TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

이 절차의 전반적인 목표는 세포 수가 적은 샘플을 준비하여 효율적이고 재현성 있는 방식으로 TEM 분석을 수행하는 것입니다. 이 방법은 생물 의학 분야에서 실제 세포의 모든 구조와 더 나은 생리학적 환경을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 낮은 세포 수에서 재현 가능한 방식으로 정성적 및 정량적 결과를 모두 얻을 수 있다는 것입니다.

시작하려면 사실을 사용하여 10, 000개의 조혈 줄기 세포 또는 HSC를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 분류합니다. 600 마이크로 리터의 isocoves 수정 dulbecco 매체를 10 % FBS로 포함합니다. 스윙 아웃 버킷이 있는 원심분리기를 사용하여 정렬된 HSC를 10분 동안 1, 000회 G로 회전시킵니다.

이방인 흡인을 사용하여 200마이크로리터를 제외한 모든 매체를 제거합니다. 세포를 고정하기 위해 새로 준비한 2개의 X 고정 용액 0.2mL를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로 600마이크로리터의 0.1몰 카코딜레이트 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다.

이번에는 섭씨 30도에서 세포를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 원심분리 후 200마이크로리터의 완충액을 제외한 모든 버퍼를 제거하고 카코딜레이트 버퍼에 2밀리리터당 2밀리그램의 에반스 블루 200마이크로리터를 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 세포를 염색합니다. 600마이크로리터의 0.1몰 카코딜레이트 완충액을 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 세포의 현탁액을 0.5mL 튜브로 옮기기 전에 나머지 200마이크로리터의 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다. 이 단계에서 펠릿이 튜브에서 보여야 합니다. 탁상용 분리기로, 1, 000 시간 G에 10 분 동안 세포를 회전

그런 다음 이제 보이는 작은 세포 펠릿을 방해하지 않고 완충액을 부드럽게 제거하고 튜브에 50마이크로리터의 완충액을 남깁니다. 15mL 튜브에 5ml의 0.1몰 카코딜레이트 완충액에 200mg의 저융점 아가로스를 첨가하여 4% 아가로스 용액을 준비합니다. 100mL 유리병에 담긴 끓는 물에 튜브를 옮겨 아가로스를 녹입니다.

200마이크로리터의 아가로스 용액을 세포 현탁액의 튜브에 추가합니다. 즉시 1, 000 회 G, 30 °C에서 10 분 동안 원심 분리하십시오. 세포가 튜브 바닥의 반고체 아가로스로 펠릿화되는 것을 확인한 후 즉시 튜브를 섭씨 4도 또는 얼음으로 20분 동안 옮겨 아가로스를 응고시킵니다.

27 게이지 바늘을 사용하여 세포 펠렛을 포함하는 응고된 아가로스를 0.1 몰 카코딜레이트 완충액이 포함된 35mL 플라스틱 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 메스 트림으로 세포 펠릿을 포함하는 응고된 아가로스를 약 1-2mm의 한 조각으로 만듭니다. 그런 다음 새 1.5mL 튜브에 옮깁니다.

600마이크로리터의 0.1몰 카코딜레이트 완충액을 추가하고 피펫을 사용하여 완충액을 추가 및 제거하여 아가로스 세포 펠릿을 세척합니다. 아가로스 세포 펠릿에서 완충액을 제거하고 흄 후드에 보호복과 장갑을 착용한 상태에서 1%사산화오스뮴 용액 1ml를 추가합니다. 세포 펠릿을 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 샘플을 세 번 세척하십시오. 뚜껑이 있는 20mL 유리 섬광 바이알에 옮깁니다. 다음으로 에탄올 계열을 사용하여 샘플을 탈수합니다.

그런 다음 에탄올에 있는 LX 112 수지의 농도를 증가시켜 시료에 침투시킨 후 100% 수지에서 매번 60분 동안 두 번 배양합니다. 겸자를 사용하여 샘플을 피라미드 팁 모양의 고무 몰드의 바닥으로 조심스럽게 옮기고 샘플 위에 순수한 수지를 추가하여 몰드를 채웁니다. 시료를 섭씨 60도에서 72시간 동안 배양하여 수지를 중합합니다.

수지가 중합되면 고무 몰드를 비틀어 몰드에서 제거합니다. 작은 검은색 세포 클러스터가 중합된 수지 피라미드에서 볼 수 있어야 합니다. 시아노아크릴레이트를 사용하여 중합된 수지 피라미드를 절단을 위한 장착 실린더에 부착합니다.

초박 절기에 블록을 장착한 후 면도날과 다이아몬드 나이프를 사용하여 피라미드 블록을 다듬고 블록의 상단과 하단이 서로 평행하고 측면이 균일하게 각도를 이루는 짧고 넓은 사다리꼴 모양을 만듭니다. 그런 다음 다이아몬드 나이프를 사용하여 셀 펠릿 주위의 블록을 다듬고 셀 펠릿 아가로스 조각 주위의 플라스틱 부분을 제거합니다. 초박 절편기로 1마이크로미터 단면을 자르고 속눈썹 도구와 금속 고리를 사용하여 수상 보트에서 유리 슬라이드로 단면을 이동합니다.

그런 다음 슬라이드를 섭씨 37도의 핫 플레이트에 올려 건조시킵니다. 0.22 마이크로미터 필터가 있는 주사기를 사용하여 섹션에 텔루아틴 블루 용액 한 방울을 넣고 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 증류수로 슬라이드를 올리고 섹션을 말리십시오.

건조 후 광학 현미경으로 절편을 확인하여 세포의 위치를 식별합니다. 다음으로 다이아몬드 나이프를 사용하여 매우 얇은 부분을 자릅니다. 그런 다음 속눈썹 도구를 사용하여 2-3개의 섹션을 수상 보트에서 200개의 메쉬 그리드로 이동하고 유리 페트리 접시에 넣습니다.

그리드가 있는 접시를 섭씨 30도의 핫 플레이트에 30분 동안 옮겨 섹션을 건조시킵니다. 1%우라닐 아세테이트 방울을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 그리드를 염색합니다. 그런 다음 증류수를 사용하여 6-8회 헹굽니다.

Reynolds 납 시트르산염을 실온에서 5분 동안 헹구고 6-8회 헹굽니다. 그리드가 들어있는 유리 페트리 접시를 섭씨 37도의 핫 플레이트로 옮겨 섹션을 건조시킵니다. 마지막으로 87킬로볼트에서 전자 현미경으로 단면을 분석합니다.

여기에 저배율로 표시된 것은 세포 클러스터를 확인하는 작은 세포 펠릿을 포함하는 블록의 반박형 톨루이딘 블루 염색 절편입니다. 이 고배율 이미지는 세포의 온전한 형태를 보여줍니다. 이 그림은 우라닐 아세테이트와 구연산납으로 염색하고 전자 현미경을 사용하여 분석한 초박형 절편에서 세포 클러스터의 오버 뷰 필드를 나타냅니다.

여기에 표시된 것은 세포의 형태와 초구조가 잘 보존되었음을 보여주는 단일 HSC입니다. 개별 HSC의 더 높은 배율, 매우 상세한 전자 현미경 사진은 세포 내 초미세 구조를 보여줍니다. 또한 고배율 이미지는 미토콘드리아와 같은 세포 내 소기관의 잘 보존된 구조와 무결성을 포착했습니다.

이 기술은 일단 숙달되면 5-6시간 내에 수행할 수 있으며, 고급 블루 염색 및 아가로스 임베딩의 경우 일반 TEM 처리는 제대로 수행되면 5-6일이 소요됩니다. 따라서 이 동영상을 시청하고 나면 TEM 분석을 위해 실제 세포 전처리에서 샘플을 준비하는 방법을 잘 이해하게 되었습니다.