Name: 도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 학습하세요 변형된 크로마틴 면역침전법과 DNA 초나선화 분석을 사용하여 인간 세포에서 특정 부위 DNA 손상에 대한 구조 단백질의 결합과 위상 변화를 연구하는 방법을. 이 기술은 암 치료를 위한 새로운 약리학적 표적 발견에 기여합니다.

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저자는 도움이 토론 바스케즈 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 [KMV하는 CA097175, CA093279] 건강 / 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)의 국립 연구소에 의해 지원되었다; 암 예방 및 텍사스 연구소 [RP101501]합니다. 오픈 액세스 요금 자금 : 국립 연구소 건강 / 국립 암 연구소 [KMV에 CA093279].

플라스미드 기판에 TFO 지시 ICLS 1. 준비 <ol><li> 10,11 DNA 삼중 결합 완충액 [50 % 글리세롤, 10 mM 트리스 (PH 7.6), 10 mM의를 MgCl2 8 μL에 랄렌 공역 TFO AG30와 (5 μg의 플라스미드 DNA 좋은 출발점) 플라스미드 pSupFG1 몰량 부화 2] 호박색 튜브에서 40 μL의 최종 부피 DH 2 O. 로 pipetting 아래로 잘 섞는다. 12 시간 동안 37 ℃로 물을 욕조에서 반응을 품어. </li><li> 최대 전력 출력을 보장하기 위해 UVA 램프 워밍업. 파라핀 영화의 삼박자 반응을 배치하고, UVA (365 ㎚) 램프 아래에 얼음에 파라핀 필름을 배치합니다. 램프와 반응 사이의 마일 라 (Mylar) 필터를 놓습니다. </li><li> UVA가 18 J / ㎠의 총 투여 량에 대해 조사한다. 더 사용하기 위해 4 ° C에서 샘플을 저장합니다. 주의 : UVA 조사와 적절한 보호 안경과 복을 착용 할 것. </li><li> 재와 상기 제조 된 플라스미드 200 ng의 선형화제조업체를 사용하여 20 μl의 총 부피에 striction 효소 에코 R1 10 배 버퍼를 제공. 열은 65 ° C에서 20 분 동안 효소를 변성. 10,000 XG에 10 분 동안 샘플을 스핀 4 ℃에서 저장한다. </li><li> 50 배 알칼리 버퍼 [1.5 M의 NaOH, 50 mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)]를 준비합니다. 50 ㎖ DH 2 O.에 아가로 오스의 0.5 mg을 추가 아가로 오스를 해산하고 50 ° C의 물을 욕조에 배치하는 끓인다. </li><li> 용해 된 아가로 오스의 온도가 아래로 50 ° C에 후에는 50 배 알칼리 버퍼 1 ㎖를 추가하여 혼합 한 후 젤 트레이에 젤을 붓는다. 젤은 사용하기 전에 실온에서 응고 할 때까지 기다립니다. </li><li> 선형화 된 DNA 시료를 20 ㎕의 0.5 M EDTA 4 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼 추가 (300 mM의 NaOH를 6 mM의 EDTA (승 / 18 % v)의 고 분자량 폴리 사카 라이드, 0.06 % 브로 모 크레졸 그린 DH 2 O)에 샘플 및 1 킬로바이트 DNA 사다리. 주 : 6 배 알칼리 젤 로딩 버퍼를 사용하는 것이 중요하다, 논의를 참조하시기 바랍니다. </li><li> 로드 추운 방에 젤 위에 샘플 cm 당 3.2 볼트에서 하룻밤 1X 알칼리 버퍼 (12-16 시간)에서 실행합니다. 샘플이 겔을 입력하면, 플로팅되는 것을 방지하기 위하여, 겔 위에 유리판을 배치했다. </li><li> 중화 완충액 [1 M 트리스 CL (PH 7.6), 1.5 M의 NaCl, 3M 아세트산 나트륨 (pH5.2)]을 실온에서 45 분 동안의 겔을 침지하여 시료를 중화. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 50 ml의 물에 1 %의 에티 디움 브로마이드 (EtBr로) 4 μL에 대한 DNA 젤 얼룩. 15 분 동안 물 Destain. 촬상 시스템을 이용하여 DNA를 시각화. 주의 : EtBr이 돌연변이는 강력하고 피부를 통해 흡수 될 수있다. EtBr이 직접 접촉을 피하십시오. </li></ol> 인간의 세포에서 TFO 지시 ICL 포함하는 플라스미드 2. 형질과 면역 침전 <ol><li> 플레이트 400,000 포유류 세포 (예를 들면, O U2OS둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 60mm 접시 당 steosarcoma 세포)를 형질 감염 24 시간 전에 항생제없이 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충. 5 % CO 2와 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어. </li><li> 수욕에서 37 ° C로 형질 따뜻한 성장 배지 및 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 앞서. 실온으로 형질 감염 시약을 따뜻하게. </li><li> 10 분에 500 1 배 성장 미디어 μL (혼합 1)과 (2) 별도의 14 mL에 1 배 성장 미디어 (혼합 2) 500 μL의 플라스미드를 ICL 함유 TFO 지시 둥근 바닥 튜브 μg의와 형질 전환 시약의 30 μl를 품다 실온. </li><li> 2 믹스로 pipetting 아래로 잘 혼합 믹스 1을 추가합니다. 실온에서 25 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 따뜻한 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세포의 플레이트에 걸쳐 균등하게 분배 적가 방식으로 형질 전환 혼합물을 추가한다. 접시에 성장 배지 1 ㎖를 추가하고 2 ml의에 최종 볼륨을 가지고. 우리 믹스게요. 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C를 인큐베이터에서 배양 플레이트를 놓습니다. </li><li> 10 % FBS와 보충 3 ㎖ 성장 미디어와 미디어를 교체하고 16 시간 동안 더 배양한다. 항생제를 사용하지 마십시오. </li><li> 대략 1 %의 최종 농도로 플레이트 당 신선한 37 % 포름 알데히드의 80 μL로 세포를 처리하고, 빛의 부재하에 실온에서 10 분 동안 배양한다. 주의 : 포름 알데히드는 독성 및 안전 지침에 따라 처리되어야한다. 포름 알데히드의 노출은 피부, 눈과 호흡 기관에 해를 입힐 수 있습니다. </li><li> 접시 당 (시판 키트에 공급) 냉장 글리신의 300 μl를 추가하고 5 분 동안 배양하여 포름 알데히드 가교을 끄다. 용지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척 한 후 microcentrifuge 관에 냉장 (4 ℃) PBS 1 ml의 근근이 살아가고에 의해 세포를 수집합니다. 항상 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 5 분 a를 4 ℃에서 원심 분리하여 세포 펠렛을 준비탁상 냉장 원심 분리기를 사용하여 13,400 XG에서 t. 피펫 밖으로 뜨는을하고 얼음에 세포 펠렛을 배치합니다. </li><li> 균일 1 ml의 냉장 (4 ℃) 버퍼 A (시판 키트에 공급)에 펠렛을 재현 탁하고 10 분 동안 얼음에 품어. 튜브를 반전 가끔 섞는다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 균일하게 냉각 한 용액에 펠릿 (4 ° C) 버퍼 B를 (시판 키트에 제공) 재현 탁하고 반전 가끔 믹싱과 10 분 동안 얼음에 품어. 이전 원심 분리하여 펠렛 세포 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 버퍼 B. 냉각 200 μL에 다시 세포를 재현 탁하면 Micrococcal의 클레아 제 (MNase)의 2 μl를 추가하고 10 분 동안 실온에서 품어. 튜브를 쓸어 넘겨 때때로 반응을 섞는다. 얼음에 튜브를 배치하고 40 mM의 EDTA를 첨가하여 MNase 반응을 멈춘다. 펠렛 세포 이전 (위의 단계 2.9 참조). </li><li> 100 ㎕의 1 배 염색질 immunopr에 재현 탁 세포프로테아제 억제제 칵테일로 보충 ecipitation 버퍼 (칩) 버퍼 (시판 키트에 제공). </li><li> 얇은 벽의 microfuge 튜브에 재현 탁 세포를 놓습니다. 얼음에 20 초 동안 배양 한 다음 20 초 동안 물 목욕 초음파기에 그들을 떠하여 샘플을 sonicate하세요. 반복 초음파는 ~ 800-1,200 bp의 단편을 생성하기 위해 9 번 단계를 반복합니다. <ol><li> 초음파 처리 된 샘플 20 μL에 텍싱에 의해 잘 3 ㎕의 5 M NaCl을 1 μL의 RNase A. 믹스를 추가하고 30 분 동안 37 ° C에서 품어. 그 후, 2 μL 테 K를 추가하고 65 ° C에서 2 시간 동안 품어. PCR 정제 키트를 이용하여 시료를 정제. 1 % 아가 로스 겔에서 샘플을 실행하고 EtBr이 함께 시각화. 참고 : 결과 DNA의 최대 강도에서 1,000 bp의 아래에 있어야한다. </li></ol></li><li> 세 개의 튜브에 미리 냉장 실리콘 처리 된 튜브에 해물 30 μl를 추가 한 다음 추가 프로테아제 억제제와 냉장 1 배의 칩 버퍼의 70 μl를 추가합니다. 1 μ 추가각각의 튜브에 안티 - 면역 글로불린 G (IgG를) (양성 대조군으로), 안티 - 히스톤 H3, 또는 안티 HMGB1 항체의 g. 연속 회전 추운 방에서 밤새 품어. </li><li> 균일하게 추운 방에 재현 탁 단백질 G 비즈. 튜브 당 단백질 G 비즈의 4 μl를 추가하고 회전 추운 방에 또 다른 2-4 시간 동안 배양한다. </li><li> 자기 랙을 사용하여 구슬 펠렛과 뜨는을 제거합니다. 펠렛에 프로테아제 억제제 칵테일 혼합 200 μl의 1X 칩 버퍼를 추가하고 회전 추운 방에서 5 분간 씻는다. 두 번 씻어 반복합니다. </li><li> 높은 소금 1 배 칩 버퍼 (70 mM의 NaCl을 함유하는)와 하나의 추가 세척을 수행합니다. </li><li> (시판 키트에 제공됨) 160 ㎕의 용출 완충액으로 펠렛을 재현 탁하고, 30 분 동안 회전하여 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 구슬을 펠렛과 신선한 튜브에 뜨는를 수집합니다. 5 M NaCl을 6 μL와 단백질 분해 효소 K 2 μl를 추가, 65에서 하룻밤 배양기음. </li><li> PCR의 산물 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제하여, 50 μL의 2 O. DH를 사용하여 DNA를 용출 </li><li> PCR에게 관심 영역 (들)에 프라이머 세트를 사용하여 16 반응을 수행하고 EtBr이 물들 1 % 아가 로스 겔에 제품을 해결. </li></ol> 3. 수퍼 코일 분석 및 2 차원 전기 영동 아가로 스겔 <ol><li> DNA 수리 합성 버퍼를 준비한다 (45 mM의 헤 페스-KOH, pH가 7.8, 70 mM의 KCl을 7.4 밀리미터의 MgCl 2, 0.9 mM의 DTT, 0.4 mM의 EDTA, 2 mM의 ATP, 20 μM의 dNTPs, 3.4 % 글리세롤, 18 μg의 소 혈청 알부민) . -80 ° C에서 보관하십시오. 얼음과 이전에 녹여 40 밀리미터 크레아틴 인산 및 2.5 μg의 크레아틴 포스 포 키나제를 추가 사용할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 배 수퍼 코일 버퍼 [500 mM 트리스 (산도 8.0), 500 mM의 NaCl을, 25 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 EDTA], 및 저장을 준비합니다. </li><li> 완전히 1X 1 μL 백시 토포 이소 머라 제 I (5-15 U / μL)을 사용하여 수퍼 코일 pSupFG1 플라스미드의 DNA 300 ng의 선형화10 μl의 반응에서 수퍼 코일 버퍼입니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 얼음 헬라 무 세포 추출물 (24)를 해동. 완전히 이완 된 플라스미드로 25 μL 헬라 무 세포 추출물 및 DNA 수선 합성 버퍼에 추가한다. 잘 섞다. 믹스에 백시 니아 토포 이소 머라 제 I의 추가 1 μl를 추가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) (1 % 최종 농도) 및 프로 티나 제 K (0.25 ㎎ / ㎖ 최종 농도)을 첨가하여 반응을 종료한다. 2 시간 동안 65 ° C에서 품어. </li><li> 1X 트리스 붕산염 EDTA (TBE) 완충액으로 1 % 아가 로스 겔을 전송. DNA 로딩 염료를 추가하고 최소 4 차선 떨어져 겔에 직접 반응을로드합니다. topoisomers를 해결하기 위해 실온에서 1 배 TBE 2 V / cm (차원 1)에 8 ~ 10 시간 동안 젤을 실행합니다. 주 : 트리스 염기 54g을 첨가함으로써 DH 2 O 1 L의 5 배 TBE 원액을 준비한다. 붕산 27.5 g과의 0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ㎖. </li><li> 1 배의이 L 준비3 μg의 / ㎖의 클로로퀸 포스페이트와 TBE. 20 분 동안이 용액 200 ㎖에 젤을 만끽 해보세요. 알루미늄 호일로 겔 트레이를 커버. </li><li> 두 번째 차원의 젤을 electrophorese하려면 시계 방향 방식으로 겔 90 °를 설정하고 양극과 음극 supercoils를 해결하기 위해 1X TBE를 포함 클로로퀸 2 V / cm에서 4-6 시간 동안 실행합니다. </li><li> 로커에 1 시간 동안 EtBr이와 젤을 얼룩. 15 분 동안 DH 2 O로 겔 Destain이어서 이미 저를 사용하여 topoisomers의 열분포를 시각화. </li></ol>

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<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+triplex-forming+oligonucleotide+target+sequences+in+mammalian+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes.</a> Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

TFO 지시 ICLS의 효율적 형성이 중요한 요인에 따라 달라집니다 : 목표에 TFO의 결합 친화도에 따라 그 대상 DNA의 기판과의 TFO의 배양, 적절한 버퍼 구성 요소 (예를 들어,의 MgCl 2) 첫 번째 시간 (종속 이중 및 농도)를 사용; 둘째, UVA의 적절한 투여 량 (365 ㎚)을 조사 효율적 소라렌 가교 결합을 형성한다. 최적 삼중 형성 HPLC 또는 겔 정제 TFOs를 사용함으로써 달성 될 수있다. TFO 오염 불순물은 더 실험 결과를 복잡하게 원치 않는 가교 결합 된 제품으로 이어질 수 있습니다. TFOs 여러 동결 해동 올리고 뉴클레오티드 저하 될 수 있으므로 공유 5&#39;- HMT의 랄렌에 부착 TFOs의 안정성을 증가시키기 위해, TFOs는 -80 ℃에서 분취 량으로 저장한다. 삼중 형성 후 특정 사이트에 랄렌을 대상 (예 : 5&#39;-TA-3 &#39;와 5&#39;-AT-3&#39;예비있다ferred 랄렌 사이트를 가교), 소 랄렌 ICL...

삼중 나선 구조를 형성하는 1-5 훅 스틴 수소 결합을 통해 서열 - 특이 적 방식으로 올리고 뉴클레오티드 (TFOs) 바인드 듀플렉스 DNA를 플렉스가 형성. 플렉스 기술은 이러한 전사, DNA 손상을 복구하고 유전자 타겟팅 (참고 문헌 6-8에서 검토)와 같은 생체 분자 메커니즘의 다양한 심문 사용되고있다. TFOs는 리포터 플라스미드 9,10-에 부위 - 특이 적 손상을 유도하기 위해 널리 사용되어왔다. 우리의 실험실과 다른 사람은 이전에 플라스미드 pSupFG1 5,10-12에 supF 유전자에 사이트 별 DNA의 interstrand의 가교 (ICLS)을 유도하기 위해 소 랄렌 분자에 닿는 TFO, AG30을 사용하고 있습니다. ICLS 이러한 병변 공유 개의 DNA 가닥 가교로서 매우 독성이며, 수리되지두면 유전자 전사를 차단하고, DNA 복제 장치 (13, 14)을 방해 할 수있다. 때문에 독성 잠재력, ICL 유도 화제는 치료에 항암제로 사용되어왔다암 및 기타 질병 15. 그러나, 인간의 세포에서 ICLS의 처리 및 수리가 잘 이해되지 않습니다. 따라서, 인간 세포에서 ICLS의 처리에 관여하는 메카니즘에 대한 이해는 ICL 계 화학 요법의 효능을 개선하는 데 도움이된다. TFO 유도 ICLS 및 수리 중간체는 DNA의 나선 구조에 상당한 왜곡을 야기 할 가능성이있다. 이러한 왜곡은 정규 B 형 이중 DNA 16-20보다 더 높은 친화력으로 왜곡 된 DNA에 결합 건축 단백질에 대한 가능성이 대상입니다. 여기, 우리는 염색질 면역 (칩) 소 랄렌 교 플라스미드에 대한 분석을 통해 인간의 세포에서 ICLS와 매우 풍부한 건축 단백질 협회, HMGB1을 공부하고 인간의 소 랄렌 가교 플라스미드 DNA의 토폴로지를 변조에 HMGB1의 역할을 확인 암 세포 용 해물. HMGB1은 매우 풍부하고 재하 표현이 아닌 자신의정규 B 형 DNA 17-20보다 더 높은 친화력으로 손상된 DNA와 대안 구조화 된 DNA 기판에 결합 톤 건축 단백질. HMGB1 그러한 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 16,21-23 여러 DNA 대사 과정에 관여한다. 우리는 이전에 HMGB1 높은 친 화성 (20)와 체외에서 TFO 지시 ICLS에 결합하는 것을 증명하고있다. 또한, 우리는 HMGB1의 부족 뉴클레오티드 절단 수리 (NER) 보조 인자 (23, 24)로 TFO 지시 ICLS의 돌연변이 처리 및 확인 HMGB1 증가 있음을 증명하고있다. 최근에, 우리는 HMGB1는 인간의 세포에서 TFO 지시 ICLS과 관련된 이러한 병변의 채용은 NER 단백질, XPA (16)에 의존하는 것을 발견했다. DNA의 음의 수퍼 코일은 NER (25)에 의해 DNA 병변의 효율적인 제거를 촉진하기 위해 표시되었습니다, 우리는 HMGB1는 TFO 지시 ICL 함유 플라스틱으로에 우선적으로 부정적인 수퍼 코일을 유도하는 것을 발견했다NER 공동 인자로서 HMGB1의 잠재적 인 역할 (들)에 대한 이해를 제공한다 (비 손상된 플라스미드 기판에 대해) 중간 기판 (16). ICLS의 처리는 완전한 인간 세포에서 알려져 있지 않다; 따라서, 본 명세서에 기재된 분자 도구에 기초한 기술과 개발 분석 차례로 암 화학 요법의 효능을 향상시키기 위해 이용 될 수있는 바와 같이 약물 표적을 제공 할 수있다 ICL 수리에 관련된 추가적인 단백질의 동정을 초래할 수있다. 여기서, 효과적인 방법은 논의 된 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하여 플라스미드 DNA의 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 평가. 또한, TFO 지시 ICLS를 포함하는 플라스미드를 사용하는 기술이 설명되었다 변성 칩 어 세이를 이용하여 셀룰러 환경에서 ICL 손상된 플라스미드 HMGB1 연관을 결정한다. 또한, 손쉬운 방법은 제 도입 위상 수정을 공부구체적으로는 인간 세포 용 해물에서 ICL 손상된 플라스미드 기판상의 전자 구조적 단백질 HMGB1은 이차원 아가 로스 겔 전기 영동을 통해 수퍼 코일 분석을 수행함으로써 측정되었다. 설명 된 기술은 인간 세포에서 플라스미드의 타겟 DNA 손상 처리에 DNA 수리 및 구조적 단백질 관여의 이해를 촉진하기 위해 사용될 수있다. 우리는 플라스미드 DNA, 이후 플라스미드 칩 각각 DNA 토폴로지 변경 병변과 연관 단백질 및 단백질을 확인하는 분석을 수퍼 코일에 TFO 지시 부위 특이 랄렌 ICLS의 형성에 대한 상세한 프로토콜을 설명한다. 이러한 분석은 다른 DNA 손상 제, TFOs 플라스미드 기판 및 관심 포유 동물 세포 라인을 수행하도록 변형 될 수있다. 사실, 우리는 적어도 하나의 전위와 친 화성이 높은 고유 TFO 결합 부위는 인간 게놈 26의 모든 주석 유전자 내에 있다는 것을 보여 주었다. 방법우리 케르 및 바스, 2016 (16)에 이용되는 것처럼 지금까지, 명확성을 위해, 우리는 인간 U2OS 세포에서 특정 돌연변이 리포터 플라스미드 (pSupFG1)의 특정 랄렌 공역 TFO (pAG30)의 사용을위한 이러한 기술을 설명했다.

<table><tbody><tr><td>5' HMT Psoralen-AG30</td><td>Midland Certified Reagent Co., Midland, TX</td><td>맞춤형 주문</td><td>HPLC(또는 겔) 정제</td></tr><tr><td>Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit</td><td>Cell signaling Inc.</td><td>9003</td><td>제조업체가 제안한 프로토콜은 플라스미드 IP가 아닌 염색질 IP에 최적화되어 있습니다. 대조군 IgG 및 H3 항체와 단백질 G 비드 및 소구균 뉴클레아제는 제조업체에서 공급합니다.</td></tr><tr><td>GoTaq Green</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td>PCR 마스터 믹스</td></tr><tr><td>HMGB1 항체</td><td>Abcam</td><td>Ab18256</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Gel 및 PCR 클린업 키트</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>클로로퀸-디포스페이트 염</td><td>Sigma</td><td>C6628-50G</td><td>2차원 아가로스 젤 전기영동용</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>GenePORTER 형질 주입 시약</td><td>Genlantis</td><td>T201015</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Topoisomerase I</td><td>Invitrogen</td><td>38042-024</td><td></td></tr><tr><td>Blak-Ray 장파 자외선 램프</td><td>Upland, CA</td><td>B 100 AP</td><td>UVA 램프</td></tr><tr><td>EpiSonic 다기능 바이오프로세서 1100</td><td>Epigentek</td><td>EQC-1100</td><td>수조 초음파 처리기</td></tr><tr><td>Mylar 필터</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td>80112939</tr><tr><td>아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6111</td><td></td></tr><tr><td>BIO-RAD Chemidoc</td><td>BIO-RAD</td><td>XRS+ 시스템</td><td>DNA 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775-25ML</td><td>교차 연결에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70013073</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>브로모크레졸 그린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114-359</td><td>DNA 로딩 염료</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>02-681-320</td><td>저잔류 마이크로퓨지관</td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A74-1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24731</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>InternationalLight Technologies</td><td>ILT1400-A</td><td>UVA 선량 측정</td></tr><tr><td><강>세포주</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 U2OS 골육종</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-96</td><td>공급 업체에 따라 배양 s 권장 사항</td></tr><tr><td>: 인간 경추 선암종 HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC-CCL-2</td><td>공급 업체에 따라 배양 s 권장 사항</td></tr><tr><td>근위 전방 프라이머</td><td>5&prime;-gcc ccc ctg acg agc atc ac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>근위 역방향 프라이머</td><td>5&prime;-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원위 전방 프라이머</td><td>5&prime;-aat acc gcg cca cat agc ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원위 역방향 프라이머</td><td>5&prime;-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

도구 나선 왜곡, 사이트 별 dna interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 hmgb1의 역할을 연구하는

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

높은 이동성 그룹 상자 1 (HMGB1) 단백질은 전사, DNA 복제 및 DNA 수선 등 게놈 많은 중요한 기능을 조절에 관여하는 히스톤 비 구조적 단백질이다. HMGB1은 정식 B-DNA보다 더 높은 친화력과 구조적으로 왜곡 된 DNA에 결합한다. 예를 들어, 우리는 HMGB1은 DNA가 나선의 왜곡을 야기 공유 결합 DNA의 두 가닥을 연결 가교 (ICLS)를 interstrand, 왼쪽 경우 복구되지 않은 세포 사망을 일으킬 수에 결합하는 것을 발견했다. 때문에 자신의 세포 독성 잠재력, 여러 ICL 유도 에이전트는 현재 병원에서 화학 요법 제로서 사용된다. ICL-형성 제는 특정 염기 서열 (예, &#39;- TA-3 5&#39;는 소 랄렌에 대한 선호 가교 사이트)에 대한 환경 설정을 표시하는 동안, 그들은 크게 무차별 방식으로 DNA 손상을 유도한다. 그러나, 공유 결합 서열 - 특이 적으로 DNA에 결합하는 삼중 - 형성 올리고 뉴클레오티드 (TFO)에 ICL 유도제를 연결함으로써방법은 타겟 DNA 손상이 달성 될 수있다. 여기서는 도구로 사용할 돌연변이 리포터 플라스미드의 부위 특이 ICL을 생성하는 공유 8 trimethylpsoralen (HMT) 랄렌 5 &#39;은 4&#39;- 히드 록시 메틸 4,5&#39;말단에 컨쥬 게이션 TFO를 사용 인간의 세포에서 HMGB1에 의해 복잡한 DNA 병변의 건축 변경, 처리 및 수리를 공부합니다. 우리는 실험 기술 리포터 플라스미드에 TFO 지시 ICLS을 준비하고, 염색질 면역 침전 분석법을 사용하여 휴대 맥락에서 TFO 지시 ICLS와 HMGB1의 연결을 심문에 대해 설명합니다. 또, HMGB1 의해 소라렌 가교 플라스미드 도입 superhelical 회전의 양을 측정함으로써 손상된 DNA의 특정 구조적 변형을 평가하기 위해 수퍼 코일 DNA의 분석을 설명한다. 이러한 기술은 TFO 지시 ICLS 또는 관심있는 세포주 다른 타겟 DNA 손상의 복구 처리에 관여하는 다른 단백질의 역할을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

TFO 지시 ICL의 형성은 인간 세포에서 ICL 처리에서의 구조적 단백질의 역할을 심문하는 데 사용되는 플라스미드 기반 분석을 위해 중요하다. 아가 로스 겔 전기 영동을 변성하면 TFO 지시 ICL 형성의 효율성을 결정하기위한 용이 한 방법이다. TFO 지시 ICLS 은닉 플라스미드는 비 - 가교 결합 된 제어 플라스미드 (도 1a, 레인 2)에 비교하여, 아가 로스 겔 매트릭스 (도 1a, 레인 3)을 통해 느린 이동성으로 이동한다. 레인 2, 3 (그림 1A)에서 밴드의 농도계 정량은 플라스미드 인구의 약 70 %가 그 플라스미드에 TFO 지시 ICL 형성을 나타내는, (검은 색 화살표로 식별) 둔화 이동성을 가진 젤을 통해 마이그레이션 알 수있다. 인간의 U2OS...

표적 DNA 손상은 DNA 손상제를 삼중 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)에 묶음으로써 달성할 수 있습니다. 변형된 TFO를 사용하여, DNA 손상 특이적 단백질 결합, 및 DNA 토폴로지 변형은 본원에 기술된 변형된 염색질 면역침전 분석 및 DNA 슈퍼코일링 분석의 활용에 의해 인간 세포에서 연구될 수 있다.

도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

수정된 크로마틴 면역침전 및 DNA 초나선 실험의 전반적인 목표는 인체 세포 내에서 화학요법제 또는 발암 물질에 의해 유도된 부위 특이적 DNA 손상에 대해 구조 단백질이 일으키는 결합 및 그에 따른 위상학적 변형을 연구하는 것입니다. 이 방법론을 통해 DNA 손상 및 복구에 관한 핵심 질문들을 다룸으로써 암 치료를 위한 새로운 약리학적 표적의 발견을 촉진할 수 있을 것입니다. 본 기술은 부위 특이적 DNA 손상을 직접 유도할 수 있게 하여, 인체 암과 관련된 결정적인 DNA 복구 과정의 평가를 용이하게 합니다.먼저, 형질전환 24시간 전에 항생제가 포함되지 않은 10% FBS 보충 DMEM을 사용하여 60 mm 디쉬당 400,000개의 포유류 세포를 분주합니다. 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 14 mL 라운드 바텀 튜브에 상온의 형질전환 시약 30 µL와 37 °C로 데운 1X 성장 배지 500 µL를 혼합합니다.두 번째 튜브에 1X 성장 배지 500 µL와 TFO-directed ICL-containing 플라스미드 2 µg을 혼합합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 혼합물 1과 혼합물 2를 합친 후, 피펫팅하여 완전히 섞어줍니다.그 후 용액을 상온에서 25~30분 동안 배양합니다. 다음으로, 따뜻한 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음, 트랜스펙션 혼합액을 한 방울씩 떨어뜨려 세포가 담긴 플레이트 전체에 용액이 고르게 분포되도록 첨가합니다.플레이트에 성장 배지 1 mL를 추가하여 최종 부피를 2 mL로 맞춥니다. 잘 혼합한 후, 배양 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 4시간 후, 배지를 10% FBS가 포함된 성장 배지 3 mL로 교체하고 16시간 동안 추가로 배양합니다.배양 후, 각 플레이트의 세포에 신선한 37% formaldehyde 80 µL를 첨가하고, 실온의 암소에서 10분 동안 배양합니다. 각 플레이트에 냉각된 glycine 300 µL를 첨가하여 formaldehyde 가교 결합을 중단시키고, 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 제거하고, 냉각된 PBS를 사용하여 플레이트를 2회 세척합니다.다음으로, 냉각된 PBS 1 mL를 첨가한 후, 샘플을 항상 얼음 위에 둔 상태에서 스크래퍼를 이용해 세포를 긁어 모아 얼음 위에 놓인 마이크로원심분리 튜브에 수집합니다. 13,400 ×g, 4 °C에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 준비합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 얼음 위에 둡니다.냉각된 Buffer A 1 mL를 사용하여 펠렛을 균질하게 재부유시키고, 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 이전과 동일한 방법으로 세포를 펠렛화합니다. 이제 냉각된 Buffer B 1 mL를 사용하여 펠렛을 균질하게 재부유시키고, 가끔씩 도립 혼합하며 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.그 다음 이전과 동일하게 세포를 펠렛화합니다. 차갑게 식힌 Buffer B 200 µL에 세포를 다시 부유시킨 후, micrococcal nuclease(MNase) 2 µL를 첨가하고 실온에서 10분 동안 반응시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음에 넣고 40 mM EDTA를 첨가하여 MNase 반응을 중단시킵니다.Micrococcal nuclease에 의한 소화 수준은 매우 중요합니다. 과도하게 소화되면 신호 손실이 발생할 수 있고, 불충분하게 소화되면 다량의 비특이적 배경 신호가 발생할 수 있기 때문입니다. 세포를 펠렛화한 후, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 첨가된 100 µL의 염색질 면역침전(chromatin immunoprecipitation) 또는 ChIP 버퍼에 펠렛을 재부유시킵니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 얇은 벽의 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.샘플을 워터배스 초음파 세척기에 띄워 20초 동안 초음파 처리한 후, 이어서 얼음 위에서 20초 동안 둡니다. 약 800에서 1,200 bp 크기의 단편을 생성하기 위해 이 초음파 처리 단계를 9회 반복합니다. 초음파 처리된 샘플 20 µL에 5 M sodium chloride 3 µL와 RNase A 1 µL를 첨가합니다. 튜브를 볼텍싱하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 다음, proteinase K 2 µL를 첨가하고 65 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 정제한 후, 1% agarose gel에서 전기영동을 수행하고 ethidium bromide로 시각화합니다. 미리 냉각시킨 3개의 실리콘 처리 튜브에 각각 lysate 30 µL와 프로테아제 억제제가 첨가된 냉각된 1X ChIP buffer 70 µL를 넣습니다.각 튜브에 1 µg의 anti-IgG, anti-histone H3 또는 anti-HMGB1 항체를 추가합니다. 저온실에서 계속 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 저온실에서 Protein G 비즈를 다시 현탁시킨 후, 각 반응 튜브에 비즈 4 µL를 추가하고 저온실에서 회전시키며 2~4시간 동안 더 배양합니다.튜브를 자석 랙에 놓아 비드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 1X ChIP 버퍼 200 µL를 펠렛에 첨가하고, 저온에서 5분 동안 회전시키며 세척합니다. 다음으로, 고염 1X ChIP 버퍼를 사용하여 추가 세척을 수행합니다.그런 다음, 160 µL의 용리 버퍼를 사용하여 펠릿을 재부유시키고, 37 °C에서 회전시키며 30분 동안 배양합니다. 비즈를 펠릿화하고, 상층액을 새 튜브에 수집합니다. 5 M 염화나트륨 6 µL와 단백질분해효소 K 2 µL를 첨가하고, 65 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 정제한 후, 관심 영역에 대한 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하고, ethidium bromide로 염색된 1% agarose 겔에서 생성물을 분리합니다. 사용 전, 미리 준비한 DNA 수선 합성 버퍼를 얼음 위에서 녹이고, 40 millimolar phosphocreatine과 2.5 micrograms의 creatine phosphokinase를 첨가합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 10X supercoiling 버퍼를 준비한 후, 10 microliter 반응 부피에서 1X supercoiling 버퍼와 함께 1 microliter의 vaccinia topoisomerase 1을 사용하여 300 nanograms의 supercoiled plasmid인 PCA FG1을 선형화합니다.이완된 플라스미드에 갓 해동한 HeLa 세포 추출물 25 µL와 DNA 합성 버퍼를 첨가합니다. 잘 섞은 후, 반응액에 vaccinia topoisomerase 1 1 µL를 첨가하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 1% SDS와 0.25 mg/mL proteinase K를 첨가하여 반응을 종료시키고, 65 °C에서 2시간 동안 배양합니다.1X TPE 버퍼를 사용하여 1% agarose 겔을 제작한 후, 반응액에 DNA-loading dye를 첨가하고 샘플을 겔에 최소 4레인 간격으로 로딩합니다. 토포이소머(topoisomer)를 분리하기 위해, 실온의 1X TBE에서 cm당 2V로 8~10시간 동안 1차 전기영동을 수행합니다. 3µg/mL의 chloroquine phosphate가 포함된 1X TBE 2L를 준비합니다.겔을 200 milliliters의 용액에 담근 후, 알루미늄 호일로 덮어 20분 동안 방치합니다. 2차원 전기영동을 수행하려면, 겔을 시계 방향으로 90도 회전시킨 후, 양성 및 음성 초나선(supercoil)을 분리하기 위해 chloroquine이 포함된 1X TBE에서 cm당 2 volts의 전압으로 4~6시간 동안 전기영동을 실시합니다. 전기영동 완충액과 겔 내의 chloroquine 함량은 매우 중요하며, 2차원 전기영동 시 매우 낮은 전압으로 겔을 수행하는 것 또한 양성과 음성 초나선을 분리하는 데 있어 매우 중요합니다.텍스트 프로토콜에 따라 겔을 염색 및 탈색한 후, 이미저를 사용하여 토포이소머(topoisomer)의 열분포를 시각화합니다. 이 겔에서 볼 수 있듯이, TFO 유도 ICL을 보유한 플라스미드의 약 79%는 교차결합되지 않은 대조군 플라스미드와 비교했을 때 아가로스 겔 매트릭스를 통해 더 느린 이동도로 이동합니다. 대조군 플라스미드 또는 TFO 유도 ICL을 포함하는 플라스미드를 트랜스펙션한 인간 U2OS 세포의 용해물(lysate)을 대상으로 ChIP 분석을 수행한 결과, anti-HMGB1 항체로 면역침전시켰을 때 대조 영역에 비해 P-ICL 영역에서 HMGB1의 농축이 나타납니다.siRNA 처리를 통해 세포에서 HMGB1을 고갈시켰을 때, P-ICL 특이적 농축이 감소하였습니다. 동일한 샘플을 anti-IgG 항체로 면역침강시켰을 때, PCR 증폭이 최소한으로 검출되었습니다. 마지막으로, 본 그림에서 2차원 아가로스 겔 전기영동은 HeLa 세포 추출물 내의 HMGB1에 의해 TFO 유도 ICL 함유 플라스미드가 음성 초나선 구조로 건축학적 변형이 일어남을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 정확하게 수행했을 때 약 5일 정도 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때 매우 중요한 점은 모든 세척 단계를 저온실에서 진행해야 한다는 것입니다. 실온에서 세척할 경우 배경 신호가 증가할 수 있기 때문입니다. 이 절차 이후에는 siRNA 매개 단백질 고갈 및 이어지는 돌연변이 스크리닝 분석과 같은 다른 방법들을 수행하여, 관심 단백질이 DNA 복구에 관여하는지와 같은 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.아니면, 이 과정에서 돌연변이 스펙트럼을 유의미하게 변화시킬까요? 이 기술은 단백질과 부위 특이적 DNA 손상 사이의 연관성을 연구하는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 구조 단백질이 표적 DNA 가교에 결합하는 연관성을 연구하는 방법과, 결과적으로 이러한 결합이 DNA의 위상 구조에 미치는 영향을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.에티듐 브로마이드(ethidium bromide)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 실험을 수행하는 동안에는 항상 적절한 보호 장구를 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

히 - C 방식은 염색질 상호 작용 (1) 편견, 게놈 차원의 식별이 가능합니다. 히 - C의 커플 근접 결합 및 대규모 병렬 시퀀싱합니다. 그 결과 데이터가 여러 스케일에서 게놈 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다 : 초기 결과는 같은 염색체 지역, 개방적이고 닫힌 염색질의 분리 및 megabase 규모의 염색질 구조와 같은 기능을 확인.

안녕하세요 - C : Genomes의 3 차원 구조를 공부하는 방법.

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DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

DNA 손상에 따라 인간 세포는 게놈의 무결성을 회복하기 위해 필수적인 수리 경로를 활성화합니다. 여기서, 우리는 DNA 복구 단백질을 검출하고, 그들의 공간 및 측두모집을 분석하고, DNA 손상의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 것을 돕는 수단으로 간접적인 면역 형광의 방법을 기술합니다.

면역형광에 의한 DNA 수리 단백질 상호작용의 시각화

이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.

엔도누블레스 기반 사이트 별 DNA 손상을 시각화하고 정량화

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

여기에서는 DNA 손상 부위에서 단백질 상호 작용을 검출하기 위한 간단하고 신속한 프로토콜을 제시합니다.

DNA 손상 부위의 단백질을 국소화하기 위한 Proximity Ligand Assay

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

당사는 네이티브 γH2A.X 염색질 면역침전(ChIP)을 통해 일반적인 취약 부위 파괴를 검출하는 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근법은 기존 γH2A.X ChIP 분석과 관련된 시간과 노동력을 크게 줄이면서 결과의 높은 재현성과 신뢰성을 유지합니다.

네이티브 γH2A에 의한 일반적인 취약한 부위 파손 캡처. X 치프

학습하세요 변형된 크로마틴 면역침전법과 DNA 초나선화 분석을 사용하여 인간 세포에서 특정 부위 DNA 손상에 대한 구조 단백질의 결합과 위상 변화를 연구하는 방법을. 이 기술은 암 치료를 위한 새로운 약리학적 표적 발견에 기여합니다.

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