Name: 마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 학습하세요 숯 한천 레사주린 분석법(CARA)을 활용한 마이코박테리아 중간처리량 반정량 분석 방법을. 이 기술은 결핵 신약 개발에서 복제 및 비복제 균주에 대한 화합물 활성을 신속하게 평가하여 살균제와 정균제를 구분하고 후속 CFU 분석을 위한 최적 조건을 식별하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 원고 및 화학 지원 J. 데이비드 워렌 (웨일 코넬 의과 대학)가 CARA을 개발하는 동안의 전문가 검토 크리스틴 번즈 - 황에 감사하고 있습니다. 이 작품은 번역 상 약에있는 빌과 멜린다 게이츠 재단, 애비 하워드 P. 밀스타인 프로그램의 TB 약 가속기 프로그램 및 NIH TB 연구 장치 (U19 AI111143)에 의해 지원되었다. 미생물학 및 면역학의 부서는 윌리엄 랜돌프 허스트 재단이 지원됩니다. SSK는 NIH 보조금 K08AI108799에 의해 지원되었다.

CARA 마이크로 1. 준비 <ol><li> 2 L의 삼각 플라스크에 0.2 % 글리세롤 및 0.4 %의 활성탄을 포함하는 미들 7H11 한천의 오토 클레이브를 900 ㎖, 또는 대안 적으로, 1 L의 유리 비이커에 450ml의. 플라스크 또는 비커에 큰 오토 클레이브 교반 막대를 포함합니다. 알루미늄 호일로 플라스크 또는 비커의 입구를 덮고 오토 클레이브 테이프를 유리에 부착합니다. </li><li> 현탁액에 목탄을 유지하기 위해 낮은 속도로 설정 자기 교반 플레이트 (약 55 ~ 65 °의 C)를 터치 쿨. </li><li> 자기 교반 플레이트가있는 바이오 안전성 후드에서 무균 이후의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 호일을 제거합니다. 100 ㎖ OADC 보충 추가 (OADC 보충 10 %로 사용되는 경우, 0.2 % 포도당, 0.5 % 알부민, 0.085 %의 NaCl, 0.0005 % 올레산 0.4 ㎎ / ㎖ 카탈라제의 생산량 최종 용지 농도)에 2 L의 삼각 플라스크에 또는 50 ml를 1 L 비이커에 OADC 및 혼합 계속합니다. </li><li> 삼각 플라스크를 사용하는 경우, 약 25-4을 부어멸균 시약 저수지에 7H11-OADC 숯의 0 ml의. 비커를 사용하는 경우, 시약 저장 용기를 사용할 필요가 없다. </li><li> 200 μL / 웰의 시약 저장 또는 커에서 7H11-OADC - 목탄으로 96 웰 마이크로 플레이트를 입력합니다. 한천 응고와 거품의 도입을 방지하기 위해 신속하게 작업 할 수 있습니다. 즉 진균 오염원이 될 수있는 바와 같이, 웰 고체 배지 외부 튀는 피한다. 멀티 채널 피펫을 이용하여 96- 웰 플레이트의 8 개의 행 (AH)에 7H11 OADC-숯의 전송에 대해 필터 (12)의 끝의 한 세트를 사용한다. 주 : 매체가 신속하게 굳은. 피펫 팁 막힘 방지하기 위해 자주 변경합니다. </li><li> 또한, 다수의 판을 준비하고 지원하기 위해 필터 팁과 함께 P1000 전자 멀티 채널 피펫을 사용하여 마이크로 플레이트 CARA을 붓는다. 참고 : 인해 마이크로 웰의 낮은 볼륨, CARA 마이크로의 한천이 쏟아져 분 이내에 굳은. </li><li> 개폐형 플라스틱 바에서 CARA 마이크로의 장소 스택GS는 건조 방지 할 수 있습니다. </li><li> 스토어 CARA 마이크로 4 ° C에서. </li></ol> 90 분석법을 2. 복제 설정 및 MIC 비 복제 <ol><li> M. 결핵, M.의 보비스의 BCG 접종 또는 M.는 OD 0.01-0.1의 580에 smegmatis 및 미들 7H9-ADN에서 중반 로그 단계 (OD 580 ~ 0.5)로 확장 (미들 7H9 0.2 % 글리세롤을 포함, 0.2 % 덱 스트로스 0.5 % 알부민, 및 0.085 %의 NaCl) 또는 7H9-OADC (미들 7H9 0.2 % 글리세롤 10 % OADC 보충 함유). </li><li> 세포 배양 플라스크에 문화를 서 20 ㎖ ~로 M. 결핵 및 M.의 우형 BCG 성장과 M. 폴리 프로필렌 둥근 바닥 (4 ml의 문화) 또는 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브 (10 ~ 20 ml의 문화)에서 진탕 smegmatis. 20 % O 2, 5 % CO 2, 37 ℃에서 병원성 마이코 박테리아 부화 및 M.은 20 % O 2로 37 ° C에서 smegmatis. </li><li> 최소한의-억제를 설정농도 (MIC 90) 복제 및 비 복제 조건을 (그림 2)에서 스타일의 실험. 참고 : 테스트 에이전트는 일반적으로 96 웰 마이크로 플레이트 당 각각 테스트 4,이 화합물을, 허용 중복 또는 quadruplicates으로 분석된다. 예를 들면, 96- 웰 플레이트에서, 하나의 시험 제제는 EH 행의 행의 다른 AD에서 분석 될 수있다. DMSO를 (비히클) 칼럼 1, 2이고, (12) 및 시험 제제 희석 시리즈 칼럼 11의 (높은 농도)을 컬럼 3 (최저 농도)에서 운영. MIC (90) 스타일 분석은 일반적으로 2 배 희석 시리즈를 사용합니다. 마이코 박테리아 14-16,18,24,25가 가능한 다수의 비 - 복제 모델이고 예시적인 목적으로, 우리는 비 복제 6,8,9의 다중 응력 모델을 사용한다. <ol><li> 복제 가능한 분석을 위해, 명확한 바닥, 조직 문화가 처리 된 96 웰 플레이트의 모든 웰 내로 OD 0.01 (580)에서 7H9-ADN 200 μl의 세포를 배포 할 수 있습니다. </li> &lt;리&gt; 비 복제 분석은 0.02 %의 틸록 사폴을 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어 비 복제 배지 (0.05 % KH2PO4, 0.05 % 황산 0.005 %, 페릭 암모늄 시트 레이트에 재현 탁 셀 0.0001 % ZnCl 2, 0.1 % NH4Cl를, 0.5 % BSA, 0.085 %의 NaCl, 0.02 %의 틸록 사폴 0.05 % 부티레이트, pH는) 2 N NaOH로 5.0으로 조정. <ol><li> 비 복제 매체에서 OD 0.1 (580)에 세포를 희석하고 0.5 mm의 최종 농도에 새로 제조 한 M 재고에서에 NaNO 2를 추가합니다. </li><li> 분명 바닥, 조직 문화가 처리 된 96 웰 플레이트의 모든 웰 내로 OD 0.1의 580에서 200 μl의 세포를 배포합니다. 참고 : DMSO의 100 배 재고 솔루션으로 화합물의 희석을 준비합니다. 따라서, 최종 농도에서 0.4-100 μg의 분자의 영향을 테스트하는 일반적인 MIC 판 / ml의 DMSO에 0.04-10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 필요로한다. </li></ol></li><li> 디의 2 μl를 추가행 AE로 시험 제 1의 lutions 행 EH으로 시험 제 2의 희석 2 μL. 철저하게 섞는다. </li><li> 열 1, 2, 12 (행 AH), 제어 우물에 2 μL 차량 제어 (보통 DMSO)를 추가합니다. 철저하게 섞는다. </li><li> 각 실험 들어, 0.004 1 μg의 / ㎖ (복제 분석) 및 / 또는 0.08 ~ 20 ㎍ / ㎖ (비 복제 분석)에서 리팜피신 적어도 한 양성 대조군을 포함한다. 주 : 0.1 내지 25 μg의 / ㎖에서 6- 브로 모 -1H- 인다 졸 -3- 아민 (9)의 사용은 비 복제 멀티 응력 모델 선택적 갖는 화합물에 나노 2 의존적 활성 권장된다. </li><li> 분석 복제를 위해 7 일 (M. 결핵 및 M.의 우형 BCG) 또는 48 시간 (M.가 smegmatis) 20 % O 2 5 % CO 2에서 37 ° C에서 마이크로 품어. 비 - 복제 멀티 응력 모델 (&lt;1 % O 2, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 7 일간 배양한다 마이크로EM&gt; M. 결핵 및 M.의 보비스 BCG). </li></ol></li></ol> CARA 마이크로 3. 예방 접종 <ol><li> 카라가 판독으로 사용됩니다되는 시점에서,주의 깊게 잘 50-75 μL로 설정된 P200 멀티 채널 피펫을 사용하여 MIC (90) 스타일 분석 플레이트의 내용을 재현 탁. 부드럽게 피펫 위아래로 적어도 5 ~ 10 배는 피펫 팁을 사용하여 원을 그리 잘 내용을 소용돌이 친다. </li><li> 전송 카라 마이크로에 대한 분석은 물론 내용의 10 μL. 분석 플레이트의 웰 내용물의 순서 카라 마이크로 플레이트의 웰 내용물의 순서와 일치하는지 확인. 환승시 튀는 것을 방지하고, 10 μL가 CARA 마이크로 웰의 중간에 발견되어 있는지 확인합니다. 카라 마이크로 플레이트에 흡수 10 μl를 확인합니다. 참고 : 이전 CARA 마이크로 플레이트에 세포를 안보에 필요하지 희석이 없습니다. </li><li> 플레이트 테이프와 마이크로 CARA의 귀속 스택과다음 개폐형 플라스틱 백에 넣습니다. 마이크로 플레이트 CARA을 품어 20 % O 2와 37 ° C (M.가 smegmatis) 또는 1 % O 2, 5 % CO 2 (M. 결핵 및 M.의 우형 BCG)에서. </li><li> M. 결핵 및 M.의 우형 BCG의 경우, 분석을 복제 : 7 일 동안 배양; M. 결핵 및 M.의 우형에 대한 BCG 비 복제 분석을, 10 일 동안 배양; M.가 smegmatis에 대한 분석을 복제 1-2 일 동안 배양; M.가 smegmatis에 대한 비 복제의 분석은, 2~3일 품어. 주 : 시간이 추정치와 다른 복제, 비 복제 및 스트레스 조건에 따라 변경 될 수있다. </li></ol> 4. CARA 마이크로 개발 <ol><li> 세균의 성장, 또는 더 큰, 거시적 식민지의 영화, 음 (차량) 제어 우물에서 볼 때 마이크로 카라을 개발합니다. 주 : 장기간 배양 한 후, CARA 마이크로 웰 자주건조 나타나고 우리는 멸균 PBS로 미리 습윤 아니라 내용을 권장합니다. 이것은 낮은 형광 또는 웰 - 투 - 웰 변동을 초래할 수 레사 주린 흡수기에서 숯불을 방지하는 역할을한다. </li><li> 멀티 채널 피펫 팁 (12) (P200)의 단일 세트를 사용하여 각 웰의 측면을 따라 멸균 PBS 40 μL 분주하고 PBS 한천 / 박테리아 microcolonies 상단에 걸쳐 분배 할 수있다. </li><li> 카라 5 밀리그램 레사 주린 (최종 0.01 %)과 PBS 중 5 % 트윈 80 50 mL의 혼합 시약을 개발 준비한다. 소용돌이와 살균 필터. 주 : PBS 중 10 % 트윈 80 1 (부피 / 부피의) 대안 CARA 현상 시약 1에서 액상 용액 레사 주린 상업적으로 혼합하여 제조 할 수있다. </li><li> 12 채널 피펫을 사용하여 CARA 마이크로의 각 웰에 새로 제조 CARA 개발 시약의 50 μl를 추가합니다. 록 플레이트 앞뒤로 몇 번 각 웰에 한천과 박테리아 매트에서 시약을 배포 할 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 접시를 놓고 전NA 다시 봉합 할 수있는 비닐 봉투 및 M. 적어도 30 분 smegmatis 및 결핵균 또는 M.의 우형의 BCG에 대한 45 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 차량 제어 우물이 첫 번째 시간 이내에 핑크를 설정하지 않을 경우, 플레이트가 다시 체포와 오랜 시간 동안 배양 할 수있다. </li><li> 형광을 판독하기 전에, 그 뚜껑을 제거하고 실온에서 15 분 동안 생물 안전성 후드에서 CARA 마이크로 플레이트를 배치했다. 바이오 안전성 캐비닛의 외부 BSL3의 분광 광도계를 사용하는 경우, 접시 위에 광학 품질 PCR 스티커를 부착하고 부드러운 종이 타월로 스티커 표면에 부드럽게 눌러 단단히 밀봉. </li><li> 590 nm에서 530 nm에서 여기 및 방출 읽을 상단을 통해 형광을 결정합니다. 그것은 빈 접시에 필요하지 않습니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 선형 스케일에 Y 축의 로그 스케일 (10)과 형광의 X 축상의 플롯 억제 농도. 분산을 사용하여곡선을 사용 플롯은 &quot;응답 변수 경사 (4 매개 변수) 대 억제제 로그인&quot;으로 적합. ± 표준 오차를 의미로 플롯 데이터 포인트. </li></ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+approaches+to+anti-infective+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fresh approaches to anti-infective therapies.</a> Sci. Transl. Medicine. 4 (140), 140-142 (2012).</li>
<li>Gomez, J. E., McKinney, J. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tuberculosis+persistence%2C+latency%2C+and+drug+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance.</a> Tuberculosis (Edinb). 84, 29-44 (2004).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305, 1622-1625 (2004).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> Lancet. , 497-500 (1944).</li>
<li>Bryk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+nonreplicating+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Selective killing of nonreplicating mycobacteria.</a> Cell Host Microbe. 3, 137-145 (2008).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsteroidal+anti-inflammatory+drug+sensitizes+Mycobacterium+tuberculosis+to+endogenous+and+exogenous+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nonsteroidal anti-inflammatory drug sensitizes Mycobacterium tuberculosis to endogenous and exogenous antimicrobials.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 16004-16011 (2012).</li>
<li>Gold, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+semi-quantitative+assay+to+discriminate+among+compounds+with+activity+against+replicating+or+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid, semi-quantitative assay to discriminate among compounds with activity against replicating or non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 6521-6538 (2015).</li>
<li>Gold, B., Warrier, T., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGold%2C+B+%22Mycobacteria+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Mycobacteria Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Parish, T., Roberts, D. 1285, Springer. 293-315 (2015).</li>
<li>Warrier, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Novel+Anti-mycobacterial+Compounds+by+Screening+a+Pharmaceutical+Small-Molecule+Library+against+Nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Novel Anti-mycobacterial Compounds by Screening a Pharmaceutical Small-Molecule Library against Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Infect. Dis. , 580-585 (2015).</li>
<li>Zheng, P., et al. Synthetic Calanolides with Bactericidal Activity Against Replicating and Nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZheng%2C+P+%22J.+Med.+Chem%22">J. Med. Chem</a>. Chem, J. .M. ed. , (2014).</li>
<li>Darby, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+screen+for+inhibitors+of+pH+homeostasis+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole cell screen for inhibitors of pH homeostasis in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 8, e68942(2013).</li>
<li>Darby, C. M., Nathan, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+of+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis+by+8-hydroxyquinoline%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Killing of non-replicating Mycobacterium tuberculosis by 8-hydroxyquinoline.</a> J. Antimicrob. Chemother. 65, 1424-1427 (2010).</li>
<li>de Carvalho, L. P., Darby, C. M., Rhee, K., Nathan, C. Nitazoxanide Disrupts Membrane Potential and Intrabacterial pH Homeostasis of Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3ade+Carvalho%2C+LP+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22">ACS Med. Chem. Lett</a>. 2, 849-854 (2011).</li>
<li>Xie, Z., Siddiqi, N., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antibiotic+susceptibilities+of+starved+Mycobacterium+tuberculosis+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Differential antibiotic susceptibilities of starved Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4778-4780 (2005).</li>
<li>Grant, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis+using+a+carbon+starvation+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of nonreplicating Mycobacterium tuberculosis using a carbon starvation model.</a> ACS Chem. Biol. 8, 2224-2234 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptomycin-starved+Mycobacterium+tuberculosis+18b%2C+a+drug+discovery+tool+for+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Streptomycin-starved Mycobacterium tuberculosis 18b, a drug discovery tool for latent tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 56, 5782-5789 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem. Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Cho, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-oxygen-recovery+assay+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compounds against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 51, 1380-1385 (2007).</li>
<li>Franzblau, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+methods+used+for+the+evaluation+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of methods used for the evaluation of compounds against Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 453-488 (2012).</li>
<li>Rebollo-Lopez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+50+new%2C+drug-like+compounds+and+their+computational+target+predictions+for+open+source+anti-tubercular+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Release of 50 new, drug-like compounds and their computational target predictions for open source anti-tubercular drug discovery.</a> PLoS One. 10, e0142293(2015).</li>
<li>Tasneen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+the+nitroimidazoles+PA-824+and+TBA-354+to+the+activity+of+novel+regimens+in+murine+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Contribution of the nitroimidazoles PA-824 and TBA-354 to the activity of novel regimens in murine models of tuberculosis.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 59, 129-135 (2015).</li>
<li>Grosset, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+clofazimine+activity+in+a+second-line+regimen+for+tuberculosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Assessment of clofazimine activity in a second-line regimen for tuberculosis in mice.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 188, 608-612 (2013).</li>
<li>Shiloh, M. U., Ruan, J., Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+bacterial+survival+and+phagocyte+function+with+a+fluorescence-based+microplate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay.</a> Infect. Immun. 65, 3193-3198 (1997).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+small+molecule+with+activity+against+drug-resistant+and+persistent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a small molecule with activity against drug-resistant and persistent tuberculosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E2510-E2517 (2013).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect. Immun. 64, 2062-2069 (1996).</li>
<li>Barry, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarry%2C+AL+%22Methods+for+determining+bactericidal+activity+of+antimicrobial+agents%3A+approved+guideline%22">Methods for determining bactericidal activity of antimicrobial agents: approved guideline</a>. 19, National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1999).</li>
</ol>

공개 관심의 충돌이 없습니다.

카라는 원래 비 복제 또는 이중 활성 분자 (7) 진행의 병목 현상을 완화하기 위해 개발되었다. 카라 차 심사 안타 CFU 분석 (그림 1)의 농도 - 반응 확인 사이의 중간 단계 역할을합니다. 하나의 CARA 판 살아남은 박테리아를 열거하는 데 사용되는 직렬 희석을 준비하는 데 필요한 다양한 마이크로 타이 터 플레이트 및 한천 페트리 접시를 대체 할 수 있기 때문에, CARA 빠르게 분자의 활동을 평가하고 화합물의 농도를 포함하여 한 번에 여러 변수를 테스트하는 간단한 방법을 제공합니다 상기 화합물에 대한 노출 시간. CFU 분석에서, 종종 10 6 -fold까지 범위를 연속 희석뿐만 아니라, 한천 플레이트는 일반적으로 추가 ~ 800 배 (트라이 스타일의 페트리 접시에 8 ㎖의 상에 10 μL)에 의해 분자를 희석. 활성 화합물에 대한 우리의 두 단계, 멀티 스트레스 스크리닝 분석 M. TU 비는 복제berculosis는 분석의 비 - 복제 단계의 화합물에 존재하는 하나의 1/5 가지 분석 6-9 (복제) 상에 원래의 농도로 존재하며, 즉, 5 배의 이월 계수를 갖는다. 카라 완화 할 휴대 오버 효과 활성탄으로 작은 분자를 이온 봉쇄에 의해. 결핵 약물 임상 후보의 대부분은 7 스트렙토 마이신 아미노 글리코 사이드를 제외하고, 신속하고 완전히 활성탄 귀속. CFU 분석에 대한 한천 플레이트에서 활성탄의 포함에 의해 박테리아 성장 억제, 또는 박테리아 명을 방지 실시 오버 TMC207와 PA-824 7,21,22. 따라서, 세균 한천에서 활성탄을 혼입에 의해, 카라 세포 및 시험 제제의 희석액에 의존하지 않는다. 카라는 복제 활성 및 비 복제 활성 성분의 살균 효과의 정균 또는 살균에 미치는 영향을 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. g에서eneral, 카라 표준 MIC 90 분석법 병렬로 사용된다. 카라의 예측 능력은 MIC (90)와 CARA 결과 (그림 2, 표 1) 비교에서 온다. 항 미코 박테리아 제를 연구하는 데 사용하는 경우, 카라 정확하게 정균 (도 4b), 비 - 복제 살균제 (도 4C), 또는 이중 활성 (도 4D)를 복제, 살균제 (도 4a)를 복제하는 활성을 예측할 수있다. 카라는 용량과 시간에 걸쳐 화합물의 활동의 간단한 평가를 허용한다. CFU 분석은 단독 투여 량 및 시간의 넓은 범위의 화합물의 활성을 평가하기위한 노력과 재료가 많이 필요하지만 카라 결과에게 조건의 범위를 좁힐 때, 태스크 (화합물 명백히 활성 인도 5 관리된다 ). 카라는의 작용을 공부 유틸리티를 가지고 있지만마이코 박테리아에 NTI-감염 제는 분석은 한계가있다. 카라는 좁은 다이나믹 레인지 (2-3 로그 10)가 하나 이상 2 (10) 로그 (3) 세균 죽이되지 않을 수 있습니다 예상되는 조건에 대해 적절하지 않을 수 있습니다. CARA 예측은 이러한 CFU 분석 등의 세균 숫자를 열거하는보다 엄격한하고 정확한 방법을 사용하여 더 많은 연구를 필요로한다. 이러한 PAS 일부 항 감염 제의 후 항생제 효과는 결핵균 7 복제에 대해 살균 및 정균 활성을 갖는 화합물을 구별하는 수단으로 예측 카라 혼동 할 수있다. 카라의 품질을 개선하기 위해 두 가지 권장 사항이 있습니다. 체적 정확성을 유지하고 마이크로 웰의 외부 튀는을 피하면서 첫째, 하나는, 마이크로 빠르게 한천 응고 전에 CARA을 부어해야합니다. 에 관계없이 필요한 접시의 수, 우리는 m를 유지하는 데 도움 매체의 0.5 ~ 1 L의 배치를 만드는 것이 좋습니다플레이트를 부어하는데 필요한 시간에 해당하는 기간 동안 액체 형태 edium. 부분적으로 막힌 팁을 사용하는 것을 피한다 매체와 마이크로 작성하는 동안 자주 팁을 변경. 둘째, 하나는 복제 사이에 형광 인공적인 변동성을 최소화해야합니다. 마이코 박테리아 microcolonies는 이러한 결핵균과 같은 병원성 마이코 박테리아에 대한 특히, 종종 비정상적으로 성장한다. 예를 들어, 한천 표면에 성장 microcolonies은 크기, 형상, 높이가 다를 수 있고, 또는 마이크로 웰의 내벽까지 연장 될 수있다. 하나의 문제는 현상 시약과 균일 모든 세균을 포함한다. 또 다른 장애물은 37 ° C에서 장기간 배양 한 후, CARA 마이크로의 고체 세균 매체가 개발 시약을 흡수에 건조하고 경향이 될 수 있다는 것이다. 활성탄은 결합 레사 주린 형광 7 급랭 수 있기 때문에 현상액 레사 주린 흡수 건조 우물 활성 charcoa 잘 - 투 - 웰 변동이있을 수있다리터 담금질 레사 주린 형광. 개발 시약은 동일하게 모든 마이코 박테리아 식민지를 도달하고, 레사 주린은 활성탄보다 안전하게 유지 - 사전 습윤 즉시 개발 시약을 추가하기 전에 PBS 모든 CARA 마이크로 웰의 표면은 이러한 문제를 모두 완화합니다. 카라는 식별하고, 또는 다른 세균 종에 대한 중간 처리량 약물 발견 분석에서 마이코 박테리아 돌연변이의 표현형의 특성에 응용 프로그램을 가질 수있다.

결핵균, 결핵의 병인 에이전트, 항생제 박멸에 반응하는 잠재 상태의 호스트에서 살아남을 수 있습니다. 감염시 결핵균의 표현형 (비 유전자) 저항 비 복제 바실러스 1,2- 집단에 부분적으로 기인 할 것으로 여겨진다. 표현형 약물 내성을 표시하는 클래스 I 영속 약물에 민감한 세포 3,4의 큰 집단 사이에 드문 확률 적 메커니즘을 통해 발생한다. 클래스 II 영속 감염 중 발생하는 미세 환경에서 외부 응력을 포함하여 호스트 면역 요인에 의해 비 복제를 렌더링됩니다. 우리는 최근에 클래스 II의 시험 관내 모델을 개발 비 복제 활성화 된 대 식세포와 육아종에서 결핵균에 직면 조건을 모방 지속성을. 클래스 II 지속성 멀티 응력 모델은이 조건을 포함하는 이러한 지방산 탄소원 완전히 HAL 느린 성장이러한 약산성 (PH 5.0), 저산소증 (1 % O 2) 산화 질소 및 기타 반응성 질소 중간체 5-9 같은 t 성장. 비 복제의이 멀티 스트레스 모델을 사용하는 대규모 스크리닝 및 기타 클래스 II 비 복제 모델은 그 활동이 아닌 복제 상태 5-7,9-18에 관한 것이다 다양한 분자를 산출했다. 같은 비 복제 스크린은 또한, 복제 모두 비 복제 균에 대해 활성을 갖는 분자의 범주를 밝혀 &quot;이중 활성&quot;7,10,12,19,20 불린다. 히트 - 투 - 리드 단계에서 항균 약물의 발견은 히트 확장, 예비 약리학 적 특성, 대상 식별 및 예비 생체 효능 연구를위한 리드를 선택하는 후보 분자의 광범위한 특성을 수반한다. 초기 단계로, 항 감염 제는 승, 경우 살균을 행동의 자신의 정균 또는 살균 메커니즘에 의해 분류된다hether 세균 명씩은 시간 및 / 또는 농도 의존적이다. 식민지 형성 단위 (CFU) 분석은 이러한 문제를 해결하기 위해 고전, 금 표준 방법입니다. CFU 분석에서, 박테리아 분취가 제거 직렬로 희석 한 후, 시험 제에 노출되며, 희석 분취 고체 세균 배지에 도포하고 생존 한 세포의 성장을 허용하기 위해 배양된다. 마지막으로, 세균 콜로니를 열거한다. CFU 분석은 생존 식민지를 열거 세포와 한천 페트리 접시를 희석 마이크로 타이 터 플레이트의 많은 수를 필요로한다. 느린 성장 마이코 박테리아의 CFU 분석은 식민지 판에 표시를 위해 약 3 주 필요 그들의 느린 생성 시간 (18 ~ 24 시간),에 의해 방해된다. 또한, 인큐베이터 공간은 종종 전문 바이오 안전성 수준-3 시설에서 제한된다. 복잡하지만, CFU 분석은 mycobacter에 비 - 복제 및 이중 활성 분자의 영향을 특성화 금 표준아이오와. 비 복제 분석은 세포 생존 6-8을 평가하기 위해 분석을 복제 결합되어 많은 높은 위양성의 요금이 적용됩니다. 예를 들어, 결핵균 복제에 대한 강력한 활성을 가진 화합물 (a &quot;활성 복제&quot;) 비 복제 분석하는 동안 죽 실패 할 수 있습니다, 그러나 아직도의 비 복제 단계에서 이월 덕분에 죽일 수 복제 ( &quot;조건을 복제하는&quot;)를 지원하는 조건 하에서 수행되는 분석의 복구 단계로 분석. 화합물은 더 이상 수행 활동이 아닌 복제, 또는 듀얼를 복제 여부 어려운 구별 할 수있게, 이중 활성 분자의 분석을 복잡하게한다. 상술 한 문제를 해결하기 위해, 우리는 M.의 tubercul으로 마이코 박테리아 종의 급속한, 세미 양적 열거에 대한 ssay (CARA)를 esazurin을 c harcoal 가르 연구 개발OSIS, M. 보비스 BCG, 그리고 M.는 smegmatis 7 (그림 1, 2). 시험관 내에서 완충 용액에 활성탄 급속 7 결핵을 치료하기 위해 사용되는 표준 약물 대부분 담즙산이. 활성화 분석법 마이크로부터 다시 수행 할 수있다 화합물을 결합 마이크로 CARA 숯, 그리고 CARA의이 기능은 직렬 7,21,22을 열거 형 사전 분석도 내용을 희석 할 필요가 없습니다. 마이크로 CARA의 한천 표면 microcolonies 마이코 박테리아의 수는 레사 주린의 첨가에 의해 추정되며, 그 환원 형, 레조 루핀 (resorufin) 청색 염료, 그 형광 광도법 (23)에 의해 측정된다 핑크 분자이다. M.가 smegmatis 1-2 일 같은 M. 결핵 및 M.의 보비스의 BCG 느린 성장 마이코 박테리아 7-10 일 동안 배양 마이크로 CARA. 카라는 ~ 2-3 로그 (10) diffe의 좁은 다이나믹 레인지를 가지고CFU에서 알수 있습니다. 대신 CFU 분석에 사용될 때, 단일 카라 마이크로 약 도금에 사용되는 희석액 120 트라이 스타일 아가 플레이트에 사용되는 다섯 96- 웰 판을 대체한다. CARA 데이터의 해석은 더 힘든 CFU 기반 분석을에서 테스트 할 수있는 배양 시간 및 화합물 농도를 결정함으로써 후속 연구를 안내하는 데 도움이됩니다.

<table><tbody><tr><td>미들브룩 7H9</td><td>벡턴 디킨슨</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>미들브룩 7H11</td><td>벡턴 디킨슨</td><td>298810</td><td></td></tr><tr><td>미들브룩 OADC</td><td>벡턴 디킨슨</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>BSA, 히트 쇼</td>크 <td>로슈</td><td>3118958001</td><td></td></tr><tr><td>활성탄</td><td>시그마</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Dulbecco의 Ca2+ 및 Mg2+ free</td><td>Life Technologies / Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>트윈 80</td><td>Sigma</td><td>P8074</td><td></td></tr><tr><td>tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨</td><td>Sigma</td><td>2252</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>6-bromo-1H-indazol-3-amine</td><td>Alfa Aesar</td><td>H34095</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 모노베이직&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이트, 헵타하이드레이트&nbsp;</td><td>시그마</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>구연산철 암모늄&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>황산아연, 헵타하이드레이트</td><td>Sigma</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄&nbsp;</td><td>시그마</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>부티르산, 액체</td><td>시그마</td><td>B103500</td><td></td></tr><tr><td>레사주린 분말</td><td>시그마</td><td>R7017</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨&nbsp;</td><td>J.T. 베이커</td><td>4058-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>준비된 레사주린 용액&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1100</td><td></td></tr><tr><td>PCR 스티커</td><td>Denville</td><td>B1212-5</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>분자 장치</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>96-well, 조직 배양 처리된 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장소</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89094-678</td><td></td></tr><tr><td>재봉투 가능한 비닐 봉투</td><td>VWR&nbsp;</td><td>395-94602</td><td></td></tr><tr><td>14 ml 폴리프로필렌 라운드-바텀 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352059</tr><tr><td>50ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>75cm2 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>투명하고 평평한 바닥 조직 배양 처리된 96웰 마이크로플레이트</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 for OS X</td><td>GraphPad</td><td>http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td><td></td></tr></tbody></table>

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

발견 결핵 (TB)의 치료 기간을 단축 항 감염 제를 진행 시급하다. 결핵균, TB의 병인 에이전트 인한 표현형 약제 내성을 나타내는 균의 존재를 신속하고 지속적인 요법으로 난치성이다. 는 C harcoal 갈치가 ssay (CARA)를 esazurin r에하는 복제 및 M. 결핵 비 복제에 대한 높은 처리량 검사 캠페인에 의해 발견 활성 분자를 특성화하는 도구로 개발되었다. 세균 한천 배지에서 활성탄 포함될 화합물 이월의 영향을 완화하는 것을 돕고, CARA에 마이크로 스폿 팅 전에 세포를 미리 희석 할 필요가 없다. 37 ° C에서 7~10일 잠복기 후에, 카라 마이크로 웰의 표면 상에 성장하는 마이코 박테리아 microcolonies하여 레사 주린의 감소는 반 정량적 ASSE 허용형광 측정을 통해 세균 수의 ssment. 카라는 약 박테리아의 숫자에서 2-3 로그 (10)의 차이를 감지하고 ≥99 % 세균 명 (MBC ≥99)에 이르는 최소 살균 농도를 예측한다. 카라는 분자가 복제 간균, 비 복제, 또는 두 가지 모두에 활성 상태인지 여부를 결정하는 데 도움이됩니다. 카라를 사용하여 파일럿 실험은 테스트 에이전트와 화합물 노출 시간의 농도가 집락 형성 단위 (CFU) 분석에 의해 추가로 평가해야하는의 식별을 용이하게한다. 복제 활성제는 살균 또는 정균 경우 또한, 카라 예측할 수있다.

예상 CARA 결과는도 2에 기재된 표 1에 요약되어있다. 세포를 복제를 들어, 카라 표준 MIC 90 분석법 병렬로 실행되며, 비 - 복제 검정 들면 카라 연장선 상에 결합되는 적응 MIC 90 시험과 병렬로 실행된다. 배경 레벨 이상으로 상승하는 CARA 형광 장애가 발생 시험 약제의 농도는 카라-MBC ≥99 (도 3a)이다. 은 &quot;≥99&quot;첨자는 CARA-MBC는 ≥2 로그 (10) 박테리아 명 (≥99 % 킬)을 발생시킨다 테스트 에이전트의 예상 농도를 제공하고 있음을 나타냅니다. 액체 배지 MIC (90) 분석은 살균 및 정균 활성을 구별 할 수없는,이 구별은 CFU 분석에 의해 해결되어야한다. 으로컨벤션, 느린 성장 마이코 박테리아에 대한 정균 활동에서 살균을 구분하는 임계 값은 약 칠일 7,26 이상 2 ~ 3 로그 10 명이다. 카라의 동적 범위는 2-3 로그 10 명이므로, 카라 살균 또는 정균 활성의 추정치를 제공 할 수있다. 카라는 쉽게 인해 배경 수준 CARA 형광을 감소 이들 화합물의 실패 (그림 2)에 세균과 같은 일부 복제 활성을 나타냅니다. 그러나, 결핵균 복제에 대한 정균 활성을 갖는 어떤 화합물들은 심지어 화합물 이월의 부재 회복기 동안 세균의 재성장을 억제 계속 즉, 강력한 후 항생제 효과를 갖는다. 이 효과는 카라 분석에서 인식하기 어려울 수있다. 그들은 &quot;정적 창&quot;을 표시하는 경우 화합물은 오른쪽 betwee에&gt; 4 배의 변화로 정의, 후 항생제 효과를 발휘 의심되는n은 MIC 및 CARA 곡선 (그림 3b). 정적 창은 결핵균을 복제에 대한 활성 분자 대신 살균의 세균이 될 수 있음을 나타냅니다. 일부 경우에서, 고정 윈도우는 카라 형광 (도 3C 및 3D)에 대한 확장 된 Y 축 검사 후에 명백하다. CARA 및 MIC (90)의 데이터는 일반적으로 함께 (그림 4) 플롯됩니다. MIC (90)에 의해 테스트 CARA replicating- 비 복제 활성 분자 대표 데이터는도 4에 도시되어있다. 분자 4 대 활동 수업이 있습니다 : 1) 살균 복제 (그림 4a, 이소니아지드와 시연이); 2) 복제 정균 (리네 졸리 드,도 4b)으로 증명; 3) 비 복제 살균을 (oxyphenbutazone,도 4c)와 함께 보여; 그리고, 4) 담당자(PA-824,도 4D로 입증) licating 활동 (정균 또는 살균) 및 비 복제 살균. 중요한 것은,도 4a 및도 이소니아지드 및 리네 졸리가 MIC (90) 분석에 의해 비 복제 세균에 대한 활성을 가지고있는 것 같습니다 동안 CARA들이 시험이 아닌 복제 조건 하에서 비활성 제안을 입증 4b는. (도 5a - D) 리팜피신의 농도 증가에 노출 M. smegmatis를 복제, 분자의 시간과 농도 의존적 영향을 예측에 CARA의 유용성을 테스트하고, 1-24 시간 사이에 여러 번, 분취이 발견되었다 CARA 판 상. 이러한 데이터는 리팜피신은 빠르면 1 시간 (그림 5a)와 같은 영향을 미치는 3과 24 시간 (도 5B-D) 사이에 증가하고 살균 작용을 표시 지적하고, 2 ~ 10 μg의 / ㎖에서 ≥2-3 로그 (10) 사망4 시간 (그림 5D). 유사한 실험은 차량 제어 9 약물 농도 quadruplicates 테스트, 4 시점에서 표준 기반 CFU 분석에 의해 금지 될 것이다. 따라서, 카라 분자의 활성 프로파일을 식별하는 매체 처리량 신속한 메커니즘으로 신약 개발에 중요한 역할을 갖는다. CARA의 예측은 엄격하게 표준 CFU 분석을 사용하여 평가되어야한다. CFU 분석을위한 배양 접시에 0.4 % 활성탄 첨가 CARA 데이터에 대한 상관 관계를 개선 할 수 있으며, 보정의 크기는 일반적으로 화합물의 효능 (21, 22)에 비례 정확한 CFU 카운트 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig1.jpg" /> 그림 1 : CARA는 신약 개발의 예측 도구입니다. 이 그림은 같은 CARA의 유틸리티를 요약약물 검사 (단일 지점 검사, 체리 따기, 그리고 용량 - 반응 시험 법)과 시간이 많이 소요 히트에 리드 분석 (CFU 분석 및 목표 식별) 사이의 중간 단계. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig2.jpg" /> 그림 2 : 예상 결과와 국물의 MIC (90) 분석 및 CARA의 도식. 모두 MIC 90 CARA 결과는 8 가능한 활동을 위해 제공됩니다. 색상 코딩 MIC 90 마이크로 웰을위한은 (더 성장), 갈색 (성장) 흰색이며, CARA에 대한 마이크로 플레이트는 (형광), 핑크 (레조 루핀 (resorufin) 형광) 블랙 없다. 데이터는 가상이다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig3.jpg" /> 그림 3 : CARA의 용어 및 정의 전문. 카라 형광의 배경 수준에 기인하는 분자의 최소 살균 농도는 카라-MBC ≥99있다 (a). 복제 조건 하에서, MIC (90)의 오른쪽에 CARA-MBC ≥99의 ≥4 배 시프트는 종종 세균 활동을 표시하고 &quot;고정 창&quot;(b)라고한다. 강력한 후 항생제 효과 분자를 들어, 정적 창 관찰 (c) 및 필요하기 어려울 수 있습니다Y 축 (CARA 형광)의 확장 (d)에 시각화합니다. 데이터는 가상이다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig4.jpg" /> 그림 4 : 예시 MIC 90 CARA는 선택 화합물에 대해 발생합니다. MIC 90 (적색) 및 CARA (블루)에 대한 데이터는 (a) 이소니아지드 (INH), (b) 리네 졸리 드, (c) oxyphenbutazone 및 (d) PA-824에 대해 입증된다. 야생형 결핵균 H37Rv 표준 복제 상태 또는 비 - 복제 7-9의 멀티 스트레스 모델에서 7 일간 화합물에 노출시켰다.<html> 그림 2와 같이 MIC (90) 분석 및 CARA 실시 하였다. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54690/54690fig5.jpg" /> 그림 5 : 용량 -와 리팜피신의 시간에 따른 활동. 비 - 병원성, 급성장 M. smegmatis가 복제 조건으로 분취 하에서 리팜피신의 증가하는 농도에 노출은 CARA 채취 된 1 (a), 3 (b), 6 (c) 및 24의 (d) 시간. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7].COM / 파일 / ftp_upload / 54690 / 54690fig5large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54690/54690tbl1.jpg" /> 표 1 : 그림 2의 예상 결과의 요약. [골드 등의 등의 허가 적응., 항균제와 화학 요법 2015 년 7] <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54690/54690tbl1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

c harcoal agar resazurin assay(CARA)는 복제, 비복제 또는 둘 다인 마이코박테리아에 대한 테스트 에이전트의 활성을 평가하기 위한 반정량, 중간 처리량 방법입니다. CARA를 사용하면 시간 및 농도에 따른 활성을 신속하게 평가할 수 있으며 CFU(Colony Forming Unit) 분석을 통해 추적할 매개변수를 식별할 수 있습니다.

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

CARA의 전반적인 목표는 복제 중인 마이코박테리아와 비복제 마이코박테리아에 대한 화합물의 활성을 중간 처리량(medium-throughput)의 반정량적 방식으로 평가하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 CFU 대체법으로서 CARA를 통해 화합물의 용량 및 시간 의존성을 신속하게 테스트할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 화합물이 복제 중인 박테리아에 대해 정균적인지 또는 살균적인지, 그리고 비복제 박테리아에 대해 살균적인지를 판단하는 것과 같이 결핵 치료제 개발 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.본 방법의 시연은 저희 연구실의 연구원인 Julia Roberts가 진행하겠습니다. 1L 유리 비커에 물 450 milliliters를 넣거나, 2L 삼각 플라스크에 물 900 milliliters를 넣으십시오. 비커 또는 플라스크에 오토클레이브 멸균 가능한 마그네틱 스터바를 넣으십시오.다음으로, Middlebrook 7H11 분말, 최종 농도 0.4%의 활성탄, 그리고 최종 농도 0.2%가 되도록 50% glycerol 용액을 첨가합니다. 플라스크나 비커의 입구를 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이브 테이프로 유리에 고정합니다. 배지를 오토클레이브 처리한 후, 활성탄이 부유 상태를 유지하도록 저속으로 설정된 마그네틱 교반기 위에서 약 55에서 65°C까지 냉각합니다.마그네틱 교반기가 설치된 생물안전 작업대 내에서 무균적으로 작업하며, 배지에서 호일을 제거하고 2L 플라스크 또는 1L 비커에 OADC 보충제를 각각 100mL 또는 50mL 첨가한 후 계속 혼합합니다. 8채널 또는 12채널 필터 팁이 장착된 멀티채널 피펫을 사용하여, 시약 리저버 또는 비커에서 7H11-OADC-charcoal 배지를 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 200µL씩 분주합니다. 이때 한천의 응고와 기포 형성을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오. CARA 마이크로플레이트 묶음을 건조 방지를 위해 밀봉 가능한 플라스틱 백에 넣어 4°C에서 보관하십시오.Middlebrook 7H9-ADN 또는 7H9-OADC가 각각 4 mL 또는 20 mL 들어 있는 폴리프로필렌 라운드 바텀 또는 원추형 원심분리관에 OD580 0.01에서 0.1의 M.smegmatis를 접종합니다. M.smegmatis 배양액을 37 °C, 20% O2 조건에서 진탕 배양하여 로그 성장기 중간 단계 또는 OD580 약 0.5까지 증식시킵니다. 복제 및 비복제 조건에서 최소 억제 농도 방식의 실험을 설정하려면, OD580 0.01의 7H9-ADN 내 세포 200 µL를 투명 바닥의 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트의 모든 웰에 분주합니다.비복제 분석의 경우, 0.02% tyloxapol을 포함하는 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척하십시오. 그 다음 비복제 배지를 사용하여 세포를 재현탁하십시오. 비복제 배지를 사용하여 세포를 OD580 0.1이 되도록 희석하고, 새로 조제한 1 M 스톡 용액으로부터 최종 농도가 0.5~5 mM이 되도록 질산나트륨을 첨가하십시오.OD580가 0.1인 세포 200 µL를 투명 바닥의 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 테스트 시약을 준비한 후, A행부터 E행까지는 테스트 시약 1을 2 µL씩 첨가하고, E행부터 H행까지는 테스트 시약 2를 2 µL씩 첨가한 뒤 충분히 혼합합니다. 분석 반복을 위해, M.smegmatis 마이크로플레이트를 37 °C, 20% O2 및 5% CO2 조건에서 1~48시간 동안 배양합니다.CARA를 리드아웃(read-out)으로 사용할 시점에, 50~75 µL로 설정된 p200 멀티채널 피펫을 사용하여 MIC90 스타일 분석 플레이트의 웰 내용물을 5~10회 피펫팅하여 조심스럽게 재현탁합니다. 그 다음, 피펫 팁을 사용하여 웰의 내용물을 원형으로 부드럽게 섞어줍니다. 희석하지 않은 분석 웰 내용물 10 µL를 CARA 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮기되, 옮기는 동안 튀지 않도록 주의하며 10 µL의 분주액이 CARA 마이크로플레이트 웰의 중앙에 떨어지도록 합니다.플레이트 테이프를 사용하여 CARA 마이크로플레이트를 묶은 다음, 밀폐 가능한 플라스틱 백에 넣습니다. M.smegmatis CARA 마이크로플레이트를 37 °C, 20% O2 조건에서 배양하며, 복제 플레이트의 경우 1~2일 동안, 비복제 플레이트의 경우 2~3일 동안 배양합니다. 음성 대조군 웰에 박테리아 성장 막이나 더 큰 거시적 콜로니가 보이면, 멀티채널 피펫과 12개의 p200 팁 한 세트를 사용하여 멸균 PBS 40 µL를 웰의 측면을 따라 분주하고, PBS가 한천/박테리아 마이크로콜로니 상단에 골고루 퍼지도록 합니다.resazurin 5 mg과 PBS에 희석된 5% Tween80 50 mL를 혼합하여 CARA 발색 시약을 준비합니다. 새로 준비한 CARA 발색 시약 50 µL를 CARA 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 앞뒤로 몇 번 흔들어 각 웰의 한천 및 세균 매트 전체에 시약이 고르게 분산되도록 합니다.플레이트를 밀폐 가능한 플라스틱 백에 넣고 M.smegmatis의 경우 37°C에서 최소 30분 동안 배양합니다. 형광을 측정하기 전에, CARA 마이크로플레이트의 덮개를 제거한 상태로 생물안전 작업대 내에서 실온으로 15분 동안 둡니다. 생물안전 작업대 외부의 BSL3 분광광도계를 사용할 때는 플레이트 위에 광학 품질의 PCR 스티커를 부착하고, 부드러운 종이 타월을 사용하여 스티커 표면을 가볍게 눌러 밀봉합니다.530 nanometers에서 들뜨게 하고 590 nanometers에서 방출되는 상단 읽기(top read)를 통해 형광을 측정하십시오. 플레이트의 블랭크 처리는 필요하지 않습니다. 데이터를 분석하려면 X축에 억제제 농도를 log10 척도로, Y축에 형광을 선형 척도로 플롯하십시오.추가적인 세부 사항은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. CARA 형광이 배경 수준 이상으로 상승하지 않게 만드는 테스트 약물의 농도가 여기 표시된 CARA-MBC ≥ 99입니다. ≥ 99 하첨자는 CARA-MBC가 2 log10 이상의 세균 사멸을 유도하는 추정 테스트 약물 농도를 제공함을 나타냅니다.화합물이 정균성 창(static window)을 나타내는 경우 항생제 후 효과(post antibiotic effect)를 나타내는 것으로 의심되며, 정균성 창은 MIC 곡선과 CARA 곡선 사이에 4배 이상의 우측 이동이 있는 것으로 정의됩니다. 정균성 창은 복제 중인 M.tuberculosis에 활성을 보이는 분자가 살균성(bactericidal)이 아닌 정균성(bacteriostatic)일 수 있음을 나타냅니다. 강력한 항생제 후 효과를 가진 분자의 경우 정균성 창을 관찰하기 어려울 수 있으며, 여기에서 보는 것과 같이 CARA 형광의 Y축을 확장하여 확인해야만 나타날 수 있습니다.MIC90 및 CARA로 테스트한 복제 및 비복제 활성 분자들이 여기에 제시되어 있습니다. MIC90 분석에서는 isoniazid와 linezolid가 비복제 박테리아에 대해 활성을 보이는 것으로 나타났으나, CARA 결과에서는 테스트된 비복제 조건 하에서 이들이 비활성임을 시사합니다. 본 CARA 실험에서 M.smegmatis를 점차 증가하는 농도의 rifampicin에 노출시킨 결과, 최소 1시간 만에 영향이 나타났으며, 3시간에서 24시간 사이에 살균 활성이 증가하여 24시간까지 약 10 $\mu\text{g/mL}$ 농도에서 $\ge 2\text{--}3 \log_{10}$ 이상의 사멸률을 보였습니다.이 기술을 완전히 익히면, 적절히 수행했을 때 플레이트 준비에 약 2시간, CARA 플레이트로의 세포 전이에 1시간 미만, CARA 플레이트의 형광 발색 및 측정에 약 1~2시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때, CARA를 예측 분석법으로 사용하여 화합물이 복제 중이거나 비복제 상태인 마이코박테리아(mycobacteria)에 대해 살균 또는 정균 활성을 갖는지 결정하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 영상을 시청한 후에는 CARA를 설정하고 데이터를 분석하여 화합물의 활성 유형을 예측하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.시청해주셔서 감사합니다. 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

visualization-charcoal-agar-resazurin-assay-for-semi-quantitative

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항균 화합물의 활성을 평가하기 위한 CARA(Charcoal Agar Resazurin Assay)를 보여줍니다. CARA는 박테리아 성장에 미치는 영향을 측정하고 살균 효과와 정균 효과를 구별하여 이러한 화합물의 효능을 평가하는 데 도움이 됩니다.

마이코박테리아에 대한 테스트 화합물 활성을 평가하기 위한 Charcoal Agar Resazurin 분석

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

이 비디오는 Mycobacterium tuberculosis에 대한 항생제 효능을 결정하기 위한 육체 내 분석을 보여줍니다. 박테리아 배양액은 다양한 농도의 살균 항생제로 배양됩니다. 살균 효능은 레사주린(resazurin) 분석을 사용하여 생존 가능한 박테리아의 존재를 평가하여 측정됩니다.

국물 내 마이코박테리아에 대한 테스트 컴파운드의 효과 평가

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

세포 내 M. 결핵 성장의 신속하고 효율적인 정량화는 결핵(TB)에 대한 개선된 치료법을 추구하는 데 중요합니다 . 이 프로토콜은 후보 숙주 지시 요법으로 처리된 대식세포에서 Mtb 성장을 정량화하기 위해 자동화된 액체 배양 시스템을 사용하는 브로스 기반 비색 검출 분석을 설명합니다.

결핵에 대한 숙주 유도 요법의 전임상 테스트에 사용하기 위한 자동화된 배양 시스템

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

학습하세요 숯 한천 레사주린 분석법(CARA)을 활용한 마이코박테리아 중간처리량 반정량 분석 방법을. 이 기술은 결핵 신약 개발에서 복제 및 비복제 균주에 대한 화합물 활성을 신속하게 평가하여 살균제와 정균제를 구분하고 후속 CFU 분석을 위한 최적 조건을 식별하는 데 활용됩니다.

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

더 많은 동영상 탐색