유리 스크류 캡 튜브를 반전. </li&gt; <li> 7 ℃에서 원심 분리하고 10 분 동안 1,952 XG 및 아래, 상부 상을 폐기하지만, 흐린 층을 포함하지 않음. </li><li> 필요한 경우, 단계 2.1.8을 반복하여 임의의 추가 정제 단계를 수행한다. </li><li> 60 ℃에서 진공 농축기에서 샘플을 건조하고 사용할 때까지 -20 ℃에서 보관. </li></ol></li><li> 고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC) 콜레스테롤, 인지질 및 스 핑고 마이 엘린을 포함한 여러 지질의 양이 반 - 정량화 <ol><li> 다음 네 가지 실행 솔루션 및 염색 액을 준비합니다. <ol><li> 용액 1 : 에틸 아세테이트 (26.6 %), 1- 프로판올 (26.6 %), 클로로포름 (26.6 %), 메탄올 (26.6 %)과 염화 칼륨 (9.6 %)을 섞는다. HPLC 품질의 물 100 mL에 0.25 g의 KCl을 용해하여 KCl을 준비. </li><li> 용액 2 : n- 헥산 (73 %), 디 에틸 에테르 (23 %) 시트르산 (2 %)을 섞는다. </li><li> 용액을 3 : 100 % n- 헥산. </li><li> 하여 염색 액을 준비황산동 7.5 g에 증류수 (90 ㎖)에 혼합 한 후 인산 10 mL를 첨가. </li></ol></li><li> 별도의 유리 용기 내의 각각의 용액을 5 mm로 채운다. 각 챔버의 실행 속도를 증가시키기 필터 종이의 종류를 추가합니다. </li><li> 주행 용액 플레이트의 상단에 도달 할 때까지 제 1 실황 용액에 20 × 10cm HPTLC 실리카 겔 60 유리판 사전 부화. 이어서 110 ℃에서 10 분 동안 건조시킨다. 주의 : 이러한 플레이트는 알루미늄 호일에 나중에 사용하기 위해 저장하고 사용하기 전에 110 ℃에서 10 분간 건조시킬 수있다. </li><li> 1 : 1의 클로로포름 / 메탄올 200 μL 단계 2.1.10에 의한 지질 펠릿 녹인 용액을 용해하고, 37 ℃에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 통치자와 원하는 샘플 수에 대한로드 지점을 표시하는 부드러운 연필, 플러스 적어도 하나 개의 표준을 사용합니다. 마크 주행 거리가 약 4cm 각각 제 1 및 제 2 주행 용액 용 6cm. </li><li> 샘플을 로딩하기 위해, 클로로포름 / 메탄올 10 μL 주사기 3 회 반복한다 (1 : 1)에 앞서 각각의 새로운 샘플을 로딩한다. 로드 가능한 작은 영역에 샘플을 농축하려는 각각의 샘플 적가 10 μL. 샘플은 중복 적어도로드해야합니다. </li><li> 용액 1 (단계 2.2.1.1)을 실행하여 상기 제 1 챔버로 수직 플레이트를 놓는다. 플레이트를 일정한 이동 속도를 달성하기 위해 유리 챔버의 벽에 평행인지 확인. </li><li> 용매 라인이 제 1 마크에 도달하면, 상기 플레이트를 제거하여 건조하고, 제 2 용액에 배치. 두 번째 및 세 번째 실행 솔루션에 대한 유사한 단계를 반복; 용매를 전면 판의 상부에 도달 할 때까지, 상기 용액에두고 판을 1 분 동안 RT에서 제거하고 건조. </li><li> 7 초 동안 황산동 용액 플레이트를 놓는다. 철저하게 건조, 플레이트를 제거하고, 170 ℃에서 7 분간 오븐에서 굽는다. 플레이트가 식을 때까지 기다리십시오. </li><li> USING 박층 크로마토 그래피 및 겔 분석 소프트웨어뿐만 아니라, 화상 처리 소프트웨어는, 스캔 Brogden 등에 의해 전술 한 바와 같이 분석한다. (23). </li></ol></li><li> 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 콜레스테롤의 양을 정량화 <ol><li> 5㎛의 / 4.6 mm 가드 카트리지에 100 × 4.6 mm 칼럼을 연결하고 32 ℃로 가열한다. 각 샘플에서 콜레스테롤의 양을 정량하기 위해 65 바에서 1 mL / 분의 유속, 202 nm에서 UV 검출기로 측정 이동상으로서 메탄올을 사용한다. </li><li> 펌프를 청소 바늘을 세척, 냄비를 세척, 주사기를 정화, 펌프 퍼지 세척 : 샘플을 분석하고 다음 단계를 수행 철저히 전에 HPLC 시스템을 씻으십시오. 물을 모두 씻어. 마지막 5 분 동안 5 ㎖ / min의 유속으로 메탄올 시스템 퍼지를 수행한다. </li><li> 콜레스테롤 표준 곡선을 설정하려면 이르기까지 최소 4 개 농도를 준비0.05 mg 내지 / ㎖로 2 밀리그램 / ㎖의 클로로포름 / 메탄올 콜레스테롤 (1 : 1) 24. </li><li> 클로로포름 / 메탄올 500 μL 단계 2.1.10에서 얻어진 샘플 재현 탁 (1 : 1) 스크류 탑 레드 PTFE / 화이트 실리콘 뚜껑 호박색 1.5 ML 글래스 병이다. </li><li> 단계 2.3.3에서 제조 한 표준을 사용하여 콜레스테롤 농도를 정량화. 참고 : 샘플 다음에 적어도 표준 하나는 음성 대조군을 시작으로 샘플링 프로토콜을 입력합니다. </li><li> 곡선 아래의 면적으로서 표현 결과 및 통계 소프트웨어를 사용하여 적절한 샘플 간의 비교. 주 : 결과는 표준 곡선에 대해 정량화 될 수 있고, 총 콜레스테롤 mL의 양, g, 또는 세포의 숫자로 표시 될 수있다. 표준 곡선의 방정식은 단계 2.3.3에서 얻은 값을 사용하여 계산한다. </li></ol></li></ol> 그물 3. 시각화 및 정량화 <ol><li> 마주그물의 ualization 참고 : 뉴저지 네츠의 시각화는 노이만 등으로 이전에 출판 작업을 기반으로한다. 15. <ol><li> 1X PBS 200 μL와 단계 1.3.8에서 3 회 고정 샘플을 씻는다. </li><li> 블록 및 RT에서 45 분 동안 웰 당 PBS로 2 % BSA 100 μL, 0.2 % 트리톤 X-100으로 Permeabilize 하시려면. </li><li> 일차 항체 100 ㎕를 추가 마우스 단일 클론 항 DNA 히스톤 1 항체 (2.2 Mg를 재고 희석 / ㎖ 1 : PBS는 2 % BSA 0.2 %를 함유하는 5,000 트리톤 X-100) 또는 마이 엘 로퍼 옥시 다제에 대한 다 클론 항체 (MPO; 토끼 항 MPO 1 희석 : PBS (300)는 2 % BSA 및 0.2 % 트리톤 X-100)을 함유한다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션. </li><li> 1X PBS 200 μL로 3 회 반복한다. </li><li> 이차 항체의 100 μL 추가 (1 형광 표지 염소 항 마우스 : BSA-PBS - 트리톤 X-100 및 염소 항 - 토끼에 1000을 1 : 1,000 BSA-PBS - 트리톤 X-100) 1 시간에 대한 어둠 속에서 RT. </li><li> 200 &amp; #로 3 회 세척181; 1X PBS의 L. </li><li> 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거하고 유리 슬라이드에 DAPI를 포함하는 설치 매체의 3 μL 내려 놓는다. </li><li> HCX PL APO 40X 0.75 ~ 1.25 오일 침지 대물 (15)를 구비 한 공 초점 반전 계 형광 현미경을 사용하여 샘플을 조사한다. </li></ol></li><li> 순수한 개방 핵 정량 <ol><li> 이미지 처리 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ에) 드래그를 열고 도구 모음에 관심이 사진을 놓습니다. </li><li> &quot;플러그인&quot;, &quot;분석&quot;및 &quot;셀 카운터를 클릭하십시오.&quot; </li><li> 대향 창에서 &quot;초기화&quot;버튼을 누르고 이의 종류를 선택 (도에 표시되는 예를 들면, 비 방출 셀 황색 8 NET 개방 셀 레드 7 클릭 6B-I 및 II). 참고 : NET 양성 세포에 대한 기준 : 긍정적으로 얼룩진 녹색 핵 + 덜 조밀 한 nucleuS (분엽 손실) 또는 핵의 원형 + 핵의 증가 된 크기 또는 오프 촬영 뚜렷한 세포의 발생 손실. </li><li> 위의 기준에 모든 세포의 부착을 클릭하고 분석 소프트웨어의 데이터 시트로 계산 휴대폰 번호를 작성합니다. </li><li> NET-해제 비 방출 셀 카운트 셀 번호를 사용 NET 분비 세포의 비율을 계산한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 방법은 HPTLC 또는 HPLC에 의해 콜레스테롤과 같은 특정 지질을 분석하고, 네트의 형성에 약리 지질 변화의 영향을 조사하는데 사용될 수있다 (노이만 등. 15 참조). HPTLC 샘플의 다수의 지질의 광범위한 분석을 비교적 비용 효과적인 간단한 방법이다. 이 방법은 항생제 정량화 25, 리소좀 저장 질환 26 지질 저장소 및 상피 세포에서 콜레스테롤 및 27 cholesterylglucoside 수준의 결정을 포함하여 많은 연구 분야에서 사용되고있다. 여기에 설명 된 방법은 수정 및 정제 호중구 모집단 지질을 분리하기 위해 최적화시켰다 그러나, 약간 수정 된 버전은 또한 조직 샘플에서 지질 (Brogden 외. 23 참조)...

<html> 지질은 세포의 항상성, 세포 사멸, 호스트 병원체 상호 작용 및 사이토 카인 릴리스 1에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 시간이 지남에 따라, 호스트 병원체 상호 작용이나 염증 지질의 영향에 대한 관심과 지식이 증가하고, 여러 출판물 세포 반응의 특정 지질의 중심 역할, 특히 스테로이드 콜레스테롤을 확인합니다. 3- 히드 록시 -3- 메틸 - 조효소-A 환원을 차단하여 콜레스테롤 생합성 억제제로 사용되는 스타틴과 약리 치료 (HMG-CoA를 환원)은 인터류킨의 혈중 농도를 낮춤으로써 같은 항염증제를 작동 할 도 6 및 C 반응성 단백질 2. 및 콜레스테롤 - 글리 풍부한 구조는 호스트 (3), (4), (5)에 대한 게이트웨이로서, 세균 및 바이러스와 같은 여러 병원체에 의해 사용될 수있다클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 6. (예를 들어, 스 핑고 마이 엘린)가 도시되어 스핑 고리 피드는 병원성 7을 촉진하는 병원균에 의해 사용된다. 대 식세포에서 마이코 박테리아의 사용 세포를 입력하는 도메인을 콜레스테롤이 풍부한; 콜레스테롤의 고갈은 마이코 박테리아 흡수 8을 억제한다. 또한, Francisella 야토 (또한 토끼 열이라고도 함) 야토 병을 담당하는 동물 매개 제 (9)와 대 식세포가 감염 콜레스테롤 멤브레인 (10)로부터 고갈 될 때 폐지되었다 감염되었다. 유사하게, 지질 과다 구조를 통해 대장균에 의한 숙주 세포의 침윤 콜레스테롤 의존 4 것으로 입증되었다. 또한, 상피 세포의 살모넬라 균 감염 실험 콜레스테롤은 세포 (11)에 병원균 항목에 대한 필수적이라는 것을 보여 주었다. 콜레스테롤 고갈 inhibite살모넬라 (11)의 D 섭취. 또한, Gilk 등의 등의 최근 연구. 콜레스테롤은 Coxiella의 burnetti (12)의 흡수에 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 또한, 투옹 등. 25 hydroxycholesterol은 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)에 의한 식세포 작용에 중요한 역할을한다는 것을 발견 식세포 (13) 전혈. 대 식세포는 약리학 콜레스테롤 (14)을 고갈 처리했을 때 식균 작용이 감소되었다. 따라서, 콜레스테롤 등의 지질은 고갈 여러 병원균 10, 11, 12에서 침략의 위험을 줄일 수 있기 때문에, 감염과 염증에 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 최근에, 우리는 호중구 extracellula의 형성, 즉 지질 변화, 세포에서 콜레스테롤 특히 고갈을 보여 유도 할 수 있었다인간 혈액 유래 호중구 15 R 트랩 (네트). 2004 년에 그물의 발견 때문에, 세균 함정 수사에 중요한 역할을하는 것으로, 따라서 감염 (16), (17)의 확산을 방해에있다. 그물 히스톤, 프로테아제, 및 항균 펩타이드 16와 연관된 DNA 골격 구성. 호중구 그물의 릴리스는 예컨대 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 또는 스타틴 16, 20와 같은 병원균 (18, 19) 및 화학 물질이 침입하여 유도 될 수있다. 그러나, 자세한 세포 메커니즘과이 과정에서 지질 특히 역할은 아직 완전히 명확하지 않다. 지질의 분석은 그물의 출시로 세포 프로세스와 상호 작용의 다양한에 관여하는 메커니즘을 더 잘 이해 될 수 있습니다. CholesteROL과 스 핑고 마이 엘린은 안정성을 추가하고 단백질 인신 매매 및 이벤트 (21) 신호 전달에 관여하는 단백질의 클러스터링을 촉진 세포막과 지질 마이크로 도메인의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 환상 올리고당 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)과 같은 특정 지질 양친되는 약물의 기전 역할을 조사하기 위해, 세포의 지질 성분을 변경하고, 시험관 (15) 콜레스테롤을 감소 시키는데 사용될 수있다. 여기서는 MβCD에 응답 호중구의 지질 조성 분석 HPTLC를 사용하는 방법을 제시한다. HPLC는 호중구 인구 콜레스테롤의 수준을 확인하는 데 사용되었다. 더욱이, 우리는 MβCD에 응답하여 인간 혈액 유래 호중구 면역 형광 현미경으로 그물의 형성을 시각화하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Neutrophil isolation, NET staining and quantification</td></tr><tr><td>Alexa Flour 633 염소 항토끼 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MPO&alpha; 항체</td><td>Dako</td><td>A0398</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3912-100G</td><td></td></tr><tr><td>Marienfeld-Neubauer Improved counting chamber</td><td>Celeromics</td><td>MF-0640010</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 TCS SP5 AOBS 탠덤 스캐너</td><td>Leica</td><td>DMI6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s PBS 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td>, <td>1x 작업 용액을 위해 물에 1:10 희석</td></tr><tr><td>Dy Light 488 공액 고교차 흡수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35503</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td>, <td>Microsoft</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>DNA/Histone 1 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB3864</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.8</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>VWR</td><td>630-1554</td><td></td></tr><tr><td>메틸-&베타;-사이클로덱스트린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4555-1G</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td>물에 용해, 최대 65°C까지 가열; C를 선택하고 용액 PMA를 맑게 하기 위해 1N NaOH를 첨가</td></tr>합니다: <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>Stock 16 &micro; M, 1x PBS</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>AXIS-SHIELD</td><td>AN1114683</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 퇴색 방지 시약(DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P7481</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약</td><td>Invitrogen</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>PAA</td><td>E 15-848</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with CaCl 및 Mg</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ml</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblue</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>0.4% 용액</td></tr><tr><td>물</td><td>Carl Roth</td><td>3255.1</td><td>endotoxin-free</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>카탈로그 번호&nbsp; </td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">지질 분리 및 분석</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33538</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 주사기</td><td>Hamilton</td><td>701 NR 10 &micro; l</td><td></td></tr><tr><td>디 에틸 에테르</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이</td>트 <td>칼 로스</td><td>7336.2</td><td></td></tr><tr><td>Canullla 26 G</td><td>브라운</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산 펜타 하이드레이트</td><td>머크</td><td>1027805000</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>칼 로스</td><td>7331.1</td><td></td></tr><tr><td>CP ATLAS 소프트웨어</td><td>Lazarsoftware</td><td>2.0</td><td></td></tr><tr><td>크로몰리스 고해상도 RP-18 엔드 캡 100-4.6 mm 컬럼</td><td>Merck</td><td>152022</td><td></td></tr><tr><td>고성능 액체 크로마토 그래프 Chromaster</td><td>Hitachi</td><td>HITA 892-0080-30Y</td><td>Paramaters는 개별 HPLC 기계에 의존합니다</td></tr><tr><td>HPLC UV 검출기</td><td>Hitachi</td><td>5410</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 컬럼 오븐</td><td>Hitachi</td><td>5310</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Auto 샘플러</td><td>Hitachi</td><td>5260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 펌프</td><td>Hitachi</td><td>5160</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carl Roth</td><td>7342.1</td><td></td></tr><tr><td>n-헥산</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td></td></tr><tr><td>인산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30417</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Merck</td><td>49,361,000</td><td></td></tr><tr><td>Potters</td><td>LAT Garbsen</td><td>5 ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS,</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.3</td><td></td></tr>, <tr><td>HPTLC 실리카겔, 60</td><td>Merck</td><td>105553</td><td></td></tr>, <tr><td>Vacufuge plus, 기본 장치</td>, <td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td></td></tr><tr><td>Corning, Costar 세포 배양 48웰 플레이트, 평평한 바닥</td><td>, Sigma</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td>, <td>1198882</td><td></td></tr>, <tr><td>유리 슬라이드</td><td>Carl Roth</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>BD 투베르쿨린 주사기 1mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

고성능 박층 크로마토 그래피 (HPTLC)에 의해 수행 지질 지질 분석은 다양한 분석을 비교적 간단하고 비용 효율적인 방법이다. (호스트 병원체 상호 작용 또는 호스트 항목에서 예를 들면) 지질의 기능은 세포 과정에 중요한 역할을하는 것으로보고되고있다. 여기서, 우리는 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)와 비교하여 기본 HPTLC 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준에 초점 지질 조성의 결정 방법을 도시한다. 목표는 호중구 세포 트랩 (그물)의 형성에 지질 / 콜레스테롤 변화의 역할을 알아보고자 하였다. NET 해제는 호스트 내에 병원균 확산을 방지하기 위해 호스트 방어 메커니즘으로 알려져있다. 따라서, 혈액 유래의 인간 호중구 세포 지질 변형을 유도 메틸 β - 시클로 덱스트린 (MβCD)으로 처리 하였다. HPTLC 및 HPLC를 사용하여, 우리는 세포의 MβCD 처리가 지질에 이르게하는 것으로 나타났습니다셀의 콜레스테롤 함량의 상당한 감소와 관련된 변경. 면역 형광 현미경 같이 동시에, 호중구의 MβCD 처리, 그물의 형성되었다. 요약하면, 우리가 지질 호중구의 변경 및 그물의 형성을 연구하는 구체적인 방법을 제시한다.

인간 혈액 유래 호중구는 밀도 구배 원심 분리 (도 2)에 의해 단리 하였다. 호중구 지질 변화의 영향을 조사하기 위해, 세포를 세포로부터 콜레스테롤을 고갈 된 10 mM MβCD로 처리 하였다. Brogden 등에 의해 기술 된 바와 같이 계속해서, 지질, 및 후 Bligh 다이어 (도 1, 왼쪽 패널)에 의해 샘플로부터 분리 하였다. (23). 준비된 지질 시료를 분리하여 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 스 핑고 미엘린, 인지질 및 triacylglycerides, 유리 지방산을 포함한 리피드의 넓은 범위를 시각화하기 위해 최적화 된 세 용액 프로토콜을 사용하여 실리카 겔 HPTLC 플레이트 및 실행에로드 된 , 모노 아실 글리세롤, 포스파티딜 에탄올 아민, 카디오 리핀, 포스파티딜 세린, 및 포스파티딜콜린 (도 3...

지질은 세포 기능에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 호중구 세포 트랩 형성의 기본 메커니즘의 더 나은 이해를 얻기 위해 HPTLC 및 HPLC를 모두 사용하여, 콜레스테롤 수준에 중점을두고, 호중구의 지질 구성을 결정하는 방법을 설명합니다.

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

이 방법의 전반적인 목표는 박층 크로마토그래피와 HPLC를 사용하여 호중구 세포 외 트랩이 방출되는 동안 호중구의 지질 조성 변화를 조사하는 것입니다. 이 방법은 호중구 세포 외 트랩 또는 줄여서 NET 형성이라고 하는 형성에 관여하는 메커니즘에 대한 자세한 정보를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차의 주요 장점은 따라하기 쉬운 프로토콜을 활용하여 호중구의 일반적인 기능에서 지질의 역할에 대한 정보를 제공한다는 것입니다.인간 혈액 유래 세포의 분리는 우리 연구실의 전 박사 과정 학생인 Ariane Neumann에 의해 입증될 것입니다. 그리고 그녀는 Friederike Reuner의 도움을 받을 것입니다. 지질 분석을 위한 세포 준비는 제 연구실의 박사후 연구원인 Graham Brogden과 생화학 프로그램의 석사 과정 학생인 Diab Husein에 의해 시연될 것입니다.인간 혈액 유래 호중구를 혼합하지 않고 화염 근처에서 20mL의 디아트리조산나트륨/덱스트란 용액에 약 20mL의 혈액을 층을 형성하여 분리합니다. 제동 없이 g470회에서 30분간 원심분리기. 혈액 단계를 용액의 밀도 등급과 혼합하지 않는 것이 중요합니다.원심분리 단계와 단핵 단계 후에는 세포의 오염 또는 불특이적 활성화를 방지하기 위해 세포를 조심스럽게 제거해야 합니다. 단핵 세포와 황색을 띤 플라즈마 층을 제거합니다. 다형성 핵 세포 또는 PMN 상을 새로운 50 mL 튜브로 옮기고 1X 인산염 완충 식염수로 최대 50 mL를 채웁니다.제동과 함께 470회 g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 펠릿을 5mL의 멸균수에 5초 동안 다시 현탁시켜 적혈구를 용해시킵니다. 즉시 튜브에 1X PBS를 50mL로 채우고 샘플을 원심분리합니다.상등액을 제거할 때 펠릿은 흰색이어야 합니다. 여전히 빨간색이면 이 단계를 반복합니다. 그런 다음 펠릿을 Roswell Park Memorial Institute 또는 RPMI 배지 1000마이크로리터에 다시 현탁시킵니다.광학 현미경으로 Trypan Blue 염색과 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다. RPMI에서 mL당 200만 개의 세포 농도로 세포 현탁액을 준비합니다. 20mL의 혈액에서 약 2,500만 개의 호중구를 채취할 수 있습니다.지질 분석을 위해 호중구를 약리학적으로 치료하려면 준비된 세포 1,500만 개를 사용합니다. 반응 튜브의 샘플을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 2시간 동안 배양합니다. 시료를 원심분리한 후 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 300마이크로리터의 HBSS에 다시 현탁시킵니다.동일한 파라미터를 사용하여 샘플을 다시 원심분리한 후 1:1 클로로포름:메탄올 용액 1mL에 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 1mL 주사기에서 샘플을 10회 밀어 넣어 다시 부유한 펠릿을 26게이지 캐뉼라로 균질화합니다. 인간 말초 혈액 유래 호중구에서 지질을 분리하려면 준비된 호중구를 얼음 위에 올려 놓습니다.PTFE 밀봉이 있는 15mL 나사 캡 유리관에 호중구를 피펫으로 넣고 1분 동안 흔들어 균질화합니다. 그런 다음 2mL의 메탄올을 첨가하고 1분 후에 1mL의 클로로포름을 첨가합니다. 1분 더 흔든 후 유리관을 실온에서 50rpm으로 30분 동안 회전시킵니다.다음으로, 용액을 섭씨 7도에서 1, 952 회 g으로 10 분 동안 원심 분리하여 단백질 분획을 펠릿화합니다. 단백질 함유 펠릿은 남겨두고 새로운 15mL 유리 스크류 캡 튜브에 상등액을 조심스럽게 디캔팅합니다. 향후 정량화를 위해 펠릿을 섭씨 20도에서 보관하십시오.클로로포름 1mL를 넣고 1분 정도 기다립니다. 그런 다음 이중 증류수 1mL를 넣고 유리 나사 캡 튜브를 샘플과 함께 30초 동안 뒤집습니다. 이전과 같이 샘플을 원심분리한 후, 상부상을 제거하고 흐린 층을 제외한 아래까지 폐기합니다.진공 농축기에서 샘플을 섭씨 60도의 진공 농축기로 건조시키고 필요할 때까지 섭씨 20도에서 보관합니다. 시작하려면 해당 유리 챔버에 각 용액을 최대 5mL까지 채웁니다. 각 챔버의 실행 속도를 높이기 위해 모든 종류의 여과지를 추가하십시오.첫 번째 실행 용액에서 20x10cm HPTLC 실리카겔 60 유리판을 사전 배양합니다. 흐르는 용액이 접시 상단에 도달하면 섭씨 110도에서 110분 동안 건조시킵니다. 진공 농축기로 건조시킨 후 이전에 얻은 지질 펠릿을 원하는 부피의 1:1 클로로포름:메탄올 용액에 용해시키고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하여 용해합니다.그런 다음 자와 부드러운 연필을 사용하여 원하는 샘플 수와 하나 이상의 표준물질에 대한 로딩 지점을 표시합니다. 첫 번째 실행 솔루션의 경우 약 4cm, 두 번째 실행 솔루션의 경우 약 6cm로 실행 거리를 표시합니다. 샘플을 로드하려면 새 샘플을 로드하기 전에 10마이크로리터 주사기를 1:1 클로로포름:메탄올로 세 번 세척합니다.각 샘플을 10마이크로리터씩 적하 방향으로 로드하여 가능한 한 작은 영역에 샘플을 집중시키려고 합니다. 용액 1이 실행되는 첫 번째 챔버에 플레이트를 수직으로 놓습니다. 균일한 마이그레이션 속도를 달성하기 위해 플레이트가 유리 챔버의 벽과 평행한지 확인하십시오.플레이트가 유리 챔버의 뒤쪽 벽과 평행하게 배치되고 지질이 효율적으로 분리되도록 용매 선단이 너무 멀리 흐르지 않도록 주의하십시오. 용매 라인이 첫 번째 표시에 도달하면 플레이트를 제거하고 건조시킨 다음 두 번째 용액에 놓습니다. 두 번째 실행 솔루션과 세 번째 실행 솔루션에 대해 유사한 단계를 반복합니다.용매 전면이 플레이트 상단에 도달할 때까지 플레이트를 용액에 그대로 두십시오. 그런 다음 플레이트를 제거하고 실온에서 1분 동안 건조시킵니다. 플레이트를 황산구리 용액에 7초 동안 놓습니다.접시를 완전히 말린 후 섭씨 170도의 오븐에서 7분 동안 굽습니다. 오븐에서 접시를 꺼내 식히십시오. HPLC를 수행하려면 컬럼을 기기의 가드 카트리지에 부착하고 섭씨 32도까지 가열합니다.메탄올을 분당 1mL 및 65bar의 유속으로 이동상으로 사용합니다. UV 검출기를 202나노미터로 측정하도록 설정하여 각 샘플의 콜레스테롤 양을 정량화합니다. 샘플을 분석하기 전에 HPLC 기계를 철저히 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜레스테롤 표준 곡선을 설정합니다.마지막으로, HPLC 기기에 로드하기 전에 나사식 상단 빨간색 PTFE/흰색 실리콘 뚜껑이 있는 호박색 1.5mL 유리병에 담긴 1:1 클로로포름:메탄올 500마이크로리터에 샘플을 다시 현탁시킵니다. 다음은 HPTLC 플레이트에 있는 호중구의 지질 프로필입니다. 지질은 이동 거리를 표준물질과 비교하여 식별할 수 있습니다.또한 두 개의 큰 피크를 보여주는 HPLC 크로마토그램도 표시됩니다. 2분 직전의 첫 번째 피크는 클로로포름입니다. 5분에 두 번째로 큰 피크는 콜레스테롤입니다.다음은 HPLC와 HPTLC에 의해 결정된 콜레스테롤 표준 곡선입니다. HPLC에 의해 얻어진 표준 곡선은 HPTLC 표준 곡선에 비해 더 넓은 농도 범위에서 선형입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 인간 혈액 유래 호중구를 분리하고 지질 조성을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 위험한 클로로포름:메탄올 노출로부터 손을 보호하기 위해 니트릴 장갑을 착용하고 흄 후드 아래에서 작업하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 향후 실험은 NET 형성과 관련된 메커니즘 및 아직 완전히 이해되지 않은 일반적인 호중구 기능에 대한 추가 정보를 제공할 것입니다. 1차 인간 혈액 유래 세포를 연구하려면 윤리적 허가가 필요하며 인간 병원체에 대한 노출 위험을 피하기 위해 해당 생물 안전 실험실에서 작업하는 것과 같은 적절한 안전 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.마지막으로, 본 연구의 목적은 선천면역계를 기반으로 감염에 대한 새로운 치료 표적을 찾는 것이며, 특히 지질 조성은 호중구가 감염에 대해 항균 작용을 하는 이유를 이해하는 데 도움이 될 것이기 때문에 매우 흥미롭습니다.

methods-to-study-lipid-alterations-neutrophils-subsequent-formation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

여기에 제시된 프로토콜은 현미경 및 형광 염색을 사용하여 살아있는 세포 배양에서 대식세포 외 트랩(MET) 생산을 검출하는 프로토콜이다. 이 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 특정 MET 단백질 마커를 검사하기 위해 더 확장될 수 있다.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

인간 혈장에서 저밀도 지단백(LDL)의 분리, HL-60 세포의 호중구 유사 세포로의 분화, LDL의 존재 하에서 호중구 세포외 트랩(NET)의 제조, NET과 LDL의 혼합물로 인간 대동맥 내피 세포의 자극.

저밀도 지단백질의 존재 하에서 호중구 세포외 트랩을 이용한 혈관 내피 세포의 자극

저밀도 호중구(LDN)는 여러 질병에서 크게 증가합니다. LDN은 일반적으로 세포 분류를 통해 분리됩니다. 순수하고 실행 가능한 LDN을 얻는 실용적인 방법을 제시합니다. 말초 혈액의 밀도 구배 원심분리 후 세포를 자성 마이크로비드와 함께 배양한 다음 LDN을 자기 컬럼을 통해 분리합니다.

저밀도 호중구의 효율적인 정제를 위한 신속한 자기-마이크로비드 방법

학습하세요 호중구 지질 구성 분석 방법으로 HPTLC와 HPLC를 사용하여 NET 형성 메커니즘을 연구합니다. 이 프로토콜은 면역학 연구에 유용한 인체 혈액 유래 호중구의 콜레스테롤 수준을 분석합니다.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

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