도구 나선 왜곡, 사이트 별 DNA Interstrand 가교의 처리에 건축 단백질 HMGB1의 역할을 연구하는

변형된 염색질 면역침전 및 DNA 슈퍼코일링 실험의 전반적인 목표는 인간 세포에서 화학요법 또는 발암성 물질에 의해 유도된 부위 특이적 DNA 손상에 대한 건축 단백질에 의해 유도된 연관성 및 후속 토폴로지 변형을 연구하는 것입니다. 이 방법론을 통해 DNA 손상 및 복구에 대한 주요 질문을 해결할 수 있으며, 이를 통해 암 치료를 위한 새로운 약리학적 표적을 쉽게 발견할 수 있습니다. 당사의 기술을 통해 부위별 DNA 손상을 직접 지시할 수 있으며 인간 암과 관련된 중요한 DNA 복구 프로세스의 평가를 용이하게 할 수 있습니다.

우선, 형질주입 24시간 전에 항생제 없이 10% FBS가 보충된 DMEM에서 60mm 접시당 400, 000개의 포유류 세포를 플레이트화합니다. 하룻밤 동안 섭씨 37도, 5%의 이산화탄소에서 세포를 배양합니다. 14밀리리터의 둥근 바닥 튜브에 30마이크로리터의 실온 트랜스펙션제와 섭씨 37도로 가열된 500마이크로리터의 1X 성장 배지를 결합합니다.

두 번째 튜브에서 500마이크로리터의 1X 성장 배지에 2마이크로그램의 TFO 지향 ICL 함유 플라스미드를 결합합니다. 튜브를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 믹스 1과 믹스 2를 결합하고 위아래로 피펫을 사용하여 완전히 혼합합니다.

그런 다음 용액을 실온에서 25-30분 동안 배양합니다. 다음으로, 따뜻한 PBS를 사용하여 세포를 두 번 씻습니다. 그런 다음, transfection mix를 적방울 방향으로 첨가하여 용액을 세포 플레이트 전체에 고르게 분배합니다.

플레이트에 1ml의 성장 배지를 추가하고 최종 부피를 2ml로 가져옵니다. 잘 섞고 배양판을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 놓습니다. 4시간 후, 배지를 10% FBS가 함유된 3밀리리터의 성장 배지로 교체하고 추가로 16시간 동안 배양합니다.

배양 후 플레이트당 80마이크로리터의 신선한 37%포름알데히드를 세포에 추가하고 실온에서 10분 동안 암흑 속에서 배양합니다. 플레이트당 300마이크로리터의 냉각 글리신을 첨가하여 포름알데히드 가교를 담금질하고 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 매체를 제거하고 식힌 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척합니다.

다음으로, 1mm의 냉각된 PBS를 첨가한 후 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 긁어내어 세포를 수집하고 샘플을 항상 얼음 위에 보관합니다. 13, 400배 G, 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 준비합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다.

1ml의 냉각된 Buffer A를 사용하여 펠릿을 균일하게 다시 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 이전과 같이 세포를 펠릿화합니다. 이제 1ml의 냉각된 버퍼 B를 사용하여 펠릿을 균일하게 다시 현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 배양하면서 가끔 반전을 통해 혼합합니다.

그런 다음 이전과 같이 세포를 펠릿화합니다. 세포를 다시 현탁시킨 후, 200마이크로리터의 냉각된 버퍼 B에 2마이크로리터의 마이크로코커스 뉴클레아제 또는 MNase를 첨가하고 실온에서 10분 동안 반응을 배양합니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 놓고 40밀리몰 EDTA를 추가하여 MNase 반응을 중지합니다.

소구균 뉴클레아제에 의한 소화 수준은 매우 중요한데, 과소화는 신호 상실을 유발할 수 있는 반면, 과소화는 많은 비특이적 배경을 유발할 수 있기 때문입니다. 세포를 펠릿화한 후, 프로테아제 억제제 칵테일을 보충한 100마이크로리터의 크로마틴 면역침전 또는 ChIP 완충액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 얇은 벽의 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

샘플을 수조 초음파 발생기에 20초 동안 띄워 초음파 처리한 다음 얼음 위에서 20초 동안 초음파 처리합니다. 초음파 처리 단계를 9회 반복하여 약 800 대 1, 200 염기쌍 단편을 생성합니다. 초음파 처리 된 샘플 20 마이크로 리터에 5 몰 염화나트륨 3 마이크로 리터와 RNase A.Vortex 1 마이크로 리터를 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 proteinase K를 넣고 섭씨 65도에서 2시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 정제한 후 1% 아가로스 겔에서 실행하고 브롬화 에티듐으로 시각화합니다. 3개의 별도 사전 냉각된 실리콘 튜브에 30마이크로리터의 용해액과 70마이크로리터의 냉각된 1X ChIP 완충액을 첨가하고 프로테아제 억제제가 첨가됩니다.

각 튜브에 항-IgG, 항-히스톤 H3 또는 항-HMGB1 항체 1마이크로그램을 추가합니다. 차가운 방에서 밤새 지속적인 회전으로 배양하십시오. 차가운 방에서 Protein G beads를 다시 현탁시킨 후 각 반응 튜브에 4마이크로리터의 비드를 추가하고 2-4시간 동안 회전하면서 냉장실에서 배양합니다.

튜브를 마그네틱 랙에 올려 비드를 펠릿화하고 상층액을 제거합니다. 프로테아제 억제제 칵테일이 함유된 1X ChIP 완충액 200마이크로리터를 펠릿에 첨가하고 5분 동안 찬물에서 교대로 세척합니다. 다음으로, 고염도 1X ChIP 버퍼로 추가 세척을 수행합니다.

그런 다음 160마이크로리터의 용리 완충액을 사용하여 펠릿을 다시 현탁시키고 섭씨 37도에서 30분 동안 회전하면서 배양합니다. 비드를 펠렛으로 만들고 상층액을 새 튜브에 모으십시오. 6마이크로리터의 5몰 염화나트륨과 2마이크로리터의 proteinase K를 넣고 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다.

DNA를 정제한 후 텍스트 프로토콜에 따라 관심 영역에 프라이머 세트를 사용하여 PCR 반응을 수행하고 브롬화 에티듐으로 염색된 1% 아가로스 겔에서 산물을 분해합니다. 사용하기 전에 이전에 준비된 DNA 복구 합성 완충액을 얼음에서 해동하고 포스포크레아틴 40밀리몰과 크레아틴 포스포키나제 2.5마이크로그램을 첨가합니다. 10X 슈퍼코일링 버퍼를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 10마이크로리터 반응에서 1X 슈퍼코일링 버퍼와 함께 1마이크로리터의 vaccinia topoisomerase 1을 사용하여 300나노그램의 슈퍼코일 플라스미드, PCA FG1을 선형화합니다.

이완된 플라스미드에 갓 해동된 HeLa 세포 추출물 25마이크로리터와 DNA 합성 완충액을 추가합니다. 잘 섞은 다음 1 마이크로 리터의 vaccinia topoisomerase 1을 반응에 첨가하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양합니다. 1%SDS와 단백질 분해 효소 K 밀리리터당 0.25mg을 첨가하여 반응을 종료하고 섭씨 65도에서 2시간 동안 배양합니다.

1X TPE 버퍼가 있는 1% 아가로스 겔을 캐스팅한 후 반응에 DNA 로딩 염료를 추가하고 샘플을 최소 4개 레인 간격으로 겔에 직접 로드합니다. 지형이성질체를 분해하기 위해 실온에서 1차원 5차원에 대해 1X TBE에서 2볼트/센티미터로 8-10시간 동안 겔을 실행합니다. 클로로퀸 인산염 밀리리터당 3마이크로그램과 함께 1X TBE 2리터를 준비합니다.

젤을 알루미늄 호일로 덮인 용액 200ml에 20분 동안 담그십시오. 겔을 2차원으로 전기영동하려면 겔을 시계 방향으로 90도 돌리고 1X TBE를 함유한 클로로퀸에서 센티미터당 2볼트로 4-6시간 동안 실행하여 양극 및 음극 초코일을 분해합니다. 전기영동 완충액 및 겔 내의 클로로퀸의 양은 매우 중요할 뿐만 아니라 2차원의 매우 낮은 전압에서 겔을 실행하는 것은 양극 및 음극 초코일을 분리하는 데 매우 중요합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 겔을 염색하고 탈staining 한 후 이미저를 사용하여 지형이성질체의 열분포를 시각화합니다. 이 겔에서 볼 수 있듯이, TFO-directed ICL을 보유한 플라스미드의 약 79%는 비가교 결합 대조군 플라스미드와 비교할 때 아가로스 겔 매트릭스를 통해 더 느린 이동성으로 이동합니다. 대조군 플라스미드 또는 TFO 지시 ICL을 함유한 플라스미드로 transfection된 human U2OS 세포의 용해물에 대해 수행된 ChIP 분석은 anti-HMGB1 항체로 면역침전되었을 때 대조군 영역과 비교하여 P-ICL 영역에서 HMGB1의 농축을 보여줍니다.

siRNA 처리를 통해 세포에서 HMGB1이 고갈되었을 때 P-ICL 특이적 농축이 감소했습니다. 항-IgG 항체를 사용하여 동일한 샘플을 면역침전시켰을 때, 최소한의 PCR 증폭이 검출되었습니다. 마지막으로, 이 그림에서 2차원 아가로스 겔 전기영동은 HeLa 세포 추출물에서 HMGB1에 의한 음의 슈퍼코일링으로 TFO 지시 ICL 함유 플라스미드의 구조적 변형을 보여줍니다.

이 기술을 완전히 익히면 올바르게 수행할 경우 약 5일 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실온 세척은 배경 신호를 증가시킬 수 있으므로 모든 세탁은 추운 방에서 수행해야 한다는 것을 기억하는 것이 매우 중요합니다. 이 절차에 따라 siRNA 매개 단백질 고갈과 같은 다른 방법을 수행한 후 돌연변이 스크리닝 분석을 수행하여 관심 단백질이 DNA 복구에 관여합니까?

아니면 그 과정에서 돌연변이 스펙트럼을 크게 변경합니까? 이 기술은 단백질과 부위 특이적 DNA 손상 사이의 연관성을 연구하는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 DNA 가교를 표적으로 하는 아키텍처 단백질의 연관성을 연구하는 방법을 잘 알게 될 것이며, 이후에 이러한 연관성이 DNA의 토폴로지에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

브롬화 에티듐으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 실험을 수행하는 동안 항상 적절한 보호 장비를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.