Name: 마우스입니다 관류 신장 기법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 배우세요 마우스 고립 관류 신장 기법으로 신장 기능을 체외에서 분석하는 방법을. 이 기법은 혈압과 호르몬의 영향을 배제하여 급성 신손상 연구에 활용됩니다.

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저자는 귀중한 과학적 조언을 해준 한스-요아힘 슈렉(Hans-Joachim Schurek)에게 감사를 표한다. 저자들은 훌륭한 기술 지원을 해준 Monique Carrel과 Michèle Heidemeyer, 원고를 비판적으로 읽어준 David Penton Ribas와 Nourdine Faresse, NaPi-2a 항체를 제공한 Carsten Wagner와 Jürg Biber에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 스위스 국립 연구 역량 센터(Swiss National Centre for Competence in Research "Kidney.CH")와 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation)의 프로젝트 보조금(310030_143929/1)의 지원을 받았습니다.

이 논문에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 스위스 법률에 따라 취리히, 스위스의 캔톤의 동물 관리의 승인을 실시 하였다. 1. 버퍼 준비 <ol><li> (4)과 항 이뇨 호르몬 (ADH) 용액 (표 1) - 솔루션 (1)을 준비합니다. </li><li> 투석 완충액 (표 1)을 준비한다. 주 : 이것은 재관류 동안 투석 버퍼로서 사용되는 버퍼이다. 나중에, 적혈구 최종 관류 액을 형성하는 버퍼에 희석한다. </li><li> 적혈구 준비. <ol><li> 인간의 적혈구 농축액 투석 버퍼 500 ml의 (지역 혈액 은행에서 얻은 시험 물질) 250 ml에 희석. 8 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 어떤 적혈구를 제거하지 않도록주의, 버퍼를 제거합니다. 배를 반복합니다. </li></ol></li><li> 완충액, 알부민 (BSA 소 혈청 알부민)를 준비한다. <ol><li> dialysi 200 ㎖에서의 버퍼는 교반 막대를 사용하여 BSA의 44g을 녹인다. 필터 종이와 솔루션을 필터링합니다. </li></ol></li><li> 관류를 준비합니다. <ol><li> BSA에 버퍼에 여과지를 통해 단계 1.3.1에서 적혈구를 필터링합니다. 투석 버퍼 800 ML의 총 부피까지 입력합니다. 주 :이 최종 관류이다. 헤마토크릿 이제 8과 12 % 사이 여야합니다. 관류 12 시간까지 4 ℃에서 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 시작 투석 및 산소화 <ol><li> 더 큰 버퍼 저수지, 작은 버퍼 저장하고 촉촉한 챔버를 37 ° C로 (작은, 이중벽 챔버 나중에 신장을 유지하기 위해 37 ° C와 100 % 습도하게) 주변의 물을 욕조를 켜십시오 (그림 2) . </li><li> 투석 버퍼로 큰 버퍼 저수지와 관류와 작은 저수지를 입력합니다. </li><li> 투석 버퍼에 5 % CO에 2 / 95 % O 2 가스 유입을 돌립니다. </li><li> 투석 버퍼에 대한 관류의 연속 투석 전환합니다. 저 유량 투석 튜브를 사용하도록주의하십시오. 3 단계로 진행합니다. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig2.jpg" /> 그림 2 : 관류 회로의 개략도. 반응식은 관류 회로의 주요 구성 요소와 버퍼 흐름의 방향을 나타낸다. 진한 파란색에 둘러싸여 모든 구성 요소는 물 목욕 / 온도 37 ° C로 유지된다. 1 : 재관류 버퍼의 적어도 3 배의 용적의 투석 버퍼 연속 95 % O 2 / 5 % CO 2로 버블 링된다. 2 : 투석 완충액 관류 완충액 연속적 롤러 펌프에 의해 투석 튜브에서 서로에 대해 투석한다. 3 :이 투석, 관류 완충액 9 % O 풍부 인해 2 / 5 % CO 2 및 전해질 농도가 일정하게 유지된다 througho유타 관류. 4 : 롤러 펌프는 신장 방향으로 관류 완충액 추진. 5 : windkessel가 연동 파도를 제거하고 버블 트랩 역할을합니다. 6 : 압력 변환기 (자유롭게 교류의 흐름을 허용하면서 4 (롤러 펌프에 연결)은 지속적인 압력을 유지하기 위해). 7 : 관류 전반에 걸쳐, 신장은 100 % 공기 습도 및 37 ° C의 신장 온도 촉촉한 챔버에 남아 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 3. 수술 1 부 (모든 합자의도를 들어, 그림 3 참조) 참고 : 5-0 수술 스레드를 사용하여 모든 합자를 수행합니다. <ol><li> 복강 내 주사하여 마우스 (0.9 % 염화나트륨에 용해 체중, 20 ㎎ / ㎖ 케타민 및 1 ㎎ / ㎖의 자일 라진 10 μL / g)를 마취. anesth의 충분한 깊이를 확인후방 발 반사의 유무를 테스트하여 ESIA. </li><li> 습한 챔버에서 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 수의사 연고와 눈을 보호합니다. 요추 혈관을 상승 척추 아래 1 ML의 주사기를 놓습니다. </li><li> 가위로 먼저 흉골 개방 피부, 후 복부 근육에 음모 문장에서 중간 개복술을 수행합니다. </li><li> 장을 제거하고 복부에서 마우스 측면의 왼쪽에 놓습니다. </li><li> 결합 조직에서 방광을 확보하고 요관 및 요도 모두를 탐구한다. </li><li> 왼쪽 요관 (합자 I)의 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다. </li><li> 요도 (합자 II) 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다. </li><li> 전체 방광 (합자 III)의 주위에 &quot;올가미&quot;합자를 놓습니다. </li><li> 블래 1 mm의 절개. </li><li> 2cm PE (50) 튜브와 개방을 Cannulate. </li><li> 튜브 주위 닫기 합자 III. </li><li> 합자에서 왼쪽 요관 및 요도의 말단을 잘라. BLAD데르는 이제 자유롭게 이동 오른쪽 요관에 연결되어 있습니다. </li><li> 결합 조직과 지방의 복부 대동맥을 취소합니다. </li><li> 복부 중간 대동맥 결찰 (합자 IV)를 놓습니다. </li><li> 장간막 동맥과 복강 트렁크 (합자 V) 사이의 다이아 프램 아래의 대동맥 주위 합자를 놓습니다. </li><li> 장간막 동맥 (합자 VI)의 주위에 끈을 놓으십시오. </li><li> 직접 오른쪽 아래 왼쪽 신장 동맥 (합자 VII) 위의 대동맥 결찰를 놓습니다. </li><li> 꼬리 정맥 패키지 (맥) (합자 VIII)의 주위에 끈을 놓으십시오. 4 단계로 진행합니다. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig3.jpg" /> 그림 3 : 수술 중에 배치 된 합자의 개략도. 개복술 후 오픈 복부보기. 소장은 왼쪽 밖으로 이동합니다. L 및 R이 좌측 및 우측 신장을 나타낸다. 그만큼검은 색 선은 각각의 봉합사의 면적을 나타낸다. 합자이 먼저 배치하고 텍스트에 주어진 순서에 폐쇄된다. X는 동맥 삽관에 대한 절개의 위치를 표시한다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 관류 회로 4. 프라이밍 <ol><li> 로터리 펌프를 시작하고 관류와 튜브를 입력합니다. 그것에서 모든 공기 방울을 비우주의하십시오. </li><li> 관류 대략 중간 수준에 windkessel 장치를 채 웁니다. </li><li> 모든 튜브가 작성 흐름이 시간 동안 신장 수준에서 관류 바늘을 유지하다 0 0 mmHg로에 압력 변환기 보정. </li><li> 일정한 최소 수준 (0.6 ml / 분)에서 흐름을 유지하고 5 단계로 진행합니다. </li></ol> 5. 수술 2 부 <ol><li> 합자 IV와 왼쪽 레나의 분기 사이에 클램프를 놓습니다리터 동맥. </li><li> 지느러미 벽을 절단하지 않도록주의하면서 합자 IV의 대동맥 꼬리에 작은 절개를합니다. </li><li> 용기와 확장기 대동맥의 팽창 개구. </li><li> 바늘로 대동맥을 Cannulate 단지 클램프로 끝을 밀어 (2cm 길이, PE 50 당겨). </li><li> 클램프를 엽니 다. </li><li> 이 오른쪽 신장 동맥 및 대동맥의 교차점에 도달 할 때까지 바늘 두개쪽으로의 끝을 밀어 넣습니다. </li><li> 닫기 합자 VII. </li><li> 닫기 합자 IV. </li><li> 다이어프램을 해부하여 가위로 가슴을 엽니 다. 하나의 컷으로, 대동맥, 대정맥, 마음과 식물 신경을 분리합니다. 이 단계로, 동물 연속 깊은 마취 빠른 방혈로 희생된다. </li><li> 관류 펌프의 압력 제어를 시작합니다. 80 ~ 100 mmHg의 사이의 평균 압력을 유지한다. </li><li> 닫기 합자 V. </li><li> 닫기 합자 VI. </li><li> 닫기 합자 VIII. </li><li> 결합 tissu 무료 오른쪽 신장전자와 가위로 지방 캡슐로의 삽입. </li><li> V.를 합자하는 근위 대동맥을 잘라 </li><li> VI를 합자하기 위해 원심 장간막 동맥을 잘라. </li><li> 혈관 자체로 절단하지 않도록주의하면서 신장지지 용기 번들을 잘라. </li><li> 신장에 대한 연결에 간을 잘라. 신장을 확보하는데주의를 기울여야하지만, 대정맥이 그것에 의해 개방 유지되도록, 그것에 간 접착의 작은 부분을 둡니다. </li><li> 마우스에서 신장 번들을 가져 가라. 습한 챔버에서 마우스를 제거합니다. </li><li> 간 및 신장 (합자 IX)의 연결 주위에 &quot;올가미&quot;합자를 놓습니다. </li><li> 정맥 라인 (2cm의 PE 50)와 대정 맥을 Cannulate. </li><li> 닫기 합자 IX. 정맥 라인을 통해 정맥 유출을 즉시 시작해야합니다. </li><li> 촉촉한 챔버를 닫습니다. </li></ol> 6. 다운 스트림 분석 <ol><li> 다음 시간 동안 연속적으로 혈류 intravascul 모니터링아칸소 압력 15. 예를 들면 분석을 위해 사용할 수있는 정맥 유출, 신장 레닌 방출 7 수집. 전해질 농도와 사구체 여과율 (14)의 분석을 위해 소변을 수집합니다. 관류 1 시간 후, 신장 서부 블로 팅에 대한 스냅인을 동결 할 수 있습니다 또는 이미지에 대한 고정 (16)에 접근한다. </li></ol>

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없습니다.

관류 신장 절연 마우스 수많은 전신 요인의 영향에 의해 결함이 될 수있다 손상 동물 생체 실험 간의 격차를 1 시간 동안 제어 된 환경 생체 신장 기능을 연구하기위한 도구이고, 시험 관내 실험에서 격리 된 네프론 세그먼트 또는 반드시 기능에 손상 장기 구조의 영향을 무시 배양 된 세포. , 저자의 지식과 대안 기술이 특정 작업을이 수행하지 않는 것입니다. 신장 조직의 생화학 적 연구는, 그러나, 신장 조각 (17)을 이용하여보다 간단한 형태로 수행 될 수있다. 제시된 기술은 현재 신장 생리학을 연구하기 위해 주로 사용되는 동안, 많은 새로운 응용 프로그램이 논의되고있다. 예를 들면, 관류 탈세 포화 및 recellularization 12시 신장 생명 공학에 사용될 수 있습니다. 또한, 이전에 신장의 장기간 정상 체온 관류는 그럴 필요합니다ansplantation, 안티 거부 또는 게놈 편집 관류에 약물이 연구되고있다 고용량의 관리와; 심지...

기관의 고립 된 관류는 수십 년 1 생리 학자들 사이에서 지속적인 노력의 대상이되고있다. 기술은 혈압, 호르몬 또는 신경 조직 등의 영향없이, 기관의 기능을 가능하게 검토한다. 칼 에두아르 Loebell는 1849 2, 고립 된 신장의 성공적인 재관류을 설명했습니다 첫 번째로 간주됩니다. 그 이후로, 관류 장치에 상당한 정련을 실시하고있다. 프레이와 그루버는 지속적인 관류 2 산소와 타악기 펌프 용 인공 폐를 소개했다. 초기 연구는 주로 큰 포유 동물 - 즉, 돼지 2 개 3 쥐 신장의 사용 - 첫번째 보고서, 와이즈 등으로의 신장을 공부하는 동안. , 작은 포유 동물 기관 관류 (4)의 연구에서 획기적인 사건이었다. Schurek 등. 충분한 신 세뇨관 경우 관류에 포유류의 적혈구를 추가의 필요성을보고산소는 5를 달성 할 수 있었다. 장기간 실험 긴급 동일한 연구 그룹 (6)에 의해 버퍼의 연속 투석의 도입이었다. 2003 년 SCHWEDA 등. 나중에 Rahgozar 등에 의해 정제 기능 마우스 고립 관류 신장 (MIPK) 7을보고 처음이었다. 18 Lindell 등의 알. 14. 절연 신장 관류 래트보다 ​​기술적으로 어려운 반면, MIPK의 사용은 유전자 변형 마우스의 다양한 배열의 사용을 가능하게하는 장점을 맺는다. 이 논문은 1 시간 동안 고립 된 마우스 신장 관류에 대한 저자의 방법의 세부 사항을 제공합니다. 상기 방법은 신장 유량 혈관 저항 호르몬 방출 혈액 가스 분석, 소변 분석, 약물의 애플리케이션의 지속적인 평가를 허용한다. 절차에 따라, 신장은, 분자 및 생화학 분석을 위해 처리 할 수있는 현미경에 대한 고정, 또는받는 사람 마우스에 이식 (그림 1). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54712/54712fig1.jpg" /> 그림 1 : 절연 관류 신장에 가능한 입 / 출력의 개요. BGA : 혈액 가스 분석. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 많은 혁신적인 응용 프로그램 (또는 항 거부 또는 게놈 편집 약물의 응용 프로그램없이) 8, 9, 이전 이식에 장기간 정상 체온 신장 관류의 새벽 논의되는 바와 같이이 기술은 가능성, 10, 향후 몇 년에 걸쳐 관심을 증가 받게됩니다 11, decellularized 발판 (12)의 전체 신장의 생명 공학 및 광자 이미징 13 형광 염료의 고용량의 적용 </sup&gt;. 또한 급성 신부전 (14) 중 특정 유전자의 역할을 연구와 이상적인 모델이다. 단계별 프로토콜은 다른 실험실에서 성공적으로 격리 된 마우스 신장 재관류를 수행 할 수 있도록 설명한다. 첫째, 조성물 및 완충액의 제조 지정된다. 그리고, 수술 상세히 설명되며 중요한 단계가 도시되어있다. 셋째, 데이터가 성공적으로 제조 나타내는 것을 제시되어 신장 혈류, 혈관 저항, 사구체 여과율 및 분수 전해질 배설 모두 관류 신장 다른 네프론 세그먼트 형태의 생존 및 투과형 전자 현미경의 기능적 측정 관류의 1 시간 후 고정.

<table><tbody><tr><td>Perfusion Circuit:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moist chamber 834/8</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2901</td><td></td></tr><tr><td>바구니와 사이드 포트가 있는 캐뉼러</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2947</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat TC120-ST5&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-4544</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230V 롤러 펌프 Reglo 아날로그</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 용액용 저류층 재킷 1 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3438</td><td></td></tr><tr><td>완충 용액용 저류층 재킷 0.5 L</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3436</td><td></td></tr><tr><td>압력 트랜스듀서 APT300&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>TAM-D Plugsys 변환기</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-1793</td><td></td></tr><tr><td>SCP Plugsys 서보 컨트롤러</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3717</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB 데이터 수집</td><td>Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>저플럭스 투석기 Diacap Polysulfone</td><td>B.Braun 7203525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대동맥 캐뉼레이션용 PE 튜빙 1.19mm I.D. x 1.70mm O.D.</td><td>과학 상품 Inc.</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>완충 시약:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoplasmal 10%</td><td>B.Braun</td><td>134518064</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P2256-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산 일나트륨염 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1626-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-(-)-말릭애씨드 나트륨염</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1125-25G</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-L-젖산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>L7022-10G</td><td></td></tr><tr><td>알파-케토글루타르산 나트륨염</td><td>시그마-알드리치</td><td>K1875-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td> <td>시그마-알드리치</td><td>S5761-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>60130-1KG</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마-알드리치</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>크레아티닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>C4255-10G</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>로슈</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 * 6H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-글루코스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 * 6H2O&nbsp;</td><td>리델 드 하(Riedel-de-Ha&euml); n</td><td>12074</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-500G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876-500G</td><td></td></tr><tr><td>항이뇨 호르몬 dDAVP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2013-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FITC-이눌린</td><td>시그마-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>필터 적혈구 여과에 사용</td><td>Macherey-Nagel</td><td>MN 615</td><td></td></tr><tr><td>BGA 분석 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ABL 80 플렉스</td><td>복사계 의료 ApS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경 :</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Philips CM100 TEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스입니다 관류 신장 기법

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 이 분리 된 기관 및 관류 신장 생명 공학에 대한 탈세 포화 또는 항 거부 또는 소수 신장에 고용량의 게놈 편집 약물의 투여를 포함한 미래에 가능할 수있다 많은 혁신적인 애플리케이션에 대한 생리 연구를위한 전제 조건입니다 이식. 재관류 시간 동안 신장은 신장 기능이 평가 될 수 있고, 조작, 및 다양한 제약으로 투여 될 수있다. 절차 후 신장 이식 될 수있다 또는 분자 생물학, 생화학 분석, 또는 현미경에 대한 처리. 본 논문은 관류 및 마우스 신장의 생체 외 관류에 필요한 수술 기법에 대해 설명합니다. 관류 장치의 상세에 주어진 데이터는 V를 도시 제시신장의 제조 iability : 형태소 판독 및 분자 판독 상이한 네프론 세그먼트 수송 단백질의 웨스턴 블랏 상이한 네프론 세그먼트 기능, 투과 전자 현미경과 같은 신장 혈류, 혈관 저항 및 소변 데이터.

방법 설명과 함께, 고립 된 마우스 신장은 적어도 1 시간 동안 가능한 남아있을 수 있습니다. 우리는 기능 (신장 혈류 및 혈관 저항 정맥 유출 사구체 여과율 비뇨기 분수 나 + 및 K + 배설 혈액 가스 분석, 소변 삼투압) 및 형태학 (투과형 전자 연속 재관류 1 시간 후 조직 생존력을 시험 야생형 C57BL / 6 마우스의 네 신장 현미경, TEM) 방법. 또한 다른 세관 세그먼트 정점 마커 단백질의 웨스턴 블랏은 동일한 동물 unperfused 신장 관류 절연 신장을 비교 하였다. 모든 실험에서, 정압 관류 ~ 100 mmHg로 (도 4) 관류 압력을 유지 하였다. 이러한 신장, 관류 흐름 및 혈관 저항 신장 중량 3 15.6 ± 0.4 ㎖ / 분 * g에서 55 분의 시간 동안 안정적으로 유지5 ± 1.0 mmHg로 * 분 / ㎖, 각각 (그림 4...

마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 버퍼 수술 기법은 상세하게 설명된다.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 혈압, 호르몬 또는 자율신경계의 영향을 배제한 상태에서, ex vivo 관류 마우스 신장의 단독 신장 기능을 분석하는 것입니다. 이 방법은 신장학의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.분리된 장기 기능에 대한 통찰을 제공하며 급성 신손상을 연구하기 위한 정교한 도구로 활용됩니다. IPK의 주요 장점은 전신적 영향이 없는 상태에서 장기 기능을 연구할 수 있다는 점입니다. 수술을 위해 마우스를 준비한 후, 가위를 사용하여 치골 능선에서 흉골까지 정중선 개복술을 수행합니다.먼저 피부를 절개하고, 이어서 복근을 절개합니다. 다음으로 장을 제거하여 복부 측면의 생쥐 왼쪽에 놓습니다. 이제 결합 조직으로부터 방광을 분리하여 양측 요관과 요도를 노출시킵니다.이 절차들에서는 모든 결찰을 5-0 봉합사로 수행하십시오. 가장 먼저 왼쪽 요관 주위를 결찰합니다. 이를 이중 외과적 매듭으로 단단히 묶으십시오.다음으로, 동일한 기술을 사용하여 요도 주위에 결찰사를 배치합니다. 그런 다음 방광 전체에 올가미 결찰사를 배치하되, 묶지는 않은 상태로 둡니다. 처음 세 개의 봉합사가 배치되면, 안과용 가위를 사용하여 방광에 1 mm 길이의 절개를 가합니다.이 절개 부위에 2 cm 길이의 PE-50 튜브로 만든 캐뉼라를 삽입합니다. 이제 방광을 묶고 있는 결찰사를 조여 캐뉼라를 고정합니다. 방광에 캐뉼라를 삽입한 상태에서, 결찰사보다 원위측에 있는 왼쪽 요관과 요도를 절단합니다.이제 방광은 오른쪽 요관에만 연결되어 있어야 하며 자유롭게 움직여야 합니다. 다음으로, 복부 대동맥 주변의 결합 조직과 지방을 제거합니다. 그런 다음 노출된 대동맥의 중간 지점과, 횡격막 바로 아래의 상장간막동맥과 복강동맥 사이 지점에 결찰사를 배치합니다.이들 각각을 느슨하게 유지하십시오. 다음으로, 상장간막동맥 주변에 결찰사를 배치합니다. 이제 우측 신동맥 바로 아래와 좌측 신동맥 위에 대동맥을 둘러싸는 세 번째 결찰사를 배치하십시오.이것은 7번 결찰사입니다. 마지막으로 미상정맥 패키지를 결찰하십시오. 이제 7번 결찰사와 좌측 신동맥 분지 사이에 클램프를 배치하십시오.그런 다음, 7번 결찰사(ligature)의 미측(caudal) 방향으로 대동맥에 작은 절개를 가하되, 배측 벽(dorsal wall)이 잘리지 않도록 주의하며 혈관 확장기로 절개 부위를 넓힙니다. 절개창에 2cm 길이로 끌어당겨 놓은 PE-50 캐뉼라를 삽입하여 팁이 클램프 안으로 살짝 들어가게 밀어 넣습니다. 그런 다음 클램프를 엽니다.다음으로, 바늘 끝을 우측 신동맥과 대동맥의 분기점에 도달할 때까지 두측으로 밀어 넣습니다. 이제 7번 결찰선을 조이고, 복부 대동맥의 중간 지점에 있는 결찰선을 조입니다. 가위로 횡격막을 절개하여 흉강을 여는 과정을 진행합니다.그런 다음, 한 번의 절개로 대동맥, 대정맥, 심장 및 식물성 신경을 분리합니다. 이제 관류 펌프의 압력 조절을 시작하고 평균 압력을 80에서 100 mmHg 사이로 유지합니다. 이제 대동맥과 꼬리 정맥 다발 주위에 묶지 않고 남겨둔 세 개의 결찰사를 조입니다.가위물을 사용하여 오른쪽 신장을 주변 결합 조직으로부터 분리하고 지방 캡슐에서 떼어냅니다. 상장간막동맥과 복강동맥 사이의 결찰 부위에서 근위부 대동맥을 절단합니다. 다음으로, 상장간막동맥 주위의 결찰 부위에서 원위부 상장간막동맥을 절단합니다.이제 혈관 자체를 절단하지 않도록 주의하며 신장 지지 혈관 다발을 제거합니다. 그런 다음 신장과 연결된 간 부위를 절단하되, 하대정맥이 열린 상태로 유지될 수 있도록 간의 일부를 신장에 부착된 상태로 남겨둡니다. 다음 단계는 마우스에서 신장 다발을 제거하는 것입니다.이제 신장을 챔버에 둔 상태에서 마우스를 제거하십시오. 간과 신장의 연결 부위에 라소 결찰사(lasso ligature)를 배치합니다. 그다음, 하대정맥에 정맥 라인을 이용해 캐뉴레이션을 수행하고 라소 결찰사를 조여 닫습니다.이제 신장이 박스 내에 안정적으로 위치해야 합니다. 정맥 라인을 통한 정맥 유출이 즉시 시작되어야 합니다. 소변 유출은 약 3분 후에 시작됩니다.요관의 연동 운동은 즉시 시작되어야 하며 최소 1시간 동안 안정적으로 유지되어야 합니다. 박스를 닫으십시오. 이제 준비가 완료되었으며, 최소 1시간 동안 생존 상태가 유지되어야 합니다.C57 black 6 마우스에 설명된 방법을 적용한 후, 1시간 동안 지속적인 관류를 수행하여 4개 신장의 조직 생존력을 테스트하였습니다. 압력은 100 mmHg로 일정하게 유지하였습니다. 4개 신장 모두에서 관류액 유량과 혈관 저항이 안정적으로 유지되었습니다.사구체 여과율은 FITC 인울린 클리어런스를 통해 평가되었으며, 이는 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의미하지는 않았습니다. 나트륨 및 칼륨의 분획 배설률은 관류 55분 후에 평가되었습니다. 이러한 파라미터들은 in vivo 상황과 비교하여 증가하였습니다.55분 후, 소변의 몰랄 농도는 정맥 유출물의 삼투압보다 높게 상승하지 않았습니다. 그 후 신장을 고정하고 TEM을 통해 초미세구조를 평가했습니다. 근위세뇨관 S1 분절의 사구체는 대체로 변화가 없는 것으로 나타났습니다.혈관 다발과 인접하지 않은 굵은 오름각의 근위세뇨관 S2, S3 분절 중 일부에서 장기 손상 징후가 나타났으나, 모든 분절에서 나타나지는 않았습니다. 면밀히 관찰한 결과, 원위세뇨관과 집합관에서는 괴사 징후가 보이지 않았습니다. 전반적으로 신장은 쥐의 고립 관류 신장에서 보고된 내용과 일치하였습니다.이 절차 이후, 추가적인 통찰을 얻기 위해 이미징이나 FACS 및 이어서 단백질 또는 RNA 분석과 같은 분석 방법을 조직에 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

국소 빈혈에 의한 급성 신장 손상에 대한 정확한 murine 모델 (아키)는 급성 신장 부상을 조사하고 가능한 신장 부상을 치료하는 치료 도구를 찾는 중요한 도구입니다. 걸려 체중이 시스템은 신장 혼잡을 유발하지 않고 즉각적이고 안정적​​인 신장 동맥 폐색 및 reperfusion위한 도구를 제공합니다.

절연 신장 동맥 폐색에 대한 한깅 - 무게 시스템의 사용

이 비디오에서는 마우스의 후복막 공간에서 신장을 추출하는 절차를 설명합니다. 추출된 신장을 더 미세절개하여 신낭과 주변 지방층이 없는 온전한 신장을 얻을 수 있습니다.

쥐에서 온전한 신장 추출: 쥐 모델에서 신장 캡슐 없이 신장을 얻는 기술

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

우리는 쥐를 받아야하는 중간 및 심한 허혈 - 재관류 신장 손상의 모델을 설명 일방적 신 경 각각 동시 또는 지연 반대측 신장 절제 뒤에 체결. 이러한 모델은 지속적으로 신장 기능 장애 및 사후 부상 섬유증을 야기하지만, 부상 정도와 생존율 마우스 배경, 나이, 수술 장비에 따라 달라집니다.

마우스의 급성 신장 손상 및 사후 상해 섬유증의 허혈 - 재관류 모델

신장 면역 세포를 분리하기 위해 신뢰할 수 있고 효율적인 기술이 다운스트림 응용 프로그램에 필요합니다. 이를 위해서는 소수의 신장 면역 세포에 대한 표면 항체 라벨링이 필요합니다. 여기에서는 이 목표를 달성하는 것처럼 보이는 신장 면역 세포를 분리하는 간결한 방법을 설명합니다.

신장 면역 세포의 신뢰성 및 고효율 추출

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

항체 라벨링, 광학 클리어링 및 고급 광 현미경의 조합은 완전한 구조 또는 장기의 3차원 분석을 가능하게 합니다. 여기에 설명된 간단한 방법은 두꺼운 신장 슬라이스의 면역 라벨링, 에틸 시나메이트와 광학 클리어링, 3차원 신장 구조의 시각화 및 정량화를 가능하게 하는 공초점 이미징을 결합하는 간단한 방법입니다.

면역 표지된 신장 조직의 광학 클리어링 및 화상 진찰

이 논문은 연구자가 장기간의 요관 폐쇄 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 분석할 수 있는 표준화된 모델을 사용하여 마우스에서 가역적 편측 요관 폐쇄를 수행할 수 있도록 하는 자세한 지침을 제공합니다.

장기간의 일측성 요관 폐색의 역전 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 평가하기 위한 마우스 모델

본 글은 단측 신장 IRI를 이용한 허혈성 CKD 모델을 제시하고, 샘플 채취 하루 전에는 반대쪽 신장 절제술을 시행합니다; 이 프로토콜은 혈청 기반 기능 평가, 높은 생존율, 그리고 28일과 42일간의 CKD 병리 재현 가능성을 가능하게 하여, 기전 및 중재적 연구를 위한 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

신장 허혈/재관류 손상에 의해 유도된 급성 신장 질환에서 만성 신장 질환으로의 전환 마우스 모델

마우스에서 오른쪽 신장 절제 후 일측 신장 허혈-재관류 시 신장 미세혈관 혈류 변화를 모니터링하기 위해 레이저 스펙클 대조 영상 시스템을 사용하였습니다.

쥐의 신장 허혈-재관류 손상 중 레이저 반점 조영 영상으로 모니터링되는 미세혈관 관류

배우세요 마우스 고립 관류 신장 기법으로 신장 기능을 체외에서 분석하는 방법을. 이 기법은 혈압과 호르몬의 영향을 배제하여 급성 신손상 연구에 활용됩니다.

마우스입니다 관류 신장 기법

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