기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

이 마우스 유전자 변형 절차의 전반적인 목표는 IL-22 생성 면역 세포를 식별, 정제 및 특성화하는 것입니다. 면역 체계의 세포는 사이토카인이라고 하는 매개체를 방출하는데, 사이토카인은 박테리아와 같은 외부 물질로부터 우리를 보호하고 손상된 조직을 회복시키는 역할을 합니다. IL-22는 그러한 사이토카인 중 하나이며 조직 복구에서 병리학에 이르기까지 다양한 활동에 작용합니다.

그리고 면역계에 있는 여러 가지 종류의 세포가 그것을 생산할 수 있는 것으로 보고되어 왔다. 그래서 어떤 세포가 실제로 IL-22를 생성하는지 명확히 하기 위해 새로운 IL-22 리포터 마우스를 개발했습니다. 이를 통해 생체 내, 정상적인 조건의 마우스 및 염증성 장 질환 모델에서 관련 IL-22 생산자를 식별할 수 있었습니다.

또한 리포터 세포를 사용하여 IL-22 발현체를 정제하여 다른 특성을 확인했습니다. 리포터 마우스를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 분석 방법을 설명합니다. 설명된 방법은 발현자를 확인하고 추가 특성화를 위해 생존 가능한 발현 세포를 정제하기 위해 다른 유전자에 적용할 수 있습니다.

이 방법은 IL-22의 생물학적 활성과 이를 생산하는 세포의 특성에 대한 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생물학자인 줄리 힉슨(Julie Hixon), 박사후 연구원인 캐롤라인 앤드류스(Caroline Andrews), 그리고 더럼 박사 연구실의 과학자인 웬칭 리(Wenqing Li)가 저와 함께 절차를 시연할 예정입니다. tdTomato 리포터 유전자를 셔틀 벡터에 삽입하고 동일한 부위 내의 GFP 유전자를 대체한 후, 적절한 박테리아 인공 염색체 또는 BAC 템플릿을 사용하여 50 마이크로리터 PCR 반응 시스템에서 A 및 B 상동성 상자를 IL-22의 첫 번째 번역된 엑손으로 증폭합니다.

그런 다음 정제된 벡터를 Luria-Bertani 또는 섭씨 37도에서 클로람페니콜과 암피실린을 함유한 LB 한천 플레이트의 BAC 수용 박테리아 세포로 변환합니다. 배양이 끝나면 1ml의 LB 육수에 2-3개의 콜로니를 접종하고 섭씨 37도 및 225rpm에서 클로람페니콜을 보충합니다. 1시간 후, 각 혼합물 100마이크로리터를 클로람페니콜과 자당이 보충된 LB 한천 플레이트에 펴 바르고 섭씨 37도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 큰 콜로니를 클로람페니콜이 함유된 새 LB 한천 플레이트에 다시 플레이트하고 작은 콜로니를 다른 LB 한천 플레이트에 다시 플레이트를 놓고 플레이트를 30초 동안 자외선에 노출시킵니다. 그런 다음 UV에 민감한 콜로니를 선택하고 tdTomato IL-22 이형접합 프라이머를 사용하여 PCR로 변형된 BAC DNA의 존재를 확인합니다. 비장과 흉선을 제거한 후 미세한 톱니 모양의 절개 겸자를 사용하여 소장 벽에 가까운 진주빛 흰색 장간막 림프절을 채취합니다.

다음으로, 소장과 결장 전체를 제거하고 가위를 사용하여 장을 따라 확장된 타원형 Peyer 패치를 추출합니다. 모든 림프 조직을 채취한 후 장간막 림프절과 Peyer's patch를 PBS의 두 개의 서리로 덥은 슬라이드 사이에 넣고 얼음 위에 FBS를 보충합니다. 동일한 방식으로 개별 비장과 흉선 단세포 현탁액을 생성한 후, 비장 세포를 원심분리한 후 1ml의 ACK Lysing Buffers 비장으로 비장 적혈구 용해

1분 후, 9ml의 PBS로 등장성을 회복하고 세포를 다시 원심분리합니다. 펠릿을 5ml의 PBS에 재현탁시키고 100미크론 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과합니다. 그런 다음 다른 원심분리로 세포를 수집하고, 트리판 블루 배제에 의한 계수를 위해 펠릿을 5밀리리터의 RPI 배지에 재현탁시킵니다.

십이지장에서 회장까지의 소장과 결장 전체를 채취한 후 집게를 사용하여 장에서 여분의 지방 및 장간막 조직을 제거하고 즉시 장 조직을 얼음처럼 차가운 PBS에 넣습니다. 집게를 사용하여 소장의 원위 영역을 따라 Peyer's patch를 채취합니다. 그런 다음 가위를 사용하여 장을 세로로 열고 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 조직을 완전히 씻어냅니다.

셰이커에서 섭씨 37도 및 50rpm에서 30분 동안 2회 30분 배양을 위해 샘플을 20밀리리터의 소화 전 버퍼로 옮기고 12, 000rpm에서 30초 동안 조직을 소용돌이치고 각 배양이 끝날 때 100미크론 세포 스트레이너를 통해 모든 단편을 눌러 상피 세포층을 수집합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 흔들면서 30분 더 배양하기 위해 세포 슬러리에 20ml의 새로운 EDTA 용액을 첨가하고 방금 설명한 것처럼 배양이 끝날 때 장 상피 세포를 여과 및 냉각합니다. 남은 장 조각을 얼음 위에 놓고 원심분리를 통해 고인 장 상피 세포를 채취한 다음 FBS가 보충된 HBSS 10ml로 세척합니다.

세척된 펠릿을 8ml의 44% 콜로이드 실리카 배지에 재현탁시키고 5ml의 67% 콜로이드 실리카 배지로 세포 현탁액을 오버레이합니다. 원심분리로 세포를 분리하고 1ml 피펫을 사용하여 세포 분리 배지의 상위 5ml를 제거합니다. 그런 다음 계면에서 세포를 수집하고 10ml의 RPMI 배지로 장 상피 세포를 세척하고 5ml의 새로운 RPMI로 펠릿을 재현탁합니다.

방금 시연된 바와 같이 IL-22 td-Tomato 마우스에서 단일 비장 세포 현탁액을 준비한 후. 멸균 PBS에서 10 - 1밀리리터당 7번째 세포 농도로 세포를 재현탁하고 마우스 CD4 세포 음성 분리 방법을 사용하여 CD4 양성 T 세포를 정제합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 30분 동안 T 세포에 항-CD4 및 항-CD45RB 항체를 표시합니다.

배양이 끝나면 원심분리로 세포를 채취한 다음 FBS가 보충된 PBS 2밀리리터로 세척합니다. 세척된 펠릿을 1ml의 신선한 PBS 및 FBS에 재현탁시키고 표지된 T 세포를 CD4 및 CD45RB 공발현에 의한 유세포 분석으로 분류합니다. 모든 세포가 분류되면 원심분리로 세포를 수집하고 RAG1 녹아웃 마우스 수용체에 세포를 주입하기 위해 멸균 PBS에서 10배에서 밀리리터당 6개 세포 농도로 펠릿을 재현탁합니다.

쥐 IL-22 리포터를 생성하기 위해 이식유전자 재조합(transgene recombinationering)을 사용하여 양성 선택 마커와 클로람페니콜 항생제 내성 유전자를 포함하는 IL-22 메뚜기를 운반하는 박테리아 인공 염색체를 변형시켰습니다. tdTomato를 exon1에 도입한 후 신호 펩타이드 염기서열이 중단되어 tdTomato 리포터가 IL-22 발현 세포 내부에 갇히고 유세포 분석을 통한 검출 및 분리가 가능해졌습니다. IL-22 리포터의 충실도를 테스트하기 위해 체외에서 생성된 비장 세포를 유세포 분석과 형광 현미경 모두에서 명백한 IL-22 tdTomato 발현으로 Th22 또는 중성 조건에서 배양할 수 있습니다.

생체 내에서, IL-22 리포터는 항상성 조건하의 다른 마우스 조직에서 대부분의 신호를 감지했으며, 대부분의 신호는 장의 얇은 판판 세포에서 관찰되었지만 겨드랑이 림프절, 비장 또는 흉선에서는 관찰되지 않았습니다. 리포터 CD4 양성 CD45RB 높은 T 세포를 RAG1 녹아웃 마우스로 전달하여 유도된 마우스 대장염 모델에서, tdTomato 리포터는 먼저 장간막 림프절에서 시각화되지만, 최종적으로는 원위 소장 및 결장 조직의 얇은 판막에 축적됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 올바른 BAC 클론을 선택해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 이 리포터 마우스를 사용하여 폐 또는 피부 감염 모델 확립과 같은 다른 방법을 수행하여 숙주 방어 및 조직 복구에서 IL-22의 역할에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 면역학 분야의 연구자들이 이와 같은 마우스 모델을 사용하여 낮은 발현을 나타내는 분비 단백질의 기능을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형질전환 리포터 마우스를 생성하는 방법과 in vitro 및 in vivo에서 IL-22 리포터 유전자를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.