LED 열 흐름 - 유동 세포 계측법으로 Optogenetics 결합

이 방법의 전반적인 목표는 유세포 분석 측정 중에 광학적으로 제어되는 물질을 자극하는 것입니다. 이 새로운 장치는 광학 제어 물질의 힘과 유세포 분석을 결합하여 세포 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 처음으로 유세포 분석을 사용하여 광유전학 도구를 특성화하고 분석할 수 있습니다.

오늘날까지 비교할 수 있는 확립된 방법은 존재하지 않았습니다. 먼저 transduction된 Ramos B 림프구를 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 현탁시키고 유리 FACS 튜브로 전달합니다. 다음으로, 유세포 분석기의 검은색 O-링을 고무 O-링으로 교환하고 실리콘 그리스를 바르면 더 나은 밀봉을 만들 수 있습니다.

유리관을 유세포 분석기에 삽입하고 조명을 끈 상태에서 튜브 주위에 LED 프로토타입을 놓습니다. GFP 채널에서 Dronpa의 형광 강도를 측정합니다. 절차의 가장 중요한 단계는 유리관을 취급하는 것입니다.

유리 FACS 튜브는 매우 약하므로 실험을 수행하기 전에 유리관을 세포 분석기에 삽입하는 연습을 하는 것이 좋습니다. 그런 다음 튜브 외부에 있는 500나노미터 LED 조명을 켜고 Dronpa의 형광 강도를 계속 측정합니다. Dronpa-Linker-Dronpa 단백질의 광전환을 측정하기 위해 필요한 최소 광 강도를 추정하기 위해 Dronpa 형광 강도가 감소할 때까지 LED 조명의 강도를 높입니다.

다음으로, 튜브 외부에 있는 프로토타입의 400나노미터 LED 조명을 켜고 Dronpa의 형광 강도를 계속 측정합니다. Dronpa 형광 강도가 증가할 때까지 400나노미터 LED 조명의 광도를 높입니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 설계 및 제조 지침에 따라 광 스위칭 LED 장치의 내부 및 외부 레이어를 제작하는 것으로 시작하십시오.

400 및 500 나노미터 파장 LED를 장치의 채널에 삽입합니다. 제자리에 붙이고 지시에 따라 배선하십시오. 이러한 특정 파장은 Dronpa-Linker-Dronpa 융합 단백질을 어두운 상태와 밝은 상태 사이에서 전환하는 데 사용됩니다.

그런 다음 변압기의 전원을 켜기 전에 장치를 조립하고 누출을 방지하기 위해 방수가 되어 있는지 확인하십시오. 장치 조립 후 Ramos B 림프구를 수확하고 밀리리터당 3-1,000만 세포의 밀도로 현탁시킵니다. 600마이크로리터의 셀을 유리 FACS 튜브로 옮깁니다.

얼음 위에 놓고 측정할 때까지 빛으로부터 세포를 보호하십시오. 조립된 장치를 가열된 워터 펌프에 연결하고 온도를 섭씨 37도로 조정합니다. 그런 다음 유리 FACS 튜브를 장치에 조심스럽게 삽입하고 유세포 분석기에 연결합니다.

GFP 채널에서 Dronpa 형광 강도를 기록합니다. 이 광유전 장치의 설계에는 샘플의 온도를 일정한 값으로 유지하기 위해 순환 급수 장치에 연결할 수 있는 챔버가 포함됩니다. 이 장치는 세 가지 다른 파장을 방출했지만 장치를 통해 섭씨 37도의 물을 흐를 때 FACS 샘플에서 미미한 온도 증가만 관찰되었습니다.

Dronpa-Linker-Dronpa 융합 구조체를 복제하여 Ramos B 세포에 형질주입했습니다. 500나노미터 광원에 의해 단량체 상태로 향하면 방출 강도가 감소합니다. 그런 다음 광원이 400나노미터 빛으로 전환되면 Dronpa 단량체가 빠르게 이합체 상태로 변경되고 강도가 빠르게 증가합니다.

이 장치를 사용하여 세포질 Dronpa-Linker-Dronpa 융합 단백질을 여러 번 광전환할 수 있었습니다. 어두운 상태로의 전환은 천천히 이루어지는 반면 밝은 상태로의 전환은 거의 즉시 발생합니다. 어둠 속에서 Dronpa의 자발적인 형광 회복은 밝은 형태로의 효율적인 광 전환에는 특정 조명이 필요하며 천천히 자발적으로 발생한다는 것을 보여줍니다.

동역학 분석은 광스위칭 속도가 전반적으로 매우 재현성이 높으며 어두운 곳에서 장기간 배양한 후에도 광스위칭 없이 형광의 약 10%만 회수된다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 칼슘 플럭스 측정을 포함한 모든 유세포 분석을 수행하여 선택한 광유전학 도구의 기능을 탐색할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 광유전학 분야의 연구자들이 세포 신호 경로의 배선을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

이 비디오를 시청한 후에는 특정 광유전학 도구에 대한 광 스위칭 프로토콜을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 자외선은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 안경과 같은 예방 조치를 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.