Name: 에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여 체외 암 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 RNA 시퀀싱을 활용한 약물 저항 관련 비정상 스플라이싱 변이 검출 방법을 체외 암 모델에서. 이 기법은 전사체 분석과 세포독성 스크리닝을 결합하여 화학요법 저항 메커니즘을 규명하고 조기 발견을 개선합니다.

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저자는 이 연구에 사용된 저항성 세포주를 제공한 J.J. McGuire 교수, R. Kofler 교수 및 K. Quint 박사에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 암스테르담 암 센터(CCA) 재단(JC, EG 및 RS), KiKa(AW를 위한 아동 암 무료 보조금) 재단, 중피종 응용 연구 재단(VEG 및 EG)의 Peter G. Angelos 법률 사무소 보조금, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro(AIRC), Istituto Toscano Tumori(ITT)의 보조금으로 설립되었습니다. 및 Regione Toscana Bando FAS Salute (EG에게).

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여기에서 우리는 약물 내성과 관련하여 차동 접합 이벤트를 식별하는 분석을 잘 확립 된 세포 독성 스크리닝 기술과 강력한 NGS 기반 transcriptomic을 결합하는 새로운 접근 방식을 설명합니다. 분광 분석은 시험 관내 암 모델에서 약물 민감도를 평가하기 편리하고 강력한 높은 처리량 방법이며, 세포 독성 검사를 수행하는 많은 실험실에 대한 첫 번째 선택을 나타냅니다. 이 방법에 대한 문제 해결뿐만 아니라 가능한 변형은 광범위하게 다른 곳에서 4,5 설명했다. 높은 처리량 게놈은 현재 특정 약제 내성 표현형과 관련된 유전자의 발현 추정 약물 내성 메카니즘의 SNP 검출에 주로 의존 살펴 차동 사용 분석한다. 본 연구에서는 정확한 mRNA의 성적 증명서의 주석 및 DIF의 검출을위한 강력한 생물 정보학 파이프 라인과 함께, RNA 시퀀싱 방법의 사용을 설명ferential 접합. 기술 된 프로토콜의 특히 중요한 특징은 별개의 약물 감도 프...

암 치료, 화학 요법에 대한 종양 세포의 내성 중 진성 또는 장기간 약물 노출시 획득 상당한 발전에도 불구하고, 백혈병 및 고형 종양 1 광범위한 치료 실패의 주요 원인이다. 시험관 세포주 모델 약물 내성의 기초가되는 메커니즘을 묘사하기 위해 화학 요법 제에 내성 암세포의 선택에 의해 단계적으로 개발된다. 이 절차는 임상에서 사용 된 체제를 모방하고, 따라서 적절한 저항 메커니즘 깊이 조사를 허용한다. 치료 후에도 내성 세포를 세포 생존력 / 세포 독성 분석 (2)를 사용하여 부모 감수성 세포와 구별된다. 일차 세포의 시험 관내 약물 내성 프로파일 화학 요법에 대한 임상 적 반응 (3)에 크게 관련이있는 것으로 밝혀졌다. 높은 처리량 cytotoxicity 분석법은 시험관 내에서 약물의 감도를 결정하는 편리한 방법을 구성한다. 여기서, 세포의 생존 능력에 의해 평가되어 예를 들면, 3- [4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 - 즉 특정 기판의 대사 전환 (에 기초 MTT 분석법 4, 따라서 세포의 미토콘드리아 활성을 반영 컬러 제품에 테트라 졸륨 염). 대안 적으로, 세포의 단백질 함량은에 sulforhodamine B (SRB) 검정을 이용하여 5 정량화 할 수있다. 여기서, 생존 세포의 수의 필요없이, 분광 광도계에 적합한 파장에서 측정 된 광학 밀도 (OD)에 비례 광범위하고 시간이 걸리는 셀 카운팅 절차. 소정의 화학 요법 약물에 의해 유도되는 성장 억제는 세포가 시험 제제로 처리하고, 처리되지 않은 대조군 세포의 OD와 비교하고있는 웰의 OD에 기초하여 계산 될 수있다. 용량 - 반응 곡선이다 obta세포를 제어 할 상대 생존 세포의 비율에 비해 약물 농도를 플로팅 리트에 의해. 마지막으로, 약물 감수성은 미처리 세포 (IC 50)에 비하여 세포 성장의 50 % 저해를 초래 농도로서보고 될 수있다. 약제 내성의 기초가되는 메카니즘은 약물 활성 및 세포 대사의 결정 인자의 유전자 발현에 영향을 미치는 변경 등 여러 가지 이상을 포함한다. 돌연변이, 수차 전사에서와 전사 후 수준뿐만 아니라 방해 후생 유전 학적 조절을 포함하여이 분자 병변은 종종 약물 대사 또는 세포 사멸 6 중 관련된 유전자에 영향을 미칩니다. 대체 사전 mRNA의 접합과 복잡한 규제는 최근 암 세포 (7)의 약물 내성을 지시 할 수있는 새로운 개체로 주목을 받았다. 인간 유전자의 95 %까지 이러한 대안의 수단에 의해 정상 세포에 접합되고동일한 유전자에서 다양한 단백질 이소 형을 생성 단단히 조절 방법. 대체 접합은 종종 암에 규제가 완화되고, 여러 종양은 약물 대사 (즉, 데 옥시 시티 딘 키나제, folylpolyglutamate 합성, 또는 다제 내성 단백질) 6,8에 관여하는 유전자의 증가의 변형 접합을 특징으로한다. 그러나, 약제 내성 세포의 접합 프로파일의 포괄적 인 분석을 고통스럽게 부족하다. 따라서, 대안적인 스 플라이 싱 분석을위한 높은 처리량의 방법을 개발하는 것이 필수적이다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 개발하는 데 도움이 될. 지난 10 년간 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술의 급속한 발전은 유전자 발현의 조절 및 다양한 생물학적 과정 (9)에서 자신의 역할을 지배하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력과 생물 의학 연구를 강화하고있다. RNA 시퀀싱 (RNA-SEQ)는 강력한 서브 프로그램이고transcriptomics의 분야에서 NGS의. 그것은의 miRNA, siRNA를, 및 기타 소형 RNA를 (정량적)을 동시에 수천 개의 유전자의 발현 패턴의 게놈 전체의 프로파일 링을 허용하고도 새로운 코딩의 mRNA의 특성에 적합 아니라 긴 비 코딩 RNA이다 클래스 (예를 들어, snRNA와 피르) 10, 11. RNA-SEQ 사체는 특성 (예를 들면, 생거 시퀀싱 및 발현 마이크로 어레이)에 대한 이전의 기술에 비해 많은 장점을 갖는다. 그것은 기존의 게놈 주석에 기초하지 않고, 그 해상도의 단일 뉴클레오티드 레벨을 가지며 그 발현 량 추정을위한 넓은 동적 범위를 갖는다. 간단히, RNA-SEQ 실험의 기본 실험 워크 플로우의 cDNA 라이브러리 건설 그리고 마지막으로, 대규모 병렬 깊은 시퀀싱 (12, 13)로 변환 한 다음 폴리아 데 닐화 성적 증명서 (mRNA를) 선택과 분열로 구성되어 있습니다. 때문에 sequencin의 급격한 하락지난 몇 년 동안, RNA-SEQ 위에 g 비용이 점차 다른 기술을 대체하고, 상당한 노력은 라이브러리 제조 프로토콜을 향상시키기 위해 이루어지고있다. 예를 들어, 옥시 우리 딘 트리 포스페이트 (dUTP를)하고, 이전의 PCR로 증폭, 우라실-DNA-glycosilase (UDG)로 표시 가닥을 소화와 두 번째 가닥 cDNA를 표시하여 mRNA의 성적 증명서의 가닥 정보를 유지하는 것이 가능하다. 이 프로세스는 발현 14,15 유전자 주석 및 추정의 정확도를 향상시킨다. 분석 및 RNA-서열 데이터의 해석은 생물 정보학 파이프 라인 16, 17 내에서 복잡하고 강력한 계산 소프트웨어 패키지 및 처리가 필요합니다. 우선, 원료는 엄격한 품질 기준에 도달하지 않는 서열을 기술 및 생물 인공물을 제거하고 폐기 (트리밍)에서 품질 관리를 거쳐 판독한다. 이어서,이 기준 게놈 맵핑 및 각 인덱싱 된 샘플 읽기유전자 수준, 엑손 수준, 또는 성적 증명서 수준에 순서대로 각 카테고리의 풍요 로움을 확인합니다. 애플리케이션에 따라, 정제 된 데이터는 대립 유전자 - 특이 적 발현, 대체 접합 유전자 융합체 및 단일 염기 다형성 (SNP가) (12)의 식별을위한 통계 모델을 통해 계산된다. 마지막으로, 선택된 레벨 (즉, 유전자 발현 또는 대체 스 플라이 싱) 차등 분석은 다양한 조건 하에서 얻어진 샘플과 비교하기 위해 사용될 수있다. 차동 접합 분석은 두 샘플 사이의 스플 라이스 사이트 사용의 차이를 설명합니다. 이 목적에 전념 소프트웨어 패키지의 증가는 다른 통계 모델, 성능 및 사용자 인터페이스 (18)에 따라 사용할 수 있습니다. 이 중, 매트 (성적 증명서 접합의 다변량 분석) 베이지안 통계 프레임 워크를 기반으로 자유롭게 사용할 수 있으며 정확한 계산 도구로 나온다과 diffe를 감지하도록 설계단일 또는 쌍으로 최종 RNA-서열 데이터 중 하나에서 rential 접합 이벤트. 정렬 (.bam) 파일에서 시작, 매트 대체 접합 이벤트의 모든 주요 유형을 검색 할 수 있습니다 (엑손 스키핑, 대안 3 &#39;스플 라이스 사이트, 다른 5&#39;스플 라이스 사이트, 상호 배타적 인 엑손과 인트론 보존 - 또한 그림 1 참조). 첫째, 소프트웨어 식별 인스턴스 엑손 스킵, 특정 스플 라이스 이벤트를 지원하는 판독하고, 두 종류로 분류한다. 조사 된 엑손 내에서지도 및 특정 엑손 두 업스트림 및 다운 스트림 측면 엑손 사이의 접합에 걸쳐 (정식 스플 라이스 이벤트) &quot;에 포함될 읽습니다&quot;. 두 측면 엑손 간의 접합부에 걸쳐 (대체 접합 이벤트) &quot;스킵 읽기&quot;. 그 후, 매트는 모두 정규 및 대체 이벤트에 대한 정규화 된 포함 수준을 반환하고 샘플 또는 조건 사이의 값을 비교합니다. 궁극적으로는 P-값 a를 계산ND 잘못된 탐색 비율 (FDR)은 두 상태 사이의 유전자 변형 비의 차이는 각각의 스 플라이 싱 19,34 이벤트에 대해 주어진 사용자 정의 임계 값을 초과한다고 가정. RNA-SEQ와 함께 차동 플라이 싱 분석에 따라, 광범위한 실험적인 검증이 참 양성 유전자 후보 (18)를 식별하기 위해 보장된다. 정량적 역전사 - 중합 효소 연쇄 반응 (QRT-PCR)은 RNA 서열 분석-20에서 얻은 후보 확인에 가장 일반적으로 사용되는 최적의 방법이다. 본 연구의 목적은 고형 종양과 혈액 악성 종양의 약물 내성 관련 접합 프로파일을 조사 할 수있는 강력한 방법을 제공하는 것이다. 우리의 방법은 약제 내성에 관여 후보 유전자의 확인을 위해 설립 QRT-PCR 방법과 조합하여 약제 내성 암 선택된 세포주 모델 RNA-SEQ 기반 사체 프로파일을 이용한다. (21, 22)와 메토트렉세이트 (MTX) 모성 서브 라인 CEM / R30dm 23. GC를하고 MTX에 기초하여 현재 요법의 경우 약 90 %가 임상적인 이점을 수립했지만, GC 저항의 출현은 아직 불분명 분자 메커니즘 미해결 문제를 나타낸다. GC 강한 서브 클론을 분리, CEM-WT 세포는 2 ~ 3 주 동안 1 μM의 덱사메타손 (덱스)에서 배양 하였다. MTX 내성 서브 라인 CEM / R30dm 반복 단기 (24 시간) 임상 프로토콜의 모방으로 30 μM MTX에 CEM-WT 세포의 노출을 통해 개발되었다. 흥미롭게도,이 세포주는 또한기구가 완전히 이해되지 않은 덱스에 교차 내성 (미공개 결과)을 표시. 고체 다치또는 본 연구에서 조사 모델은 화학 요법과의 특별한 불응 악명 췌장 도관 선암이다. 이를 위해 Panc-1 세포주 및 약물 (24)의 1 μM 연속 배양에 의해 얻어진 그 타빈 내성 서브 클론 Panc-1R를 선택했다. 여기에서는 세 개의 프로토콜을 결합하여 체외 약물 내성 근본적인 새로운 메커니즘을 발견하는 방법을 설명합니다 비색 독성 분석법에 관련된 신규 스플 라이스 변이체를 식별 백혈병 세포 및 고형 종양, RNA-SEQ 기반 파이프 라인에서 암 세포에 약물 감수성을 평가 약물 감도 / 저항과 RT-PCR 및 QRT-PCR 분석은 잠재적 인 후보의 유효성을 검사합니다.

<table><tbody><tr><td>설포르호다민 B</td><td>시그마-알드리치</td><td>230162</td><td></td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>251399</td><td></td></tr><tr><td>CCRF-CEM</td><td>ATCC, 머내서스, 버지니아, 미국</td><td>ATCC CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>Panc-1</td><td>ATCC, 머내서스, 버지니아, 미국</td><td>ATCC CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고혈당</td><td>Lonza, Basel, Switzerland</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 및 송아지 혈청</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>758093</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 스트렙토마이신 황산염</td><td>Gibco, Carlsbad, CA, USA</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>MTT formazan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2003</td><td></td></tr><tr><td>Anthos-Elisa-reader 2001</td><td>Labtec, Heerhugowaard, 네덜란드</td><td></td><td>UV-Vis 96웰 플레이트 분광 광도계</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96웰 플레이트</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M0812-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution 100 ml</td><td>Lonza, Basel, Switzerland</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 플라스크 25 cm2</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, 독일</td><td>82051-074</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 플라스크 75 cm3</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(NaCl 0.9%)</td><td>B.Braun Melsungen AG, 독일</td><td>362 3140</td><td></td></tr></tbody></table>

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 rna 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

약물 내성은 혈액 학적 악성 종양 및 고형 종양 모두 암의 치료에서 주요 문제로 남아있다. 극한 후천적 내성이 증가 된 약제를 포함 제거 메커니즘들에 의해 야기 될 수 있고, 약물 흡수, 불 활성화 약물 및 약물 표적의 변경을 감소시켰다. 최근 데이터는 다른 이상이 잘 알려진 유전자 (돌연변이, 증폭) 및 후생 유전 학적 (DNA 메틸화, 히스톤 번역 후 변형) 개조로, 약제 내성 메커니즘도 스 플라이 싱 수차에 의해 조절 될 수 있음을 보여 주었다. 이것은 더 효과적인 치료 방법을 계획하기 위해 미래의 관심을받을 자격이 조사 빠르게 성장하는 분야입니다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사 대상으로합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열 및 설정을 통해 체외 모델에서 여러 가지의 transcriptomic 프로필을 분석에드 QRT-PCR 기반의 방법은 후보 유전자의 유효성을 검사합니다. 특히, 우리는 DDX5와 PKM 성적 증명서의 차동 스 플라이 싱을 평가 하였다. 계산 도구 매트에 의해 검출 된 비정상적인 스 플라이 싱은 다른 DDX5 스플 라이스 변종은 부모의 대 내성 세포에서 발현되는 것을 보여주는, 백혈병 세포에서 확인되었다. 이러한 세포에서는,도 타빈 노광에 의한 약제 내성의 다른 메커니즘을 제안 부모 Panc-1 세포에 비해 Panc-1 타빈 강한 상대 검출되지 않았다 높은 PKM2 / PKM1 비를 관찰 하였다.

프로토콜에 기술 된 세포 독성 분석법은 시험관 내에서 화학 요법 제에 암세포의 내성을 평가하기위한 안정적이고 강력한 방법을 제공한다. CEM / R30dm, CEM-R5와 CEM-C3 다음 MTT 분석에 의해, 덱스에 감도는 덱스에 민감한 부모의 CEM-WT 세포를 포함하여 4 개의 T-ALL 세포주, 3 덱스 강한 서브 라인에서 산출 된 것입니다. 및 덱스 내성 세포주 (640 μM - 0.33 ㎚) - 두 개의 다른 농도 범위는 CEM-WT 사이의 감도에 큰 차이 (0.97 nM 내지 2 μM)로 인해 사용할 수 있었다. MTT 분석 명확 CEM-에 비해 CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 μM), CEM-R5 (IC 50&gt; 640 μM) 및 CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 μM)에서 덱스 저항을 보였다 WT 세포 (IC (50) = 0...

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 고형암 및 혈액암의 인비트로(in vitro) 모델에서 비정상적 스플라이싱과 약물 내성 프로파일 사이의 연관성을 조사하는 것입니다. 이 방법은 전사 후 단계에서 약물 내성의 근저에 있는 메커니즘은 무엇인가와 같이 분자 약리학 및 화학요법 내성 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 잘 확립된 세포독성 스크리닝 프로토콜을 강력한 차세대 염기서열 분석 기반의 전사체 분석과 결합했다는 점입니다.이 기술은 화학요법 실패의 기저에 있는 분자적 메커니즘에 대한 더 나은 이해로 이어질 수 있으며, 약물 내성의 조기 발견을 개선할 것입니다. 이 방법은 세포주 모델에서 약물 내성을 결정하는 게놈 전반의 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 일차 환자 샘플 및 제노그라프트와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.이 실험 절차의 시연은 암 센터 암스테르담(Cancer Center Amsterdam) 연구소의 기술자인 Johan Fomirno가 맡았습니다. 백혈병 세포에 대한 MTT assay를 수행하려면 96-well 평저 실험 플레이트를 준비하십시오. 약물 농도별, 대조군 세포 및 세포가 없는 대조군 배지를 위한 well을 각각 지정하십시오.dexamethasone(또는 dex)의 약물 희석 범위를 준비합니다. 각 dex 희석액 30 µL를 96-well plate의 적절한 well에 분주합니다. 이때 각 농도당 3회 반복(triplicate)으로 포함되었는지 확인하십시오.지수 성장기(exponentially growing)의 백혈병 세포를 수확하여 최적의 분주 농도로 재부유합니다. 약물 용액 또는 성장 배지가 들어 있는 각 웰에 세포 현탁액 120 µL를 첨가하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 배양합니다. 배양 단계가 끝나면, 반복 피펫을 사용하여 각 웰에 MTT 시약 15 µL를 첨가합니다.플레이트 쉐이커를 사용하여 분당 최대 900회 속도로 5분 동안 플레이트를 흔들어 줍니다. 플레이트를 37°C, 5% carbon dioxide 조건의 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣고 4~6시간 동안 더 배양합니다. 배양 후에는 포르마잔(formazan) 결정이 완전히 재부유되었는지 확인하십시오. 흡광도 값은 화합물의 적절한 가용화 여부에 따라 달라지기 때문입니다.산성화된 isopropanol 150 µL를 각 웰에 추가하고, multichannel pipette으로 잘 섞어 모든 formazan 결정을 완전히 재부유시킵니다. microplate reader를 사용하여 540 nm와 720 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하며, 배경 OD를 보정하여 정확한 측정값을 확보합니다. 췌장암 세포에 대한 SRB assay를 수행하려면 96-well flat bottom 실험 플레이트를 준비합니다. exponential phase에서 성장 중인 췌장암 세포를 multichannel pipette을 사용하여 100 µL의 배지 내 적절한 밀도로 96-well flat bottom 플레이트에 3반복으로 분주합니다.세포가 플레이트에 적절히 부착되도록 배지만 포함된 웰에 배지 100 µL를 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 각 희석액 100 µL를 96-웰 플레이트의 적절한 웰에 분주합니다. 이때 각 농도당 3반복(triplicate)으로 준비하십시오.37 °C, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 배양합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 각 웰에 차가운 TCA 용액 25 µL를 첨가합니다. 플레이트를 4 °C에서 최소 60분 동안 배양하여 단백질을 침전시키고 웰 바닥에 고정합니다.배지를 제거하여 플레이트를 비우고 티슈로 짧게 건조합니다. 플레이트를 비우고 상온에서 건조하기 전, 수돗물로 5회 세척합니다. 반복 분주기(repetitive pipette)를 사용하여 웰당 50 µL의 SRB 용액을 첨가하고 상온에서 15분 동안 염색합니다.그다음, SRB 염색약을 제거하여 플레이트를 비웁니다. 1% acetic acid로 플레이트를 4회 세척한 후, 플레이트를 비우고 실온에서 건조시킵니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 150 microliters의 Tris 용액을 첨가하고, 플레이트 셰이커에서 최대 분당 900회 진동으로 3분 동안 혼합합니다.540 nanometers에서 흡광도를 측정합니다. 샘플을 300 times g에서 3분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 시판되는 실리카 멤브레인 스핀 컬럼을 사용하여 총 mRNA를 추출합니다.UV-Vis 분광광도계를 사용하여 총 RNA의 농도와 순도를 측정합니다. 시퀀싱 라이브러리를 제작하기 위해 샘플당 2 µg의 총 mRNA를 사용하십시오. 제조사의 지침에 따라 mRNA 라이브러리 제작 프로토콜을 수행하십시오.바이오분석기(bioanalyzer)를 사용하여 라이브러리를 단일 샘플에 풀링하여 최종 농도가 10 nanomoles per liter가 되도록 조절한 후, 싱글 리드(single read) 100 base pair 모드의 고처리량 시퀀싱 시스템을 사용하십시오. 모든 프라이머는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 설계하십시오. 1차 가닥 cDNA 합성을 위해, 멸균수로 1:5 희석한 반응 완충액 내의 200 units per microliter Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 사용하여 분리된 1 microgram의 RNA를 cDNA로 역전사하는 과정을 설정하십시오.RT-PCR 반응을 수행하려면, cDNA 1 µL를 PCR 반응 혼합물에 첨가하고 튜브를 열 순환 장치(thermocycler)에 넣습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로그램을 실행하십시오. PCR 완료 후, 샘플을 1% agarose 겔에 로딩하고 전기영동 시스템에서 TBE 버퍼를 사용하여 100 V로 약 30분 동안 겔을 실행합니다.교차 오염을 방지하기 위해 qRT-PCR 분석을 수행하는 동안 필터 팁을 사용하십시오. qRT-PCR을 수행하려면 검출하고자 하는 각 특정 스플라이스 변이체와 하우스키핑 유전자에 대해 시아닌 그린(cyanine green) PCR 반응 혼합물을 준비하십시오. 화이트 96-웰 플레이트에 마스터 믹스를 분주하고 각 샘플에 대해 이중항(duplicates)으로 준비하십시오.플레이트를 써모사이클러(thermocycler)에 넣기 전, 각 믹스에 물로 10배 희석한 cDNA 5 µL를 추가합니다. 여기에는 백혈병 세포에 대한 MTT 분석과 췌장암 세포에 대한 SRB 분석으로 측정된 성장 억제 곡선이 나타나 있습니다. 덱사메타손 내성 및 젬시타빈 내성 세포의 곡선은 모세포인 감수성 세포와 비교하여 성장 억제가 일어남을 나타내며 오른쪽으로 이동해 있습니다.모든 세포주에 대한 cDNA 라이브러리의 농도와 품질은 bioanalyzer DNA 칩으로 측정합니다. 전기영동도는 약 300 base pairs에서 형광 피크를 나타내며, 이는 후속 RNA sequencing 절차에 적합한 우수한 품질임을 보여줍니다. 후보 유전자인 DDX5의 short reads는 연결선이 splice junction을 나타내는 Sashimi plot으로 시각화할 수 있습니다.DDX5 전사체는 글루코코르티코이드 저항성 세포주인 CEM-C3 및 CEM-R5와 비교하여, CEM 야생형 및 CEM/R30dm 세포에서 엑손 12의 차별적 사용을 보입니다. RNA 시퀀싱 결과는 선택된 유전자에 대해 RT-PCR을 수행함으로써 검증되었으며, 이때 프라이머 쌍은 선택적 스플라이싱이 일어나는 엑손의 상류 및 하류에 위치한 엑손을 대상으로 하였습니다. 여기에서는 DDX5 유전자의 차별적 스플라이싱을 보여줍니다.아이소폼 특이적 역전사 프라이머를 이용한 qRT-PCR 분석을 통해 차등 스플라이싱된 전사체를 정량화함으로써, DDX5 delta exon 12 스플라이스 변이체의 특이적 하향 조절과 특이적 글루코코르티코이드 저항성 하위 세포주를 확인합니다. 이 기술을 숙달하면 3~4주 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 분해를 방지하기 위해 RNA 샘플을 얼음 위에 보관하는 것이 중요합니다.본 절차 이후, 새로운 스플라이스 변이체의 이소성 과발현과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 대체 스플라이싱 프로파일이 약물 내성에 미치는 기능적 영향과 같은 추가적인 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 기술은 분자 약리학 분야의 연구자들이 약물 내성의 전유전체 결정 요인을 탐색할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

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연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

이 프로토콜은 화학 요법 치료 후 대체 접합 조절에서 특징이 없는 기능을 가진 단백질의 역할을 평가하기 위한 신속하고 유용한 도구를 제공합니다.

E1A 미니진 도구를 사용하여 mRNA 접합 변화를 연구합니다.

대체 스플라이싱(AS) 및 대체 폴리아데닐화(APA)는 전사체 이소형과 그 생성물의 다양성을 확장합니다. 여기에서는 실험 조건에 따라 다양한 AS 및 APA를 검출하고 시각화하기 위해 벌크 RNA-seq 및 3' 말단 시퀀싱 분석을 분석하는 생물정보학 프로토콜을 설명합니다.

RNA-seq 데이터에서 대체 스플라이싱 및 폴리아데닐화 식별

이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.

접합 효율 모니터링을 위한 기자 기반 셀룰러 분석

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 RNA 시퀀싱을 활용한 약물 저항 관련 비정상 스플라이싱 변이 검출 방법을 체외 암 모델에서. 이 기법은 전사체 분석과 세포독성 스크리닝을 결합하여 화학요법 저항 메커니즘을 규명하고 조기 발견을 개선합니다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여

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