Name: LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 배우세요 광유전학 도구를 유동 세포 계측법과 결합하여 세포 신호 전달을 실시간으로 분석하는 새로운 방법을. Ramos B 림프구를 사용하여 광학적으로 제어되는 물질의 특성을 규명하고 세포 신호 경로를 탐구할 수 있습니다.

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장치를 제작해 준 프라이부르크 대학의 J. Schmidt에게 감사드립니다. 이 원고에 대한 지원과 비판적 읽기에 대해 P. Nielsen과 D. Medgyesi에게 감사드립니다. 이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft를 통한 SFB746과 독일 연구 재단의 Excellence Initiative(GSC-4, Spemann 대학원)의 지원을 받았습니다.

1. 디자인 및 장치 구축 <ol><li> 파일럿 실험 참고 : 특정 optogenetic 도구 및 세포 유형에 필요한 빛의 강도는 상당히 다를 수 있습니다. 프로토 타입 파일럿 실험에 필요한 최소 광량을 측정하는 데 유용하다. 이하의 실험에 사용되는 툴은 optogenetic Dronpa - 링커 Dronpa 융합 작 제물이다. Dronpa 순서는 상업적으로 (자료 목록을 참조)를 얻었다. 긴 링커 발현 구조는 분자 (및 분자간) 이량 체를 형성 할 수 있도록 두 Dronpa 서열 사이에 클로닝 하였다. 이하의 단계는 많은 다른 optogenetic 도구 나 광 제어 물질로 구성 될 수있다. <ol><li> 포장 세포에서 레트로 바이러스 함유 뜨는을 사용하여 전달하기위한 제조업체의 지침을 따르는 Dronpa-링커 Dronpa 포함하는 구조로 라모스 B 림프구를 형질 도입. 사전에 따라 수확 및 카운트 세포viously 프로토콜 13을 발표했다. </li><li> 의 농도로 재현 탁 된 세포를 1 × 106 매질 / ㎖ (1640 RPMI, 10 %의 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) 및 유리 FACS 튜브로 전송. </li><li> 사이토 흐름에 튜브를 삽입하고 Dronpa (GFP 채널) 14, 15의 형광 강도를 측정한다. </li><li> 아마도 손상 파장으로부터 눈을 보호하기위한 모든 추가 단계에 대한 보호 안경을 착용 할 것. </li><li> 수동으로 튜브의 외측에 500 nm의 LED 광을두고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속한다. </li><li> Dronpa의 형광 강도가 감소 할 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 높입니다. </li><li> 수동으로 튜브의 외부에 400 nm의 LED 조명을 배치하고 Dronpa의 형광 강도를 측정 계속합니다. </li><li> Dronpa의 FLUO 때까지 LED 조명의 수 및 / 또는 강도를 증가강도 증가 rescence. </li><li> 단계 1.1.5과 1.1.7에서 photoswitching에서 필요하다고 예측으로 장치를 구축하기위한 최소한 많은 LED 조명을 사용합니다. </li></ol></li><li> 장치 구축 주 : 장치 전문 가공 숍, 프라이 부르크 대학에서 Arbeitsgruppe Technik에 의해 지어졌다. 대부분의 부품은 맞춤 제작 한 상업적으로 사용할 수 없습니다. 각 부분의 정확한 치수는도 1 및도 2에 도시된다. 이 장치의 조립을 명확히하기 위해, 부가 비디오 1은 제공되고, 가장 중요한 단계는 아래에 설명된다. <ol><li> 도 1a에 도시 된 정확한 측정을 폴리 비닐 클로라이드 (PVC)로부터 밀 피스를했다. </li><li> 조각 (A)의 드릴 구멍에 LED 조명을 삽입하고 누수를 방지하기 위해 PVC 접착제와 각 구멍을 밀봉. </li><li> 멀티 채널 변압기에 LED를 연결하면 (각각의 파장은 별도의 chann를 차지한다0-29mA에서 조정 가능한 출력 전력과 엘). </li><li> 물리적 손상으로부터 LED를 보호하는 도시 된 부분 (A)에 3 개의 나사를 외장 시스 (B)를 부착. </li><li> 부분 (A)의 천공 구멍에 튜브 클립 (C)에 물 펌프, 접착제에 장치를 연결할 수 있도록 (도 1a에 도시 된 바와 같이, 단면 Y : 9 mm와 61.5 mm) PVC 접착제를 사용. </li><li> 58.5 mm 긴 플렉시 글라스 튜브 (D1)를 잘라. </li><li> 그림 2에 도시 된 바와 같이 유기 유리로 만들어진 조각 D2와 D3를 생산하고 있습니다. </li><li> 플렉시 유리 접착제와 D1의 바닥에 접착제 조각 D3. </li><li> 조각 D2에 고무 O 링을 부착하고 플렉시 유리 접착제와 D1의 상단에 접착제. 참고 : 조각 D1, D2와 D3가 함께 조각 D.을 형성 </li><li> 3 나사 부분 (A) 내로 조각 D를 삽입합니다. </li><li> 변압기에 전원을 공급하기 전에 누수에 대한 장치를 테스트합니다. </li></ol></li></ol> 2. Optogenetic 도구의 속도론을 측정 <ol&gt; <li> 세포를 준비 <ol><li> RPMI-배지에서 배양 라모스 B 세포 (RPMI 1640, 10 % 열 - 불 활성화 FCS, 2 mM L- 글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 U / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올) -3-의 밀도 10 × 106 세포 / ㎖, 37 ℃에서 5 % CO 2. </li><li> 350 XG에 5 분간 4 ℃에서 원심 분리하여 수확 라모스 B 세포. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 600 μL 매체에 1-5 × 10 6 세포를 재현 탁. </li><li> 유리 FACS 튜브에 세포 이동을 측정 할 때까지 빛으로부터 얼음에 넣어 그들을 보호한다. </li></ol></li><li> 유동 세포 계수기와 장치를 준비합니다. <ol><li> 가열 된 물 펌프에 장치를 연결하고 37 ° C의 온도를 조절합니다. </li><li> 유리 FACS 튜브를 사용할 때, 사이토 고무 O 링으로 유동 검정 O 링을 교환하고 별도로 실리콘 GR 적용용이함. </li></ol></li><li> 측정 <ol><li> 조심스럽게 장치에 유리 FACS 튜브를 삽입하고 (그림 3) 흐름 cytometer에 연결합니다. </li><li> 측정을 시작하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록. </li><li> 각각 400 내지 500 nm의 빛으로 세포 샘플을 조명하고 Dronpa 형광 강도 (GFP 채널)를 기록한다. </li></ol></li><li> 데이터 분석 <ol><li> 소프트웨어 사이토 적합한 흐름 실험 데이터를 분석 할 수 있습니다. 측방 산란 및 게이트 살아있는 세포에 대한 플롯 앞으로 산란. 시간 경과 Dronpa 형광 강도를 플롯. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+concept+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive concept of optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).</li>
<li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nat Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+intracellular+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of intracellular signaling pathways.</a> Trends Biotechnol. 33 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Bugaj, L. J., Choksi, A. T., Mesuda, C. K., Kane, R. S., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+protein+clustering+and+signaling+activation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optogenetic protein clustering and signaling activation in mammalian cells.</a> Nat Methods. 10 (3), 249-252 (2013).</li>
<li>Bugaj, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endogenous+transmembrane+receptors+through+optogenetic+Cry2+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of endogenous transmembrane receptors through optogenetic Cry2 clustering.</a> Nat Commun. 6, 6898(2015).</li>
<li>Strickland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TULIPs%3A+tunable%2C+light-controlled+interacting+protein+tags+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology.</a> Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).</li>
<li>Taslimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+optogenetic+clustering+tool+for+probing+protein+interaction+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An optimized optogenetic clustering tool for probing protein interaction and function.</a> Nat Commun. 5, 4925(2014).</li>
<li>Toettcher, J. E., Gong, D., Lim, W. A., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-based+feedback+for+controlling+intracellular+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-based feedback for controlling intracellular signaling dynamics.</a> Nat Methods. 8 (10), 837-839 (2011).</li>
<li>Toettcher, J. E., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optogenetics+to+interrogate+the+dynamic+control+of+signal+transmission+by+the+Ras%2FErk+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Using optogenetics to interrogate the dynamic control of signal transmission by the Ras/Erk module.</a> Cell. 155 (6), 1422-1434 (2013).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+a+photoactivatable+antigen+system+to+examine+B-cell+probing+termination+and+the+B-cell+receptor+sorting+mechanisms+during+B-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Utilization of a photoactivatable antigen system to examine B-cell probing termination and the B-cell receptor sorting mechanisms during B-cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E558-E567 (2016).</li>
<li>Wend, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+protein+kinase+activity+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of protein kinase activity in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 3 (5), 280-285 (2014).</li>
<li>Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+protein+activity+by+fluorescent+protein+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical control of protein activity by fluorescent protein domains.</a> Science. 338 (6108), 810-814 (2012).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods Mol Biol. 699, 1-29 (2011).</li>
<li>Brakemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversibly+photoswitchable+GFP-like+protein+with+fluorescence+excitation+decoupled+from+switching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A reversibly photoswitchable GFP-like protein with fluorescence excitation decoupled from switching.</a> Nat Biotechnol. 29 (10), 942-947 (2011).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

LED가 열 흐름은 흐름 세포 계수기에 optogenetic 도구를 연구하는 혁신적인 장치입니다. 지금까지 optogenetic 샘플은 현미경 레이저 또는 플래시 장치 (11, 12)으로 조사되었다. 샘플을 플래쉬의 각 거리에 따라 조도의 양의 상당한 변화는 실험간에 예상된다. 또한, 한 사람이 실험에서 동작 할 수 손전등의 개수에는 제한이있다. 이 실험 레퍼토리와 재현성을 제한합니다. 이러한 제한은 살아있는 세포에서 실시간 photoswitching 동력학을 특성화하는데 사용될 수있는 우리의 장치의 개발 동안 해결 하였다. 우리의 지식에 더 유사한 장치가 없습니다. 현재 구성에서 최대 30 개의 LED는 하나의 열 유량 용기에 내장 될 수있다. 따라서, 각각의 파장에 필요한 빛의 강도에 따라, 하나의 장치는 우리가 될 수 있습니다optogenetic 도구의 광범위한 에드. 설정된 photoswitchin...

그들은 1-4 경로 신호의 배선를 해독하는데 사용할 수 있기 때문에 Optogenetic 도구 부분에서 인기를 얻어왔다. 이들은 광이 조명 될 때 그 형태 및 결합 친화도를 변경하는 광활성 단백질의 능력에 기초한다. 신호 요소에이 단백질을 융합하는 복잡한 세포 내 신호 전달 경로 5-12 내에서 단일 플레이어의 특정 규제 수 있습니다. 결과적으로, 신호 전달은 높은 공간적 해상도를 연구 할 수있다. 대부분의 셀 기반 optogenetic 연구 생화학 분석 11,12 뒤에 빛의 존재하에 배양 결합 현미경 기반 방법을 사용한다. 대조적으로, 플로우 사이토 모세관 따라 세포 단수형 셀 크기, 입도 및 형광 강도를 측정한다. 이 방법은 thousan 분석 할 수있는 기능을 포함하여 현미경 또는 생화학 적 방법에 비해 큰 장점을 가지고 있습니다매우 짧은 시간에 단일 셀 해상도에서 살아있는 세포의 DS. 그러므로, 유동 세포 계측법에 optogenetics을 결합하는 것이 바람직하다. 우리의 지식에, optogenetic 유동 세포 계측법에 대한 확립 된 프로토콜이 없습니다. 광범위하게 허용 절차는 수동 플래쉬 장치 반응 관 외부로부터 셀을 조명하기위한 것이다. 그러나, 유동의 수동 조명 사이토 생균 촬상 원통형 가열 수조를 들어, 반응 관을 통과하는 광을 필요로한다. 이것은 상당한 광 산란 빛의 손실이 발생합니다. 또한, 수동에 의해 제공된 조명의 광 강도 (등 각도 간격) 실험 간 재현성이없는 한 실험에서 파장의 수에는 실제적인 한계가있다. LED가 열 유량 장치를 구성함으로써, 이러한 한계를 극복 할 수 있었다. 이 장치로, 세포는 임시의 특정 파장으로 조명 될 수있다erature 제어 유세포 측정 중에 방식. 이것은 내 실험 사이의 빛의 정확하고 재현성있는 양의 수 있습니다. 생체 내에서 우리의 장치의 유틸리티를 설명하기 위해, 우리는 photoswitching 동안 라모스 B 세포에서 Dronpa의 형광 신호를 기록했다. 라모스 B 세포는 인간 버킷 림프종으로부터 유도된다. Dronpa는 단량체, 이량 체 또는 사량 체로서 존재 형광 단백질이다. 그 단량체 형태에서, 비 형광이다. 400 nm의 빛 조명은 이량 및 테트라을 유도하고 Dronpa 단백질의 형광을 렌더링합니다. 이 프로세스는 500 nm의 광을 조사하여 반전 될 수있다. Dronpa 단백질은 단백질 4,13 시그널링의 기능과 위치를 제어하는 데 사용되어왔다. 여기, 우리는 사이토의 흐름에 Dronpa의 photoswitching을 연구하는 라모스의 B 세포에서 Dronpa-링커 Dronpa 단백질을 표현했다. 우리의 장치를 사용하여, 우리가 할 수 있었다 효율적이고실시간으로 그 형광 강도를 기록하는 동안 재현 Dronpa을 포토 스위치. 이 방법은 수동 조명 현재 조명 프로토콜을 통해 상당한 이점을 제공하고 크게 optogenetic 도구와 케이지 화합물에 대한 실험적인 레퍼토리를 넓혀. 크게 간소화 및 신규 optogenetic 도구의 발견과 개발을 촉진 할 우리의 장치를 사용.

<table><tbody><tr><td>유리 FACS 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific; Waltham, 미국</td><td>14-961-26</td><td>붕규산 유리관 12x75 mm</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Bioscienceg; 독일 하이델베르크</td><td>포르테사 II</td><td>특별 주문</td></tr><tr><td>Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N</td><td>Addgene; 미국 케임브리지</td><td>41645</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen, Rockville, USA</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>LED 505nm</td><td>Avago Technologies; 독일 뵈블링겐</td><td>HLMP-CE34-Y1CDD</td><td></td></tr><tr><td>LED 400nm</td><td>아바고 테크놀로지스; Boeblingen, 독일</td><td>UV5TZ-400-15</td><td></td></tr><tr><td>플렉시 유리 튜브 15mm</td><td>Maertin; 독일 프라이부르크</td><td>76999</td><td></td></tr><tr><td>플렉시글라스 3mm</td><td>메르틴; 독일 프라이부르크</td><td>692230</td><td></td></tr><tr><td>플렉시글라스 2.5mm</td><td>Maertin; 독일 프라이부르크</td><td>692225</td><td></td></tr><tr><td>플렉시글라스 1.5mm</td><td>Maertin; 프라이부르크, 독일</td><td>692215</td><td></td></tr><tr><td>PVC 타일 5mm</td><td>Maertin; 프라이부르크, 독일</td><td>690020.005</td><td></td></tr><tr><td>PVC 타일 6mm</td><td>Maertin; 프라이부르크, 독일</td><td>690020.006</td><td></td></tr><tr><td>PVC 블록 50mm</td><td>Maertin; 프라이부르크, 독일</td><td>690020.050</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>EMD; 독일</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAN 생명공학; Aidenbach, Germany</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트르프토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen, Life Technologies; 다름슈타트, 독일</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acrifix 플렉시글라스 접착제</td><td>Evonic industries, Essen, Germany</td><td>1R0192</td><td></td></tr><tr><td>Tangit PVC-U 접착제</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, 독일</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

led 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 optogenetics 결합

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

광유전학 도구를 사용하면 복잡한 신호 경로 내에서 거의 모든 신호 분자에 대한 고립된 기능적 조사를 수행할 수 있습니다. 주요 장애물은 세포 샘플에 대한 빛의 제어된 전달이므로 광유전학 연구에 가장 널리 사용되는 도구는 현미경 기반 세포 분석 및 체외 실험입니다. 유세포 분석기는 단일 세포 분해능에서 수천 개의 세포를 신속하게 측정할 수 있는 기능을 포함하여 현미경에 비해 주요 장점이 있습니다. 그러나 아직 광유전학에서는 널리 사용되지 않습니다. 여기에서는 광유전학과 유세포 분석의 힘을 결합한 장치인 LED Thermo Flow를 소개합니다. 이 장치는 유세포 분석 측정 중에 특정 파장, 광도 및 온도에서 세포를 비춥니다. 저렴한 비용으로 구축할 수 있으며 가장 일반적인 유세포 분석기와 함께 사용할 수 있습니다. 그 유용성을 입증하기 위해 우리는 생체 내에서 실시간으로 Dronpa 단백질의 광스위칭 역학을 특성화했습니다. 이 프로토콜은 거의 모든 광학 제어 물질에 적용할 수 있으며 가능한 실험 세트를 크게 확장할 수 있습니다. 더 중요한 것은 새로운 광유전학 도구의 발견 및 개발을 크게 단순화할 것이라는 것입니다.

플로우 사이토와 LED 열 흐름을 사용하여 장치의 기능은 코어 등이 내측 가리키는 원형 방식으로 배열 된 LED 된 원통형 챔버이다. 이 챔버는 LED의 온도뿐만 아니라, 세포 샘플을 제어 가능하게하는 급수 펌프에 연결될 수있다. LED는 변압기에 연결되어 있으며, 따라서 각각의 파장에 대한 광 세기가 개별적으로 제어 될 수있다. 장치의 중심은 가장 표준적인 유동 세포 계측기에 접속 될 수있는 표준 크기 FACS 튜브 수용한다 (도 4 및도 5). 세포의 바람직하지 않은 가열로 이어질하지 않는 우리의 장치에 그 조명을 표시하려면, 우리는 세 가지 다른 파장에 대해 시간에 조명 PBS의 온도 (그림 6)를 측정 하였다. 360 나노 미터, 400 나노 미터 또는 500 나노 ...

광학적으로 제어되는 물질은 신호 경로를 연구하는 강력한 도구입니다. 가능한 실험의 범위를 확장하기 위해 유세포 분석을 사용하여 광학 제어 물질을 실시간으로 연구할 수 있는 장치인 LED Thermo Flow를 개발했습니다.

LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

이 방법의 전반적인 목표는 유세포 분석 측정 중에 광학적으로 제어되는 물질을 자극하는 것입니다. 이 새로운 장치는 광학 제어 물질의 힘과 유세포 분석을 결합하여 세포 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 처음으로 유세포 분석을 사용하여 광유전학 도구를 특성화하고 분석할 수 있습니다.오늘날까지 비교할 수 있는 확립된 방법은 존재하지 않았습니다. 먼저 transduction된 Ramos B 림프구를 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 현탁시키고 유리 FACS 튜브로 전달합니다. 다음으로, 유세포 분석기의 검은색 O-링을 고무 O-링으로 교환하고 실리콘 그리스를 바르면 더 나은 밀봉을 만들 수 있습니다.유리관을 유세포 분석기에 삽입하고 조명을 끈 상태에서 튜브 주위에 LED 프로토타입을 놓습니다. GFP 채널에서 Dronpa의 형광 강도를 측정합니다. 절차의 가장 중요한 단계는 유리관을 취급하는 것입니다.유리 FACS 튜브는 매우 약하므로 실험을 수행하기 전에 유리관을 세포 분석기에 삽입하는 연습을 하는 것이 좋습니다. 그런 다음 튜브 외부에 있는 500나노미터 LED 조명을 켜고 Dronpa의 형광 강도를 계속 측정합니다. Dronpa-Linker-Dronpa 단백질의 광전환을 측정하기 위해 필요한 최소 광 강도를 추정하기 위해 Dronpa 형광 강도가 감소할 때까지 LED 조명의 강도를 높입니다.다음으로, 튜브 외부에 있는 프로토타입의 400나노미터 LED 조명을 켜고 Dronpa의 형광 강도를 계속 측정합니다. Dronpa 형광 강도가 증가할 때까지 400나노미터 LED 조명의 광도를 높입니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 설계 및 제조 지침에 따라 광 스위칭 LED 장치의 내부 및 외부 레이어를 제작하는 것으로 시작하십시오.400 및 500 나노미터 파장 LED를 장치의 채널에 삽입합니다. 제자리에 붙이고 지시에 따라 배선하십시오. 이러한 특정 파장은 Dronpa-Linker-Dronpa 융합 단백질을 어두운 상태와 밝은 상태 사이에서 전환하는 데 사용됩니다.그런 다음 변압기의 전원을 켜기 전에 장치를 조립하고 누출을 방지하기 위해 방수가 되어 있는지 확인하십시오. 장치 조립 후 Ramos B 림프구를 수확하고 밀리리터당 3-1,000만 세포의 밀도로 현탁시킵니다. 600마이크로리터의 셀을 유리 FACS 튜브로 옮깁니다.얼음 위에 놓고 측정할 때까지 빛으로부터 세포를 보호하십시오. 조립된 장치를 가열된 워터 펌프에 연결하고 온도를 섭씨 37도로 조정합니다. 그런 다음 유리 FACS 튜브를 장치에 조심스럽게 삽입하고 유세포 분석기에 연결합니다.GFP 채널에서 Dronpa 형광 강도를 기록합니다. 이 광유전 장치의 설계에는 샘플의 온도를 일정한 값으로 유지하기 위해 순환 급수 장치에 연결할 수 있는 챔버가 포함됩니다. 이 장치는 세 가지 다른 파장을 방출했지만 장치를 통해 섭씨 37도의 물을 흐를 때 FACS 샘플에서 미미한 온도 증가만 관찰되었습니다.Dronpa-Linker-Dronpa 융합 구조체를 복제하여 Ramos B 세포에 형질주입했습니다. 500나노미터 광원에 의해 단량체 상태로 향하면 방출 강도가 감소합니다. 그런 다음 광원이 400나노미터 빛으로 전환되면 Dronpa 단량체가 빠르게 이합체 상태로 변경되고 강도가 빠르게 증가합니다.이 장치를 사용하여 세포질 Dronpa-Linker-Dronpa 융합 단백질을 여러 번 광전환할 수 있었습니다. 어두운 상태로의 전환은 천천히 이루어지는 반면 밝은 상태로의 전환은 거의 즉시 발생합니다. 어둠 속에서 Dronpa의 자발적인 형광 회복은 밝은 형태로의 효율적인 광 전환에는 특정 조명이 필요하며 천천히 자발적으로 발생한다는 것을 보여줍니다.동역학 분석은 광스위칭 속도가 전반적으로 매우 재현성이 높으며 어두운 곳에서 장기간 배양한 후에도 광스위칭 없이 형광의 약 10%만 회수된다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 칼슘 플럭스 측정을 포함한 모든 유세포 분석을 수행하여 선택한 광유전학 도구의 기능을 탐색할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 광유전학 분야의 연구자들이 세포 신호 경로의 배선을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.이 비디오를 시청한 후에는 특정 광유전학 도구에 대한 광 스위칭 프로토콜을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 안경과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

led-thermo-flow-combining-optogenetics-with-flow-cytometry

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연구

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생물학

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배우세요 광유전학 도구를 유동 세포 계측법과 결합하여 세포 신호 전달을 실시간으로 분석하는 새로운 방법을. Ramos B 림프구를 사용하여 광학적으로 제어되는 물질의 특성을 규명하고 세포 신호 경로를 탐구할 수 있습니다.

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