마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

CARA의 전반적인 목표는 복제 및 비복제 마이코박테리아에 대한 화합물의 활성에 대한 중간 처리량의 반정량적 평가를 제공하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 CFU 대리물로서 CARA를 통해 화합물의 용량 및 시간 의존성을 신속하게 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 결핵 약물 발견 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 화합물이 복제 박테리아에 대해 정균 또는 살균성인지 여부 및 비복제 박테리아에 대해 살균성인지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 방법을 시연하는 사람은 우리 연구실의 동료인 Julia Roberts가 될 것입니다. 1리터 유리 비커에 450ml의 물을 넣거나 2리터 삼각 플라스크에 900ml의 물을 넣으십시오. 비커 또는 플라스크에 오토클레이브 가능한 교반 막대를 포함합니다.

다음으로 Middlebrook 7H11 분말, 활성탄을 0.4% 최종 농도에 추가하고 50% 글리세롤 용액을 추가하여 0.2% 최종 농도를 달성합니다. 플라스크 또는 비커의 입구를 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이브 테이프로 유리에 부착합니다. 매체를 고압증기멸균한 후 숯을 현탁 상태로 유지하기 위해 저속으로 설정된 자기 교반 플레이트에서 섭씨 약 55-65도로 냉각합니다.

마그네틱 교반 플레이트가 있는 생물 안전 후드에서 무균 작업하는 동안 매체에서 호일을 제거하고 2리터 플라스크 또는 1리터 비커에 각각 100 또는 50ml의 OADC 보충제를 추가하고 계속 혼합합니다. 8개 또는 12개의 필터 팁이 있는 멀티채널 피펫을 사용하여 시약 저장 탱크 또는 비커에서 200μL 웰의 7H11-OADC-숯으로 96웰 마이크로플레이트를 채우고 빠르게 작업하여 한천 응고 및 기포 형성을 방지합니다. 건조를 방지하기 위해 다시 밀봉할 수 있는 비닐 봉지에 CARA 마이크로플레이트 더미를 넣고 섭씨 4도에서 보관하십시오.

Middlebrook 7H9-ADN 또는 7H9-OADC의 각각 4 또는 20 밀리리터를 포함하는 폴리 프로필렌 둥근 바닥 또는 원뿔형 원심 분리 튜브에 0.01 - 0.1의 OD580에서 M.smegmatis를 접종합니다. M.smegmatis 배양물을 섭씨 37도 및 20%O2에서 진탕과 함께 배양하여 배양물을 중간 로그 상 또는 약 0.5의 OD580으로 확장합니다. 복제 및 비복제 조건에서 최소 억제 농도 스타일 실험을 설정하려면 0.01의 OD580에서 7H9-ADN의 세포 200마이크로리터를 바닥이 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다.

비복제 분석의 경우 0.02%tyloxapol이 포함된 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 그리고 복제되지 않는 매체를 사용하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 비복제 배지를 사용하여 세포를 OD580 0.1로 희석하고 질산나트륨을 갓 준비한 1몰에서 최종 농도 0.5-5밀리몰로 첨가합니다.

0.1의 OD580에서 200마이크로리터의 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 테스트 에이전트를 준비한 후 2마이크로리터의 테스트 에이전트 1을 A-E행에, 2마이크로리터의 테스트 에이전트 2를 E-H열에 넣고 완전히 혼합합니다. 분석 복제를 위해 M.smegmatis 마이크로플레이트를 섭씨 37도, 20%O2 및 5%CO2에서 1-48시간 동안 배양합니다.

CARA를 판독으로 사용할 시점에서, 50 - 75 마이크로리터로 설정된 p200 멀티채널 피펫을 사용하여 5-10회 위아래로 피펫팅하여 MIC90 스타일 분석 플레이트의 웰 내용물을 조심스럽게 다시 매달아 놓습니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 웰의 내용물을 원을 그리며 부드럽게 소용돌이칩니다. 10마이크로리터의 희석되지 않은 분석 웰 내용물을 CARA 마이크로플레이트의 해당 웰로 이송하여 이송 중 튀는 현상을 방지하고, 10마이크로리터 분취액이 CARA 마이크로플레이트 웰의 중간에 발견되도록 합니다.

플레이트 테이프를 사용하여 CARA 마이크로플레이트 스택을 묶은 다음 다시 밀봉할 수 있는 비닐 봉지에 넣습니다. M.smegmatis CARA 마이크로플레이트를 섭씨 37도에서 20%O2와 함께 복제 플레이트의 경우 1-2일 동안, 비복제 플레이트의 경우 2-3일 동안 배양합니다. 네거티브 대조군 웰에서 박테리아 성장 필름 또는 더 큰 거시적 콜로니가 보이면 멀티채널 피펫과 함께 단일 12개의 p200 팁 세트를 사용하여 웰 측면을 따라 40마이크로리터의 멸균 PBS를 분배하고 PBS가 한천/박테리아 미세콜로니 상단을 가로질러 분포되도록 합니다.

PBS에서 5mg의 resazurin과 50ml의 5%Tween80을 혼합하여 CARA 현상 시약을 준비합니다. 갓 준비한 CARA 현상 시약 50마이크로리터를 CARA 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 앞뒤로 몇 번 흔들어 각 웰의 한천과 박테리아 매트에 시약을 분배하는 데 도움이 됩니다.

플레이트를 다시 밀봉할 수 있는 비닐 봉지에 넣고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 M.smegmatis를 배양합니다. 형광을 판독하기 전에 뚜껑을 제거한 상태로 실온에서 15분 동안 CARA 마이크로플레이트를 생물안전 후드에 넣습니다. 생물 안전 캐비닛 외부에서 BSL3 분광 광도계를 사용하는 경우 플레이트 위에 광학 품질 PCR 스티커를 부착하고 부드러운 종이 타월을 사용하여 스티커 표면을 부드럽게 눌러 단단히 밀봉합니다.

530 나노미터에서 여기(excitation)와 590 나노미터(nanometer)에서 방출(emission with emission)을 사용하여 상단 판독을 통해 형광을 측정합니다. 플레이트를 비울 필요는 없습니다. 데이터를 분석하려면 X축의 억제제 농도를 log10 척도로 표시하고 Y축의 형광을 선형 척도로 표시합니다.

자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. CARA 형광이 배경 수준 이상으로 상승하지 못하는 테스트 에이전트의 농도는 여기에 표시된 99보다 큰 CARA-MBC입니다. 99 아래 첨자보다 큼은 CARA-MBC가 테스트 에이전트의 예상 농도를 제공하여 2개의 log10 박테리아 사멸보다 크다는 것을 나타냅니다.

화합물은 MIC와 CARA 곡선 사이에서 오른쪽으로 4배 이상의 이동으로 정의되는 정적 창을 표시하는 경우 항생제 후 효과를 발휘하는 것으로 의심됩니다. 정적 창은 M.tuberculosis를 복제하는 것에 대해 활성을 보이는 분자가 살균 대신 정균일 수 있음을 나타냅니다. 강력한 항생제 후 효과가 있는 분자의 경우, 정적 창을 관찰하기 어려울 수 있으며, 여기에서 볼 수 있듯이 CARA 형광에 대한 확장된 Y축을 검사한 후에만 알 수 있습니다.

MIC90 및 CARA에 의해 테스트된 복제 및 비복제 활성 분자가 여기에 나와 있습니다. 이소니아지드(isoniazid)와 리네졸리드(linezolid)는 MIC90 분석에 의해 비복제 박테리아에 대해 활성을 보이는 것으로 보이지만, CARA는 테스트된 비복제 조건에서 비활성 상태임을 시사합니다. 이 CARA 실험에서 M.smegmatis를 리팜피신 농도 증가에 노출시키면 1시간 이내에 효과가 나타나며 3시간에서 24시간 사이에 살균 활성이 증가하여 밀리리터당 약 10마이크로그램에서 2-3 log10 이상으로 살해하는 것으로 나타났습니다.

이 기술을 마스터하면 플레이트를 준비하는 데 약 2시간, CARA 플레이트로 세포를 옮기는 데 1시간 미만, 적절하게 수행되면 CARA 플레이트의 형광을 개발하고 측정하는 데 약 1-2시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 화합물이 복제 또는 비복제 중인 마이코박테리아에 대해 살균 또는 정균 활성이 있는지 확인하기 위한 예측 분석법으로 CARA를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 화합물의 활성 유형을 예측하는 데 도움이 되는 방식으로 CARA를 설정하고 데이터를 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.