Name: TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 배우세요 저세포 수 샘플을 TEM 분석을 위해 준비하는 효율적이고 재현성 있는 방법을. 10,000개의 조혈모세포를 사용하여 세포 구조를 정성적·정량적으로 분석하고 생물의학 연구에서 신뢰할 수 있는 결과를 얻습니다.

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신시내티 아동 병원 의료 센터의 전자 현미경 분석 연구를 지원해 주신 병리학 연구 핵심에 감사드립니다. 이 연구는 NIH(American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 MDF로).

모든 실험 절차는 신시내티 아동 연구 재단에서 기관 동물위원회에 의해 승인되었다. 사개월 - 본 연구를 위해, 조혈 줄기 세포는 2 세 C57BL / 6 타고난 쥐의 골수로부터 분리 하였다. CD34 - - 게이팅 전략 리니지, C-키트, 무서-1 등 다양한 표면 업체와 BM의 염색 후 FACS를 사용하여 정렬 셀, FLT3 및 CD34는 선형 적 무서-1 + C-키트 + FLT3에 따라 HSC의 정제에 사용 된 표준 프로토콜은 8 전에 설명했다. 주의 : 여러 독성이 강한 화학 물질이 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. 다음은 흡입 및 피부 접촉에 의한 독성. 장갑과 보호 복을 착용하십시오. 이러한 화학 물질로 작업하는 동안 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다. 1. 세포, 고정, 염색 및 사전 삽입 <ol><li> 무서 -1 - 린을 사용하여 정렬 만 조혈 줄기 세포 ( <suP&gt; + C-키트 + FLT3 - CD34 - 전략을 게이팅; 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 LT-HSC 인구) 600 ㎕의 FACS를 이용하여 10 % 소 태아 혈청 Iscove 개변 둘 베코 배지 (IMDM). </li><li> 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 사용하여 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정렬 된 조혈 모세포를 스핀 다운. 부드럽게 흡인 배지를 제거하고 각 단계에서 튜브에 200 ㎕의 배지를 떠난다. 이 단계에서, 세포 펠렛은 튜브 보이지 남아있다. </li><li> 1,9- 1 시간 동안 실온 (RT)에서 2 배 정착액 용액 0.2 ml를 첨가하여 세포를 고정한다. <ol><li> 사용하기 전에 정착 솔루션은 신선한합니다. 1 배, 용액을 0.1 M cacodylate 버퍼에 3 %의 파라 포름 알데히드 및 ​​2.5 % 글루 타르 알데히드로 구성된다. </li></ol></li><li> 원심 분리기 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 세포. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL와 세포를 씻으원심 분리를 이용하여 원심 분리 한 후 튜브에 200 μL 버퍼를 둡니다. </li><li> cacodylate 버퍼 에반스 블루 2 ㎎ / ㎖ 용액 200 μL를 첨가하여 세포를 고정 및 염색 RT에서 20 분 동안 배양한다. 세포는 파란색으로한다. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼를 사용하여 원심 분리의 600 μL와 세포를 3 회 반복하고 튜브마다 200 ㎕의 버퍼를 둡니다. </li><li> 200 ㎕의 완충액에 세포를 다시 중지 및 0.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 부드럽게 지금 눈에 보이는 작은 세포 펠렛을 방해하지 않고 버퍼를 제거하고 튜브에 50 μL 버퍼를 둡니다. </li><li> 4 % 아가로 오스 솔루션을 15 ML 튜브에 0.1 M cacodylate 버퍼 5 ㎖에 아가로 오스 200 밀리그램에게 저 융점를 추가합니다. 100 ml의 유리 병에 끓는 물에 튜브를 전송하여 아가로 오스를 용융하여 사용할 때까지 미지근한 유지. </li><li> 4 % 저 융점 200 μL는 아가로 오스 0.1 M cacodyla에 용해 추가바로 셀 0.5 ML 튜브에 서스펜션과에 테 버퍼는 테이블 위에 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리 후 반고체 아가로 0.5 ㎖의 튜브의 하단 펠릿 것을 확인한 후, 즉시 아가 고화 20 분 동안 39 ° C까지 튜브 또는 얼음을 옮긴다. 이 단계는 전자 현미경으로 세포의 좋은 클러스터에서이 단계의 결과에 작은 가시 세포 펠렛으로서 매우 중요하다. </li><li> 조심스럽게 27 G 바늘을 사용하여 3,10- 버퍼를 포함하는 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 관으로부터 세포 펠렛을 함유하는 응고 된 아가로 옮긴다. </li><li> 메스와 2mm - 1의 한 조각으로 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 고형화 트림. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 편을 전송. </li><li> 추가 및 원심 분리하지 않고 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하여 0.1 M cacodylate 버퍼의 600 μl를 사용하여 3 회 - 2 세척. 다음 단계를 위해 세포 펠렛을 함유하는이 아가 로스 편을 사용한다. 이 단계에서, 샘플 밤새 다음 단계로 이동하기 전에 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. Osmification, 탈수, 퍼가기 <ol><li> 세포 펠렛은 피펫을 사용하여 아가로 오스 함유로 1.5 ML 튜브에서 cacodylate 버퍼를 제거합니다. 흄 후드에서 1 % 오스뮴의 1.0 ㎖ (OSO 4) 솔루션을 추가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL로 3 회 세척하고 모자와 함께 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병에 샘플을 전송합니다. </li><li> 탈수, 침투에 대한 샘플을 처리하고 수지에 포함 (예를 들어, LX-112) 6 웰 플레이트에서 다음 솔루션의 직렬 변경. 집게를 사용하여 세포 펠렛 아가로 오스 조각을 이동합니다. <ol><li> 실온에서 15 분 동안 25 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 50 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 75 %에 샘플을 담가15 분 동안 실온에서 에탄올. </li><li> 실온에서 15 분 동안 95 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 회, 15 분 동안 실온에서 100 % 에탄올에 담가 샘플. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (3 : 1)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 1)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 3)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 회, 60 분 동안 실온에서 순수한 수지 샘플을 담근다. </li></ol></li><li> 신중 집게를 사용하여 피라미드 형상의 선단 고무 금형의 바닥에 시료를 전송하고 주형을 채우기 위해 샘플 위에 더 순수한 수지를 추가한다. 수지의 중합을 72 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 고무 몰드를 왜곡하여 금형에서 중합 수지 피라미드를 제거합니다. 이전 7 설명한 바와 같이 세포의 작은 검은 클러스터는 중합 수지 피라미드에서 볼 수 있어야합니다. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 장착 실린더에 중합 수지 피라미드를 연결합니다. </li></ol><ol><li> 면도날 및 울트라 마이크로톰에 블록을 장착 후의 다이아몬드 칼 피라미드 블록 낸다. 상부 및 서로 병렬 블록의 바닥 짧은 넓은 사다리꼴 형상을하고, 균일하게 각도 양쪽. 피라미드의이 형태는 직렬 절편을 위해 도움이됩니다. </li><li> 또한, 다이아몬드 나이프 세포 펠렛 주변 블록을 잘라 내고 세포 펠렛 아가 로스 편 주위 플라스틱 부분을 제거한다. </li><li> 울트라 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 속눈썹 도구 이전 7보고 금속 루프 도구를 사용하여 유리 슬라이드에 물 보트에서 1 ㎛의 섹션을 이동. 건조 용 핫 플레이트 (37 ° C)에 슬라이드와 이전 슬라이드에 전송 섹션. </li><li> 0.22 ㎛의 필터를 장착하고 3 분 동안 배양 주사기를 사용하여 섹션을 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 추가한다. 증류수 L로 슬라이드 린스등 부분은 건조. 셀의 위치를 ​​식별하기 위해 광학 현미경으로 확인한다. </li><li> 다이아몬드 나이프를 사용하여 - (100 nm의 70) 초박형 부분을 잘라. 속눈썹 도구를 사용하여 유리 페트리 접시에 물 보트에서 200 메쉬 그리드 3 부 - 2를 이동합니다. </li><li> 30 분간 부분 건조 30 ℃의 핫 플레이트 섹션 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 1 % 우라 닐 아세테이트 방울과 그리드를 얼룩 후 증류수에 6 린스 - 8 번. 8 번 - 레이놀즈와 얼룩 6을 5 분 동안 실온에서, 구연산을 주도하고 증류수로 씻어. 부분 건조 37 ℃의 핫 플레이트에 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다. </li><li> 80 kV의 7에서, 전자 현미경으로 분석 섹션. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 방법은 에반스에게 블루 염색을 사용하여 아가 로스 탈수, 수지 삽입하는 동안 작은 세포 펠렛을 국산화 삽입 및 프로세스를 절편으로, 낮은 세포 수에 TEM 분석을 할 수 있습니다. 중요한 것은 함께 세포 클러스터를 유지하고 데이터의 정량화를위한 ​​여러 셀을 검사하는 것이 바람직하다 셀 울트라 구조를 유지합니다. TEM 연구에서, 세포 수백만를 함유하는 세포 펠렛은 종종 다수의 셀들로부터 데이터를 얻기 위해 아가 로스 / 젤라틴 매트릭스로 세척하고, 탈수 및 침투에 대한 효율적인 매립 요구된다. 연구원은 BSA-비스 아크릴 아미드 중합 수지의 세포 현탁액의 고정화를 채택, 낮은 세포 수 / 부족 샘플 4-6 TEM 분석을위한 얇은 지원에 단일 층, 또는 cytospins의 염색. 그러나, 지역화 때문에 매트릭스 내에서 세포의 희박한 분포 하에서 TEM 셀을 절단하기위한 번거로운 작업이 남아때문에 확산 종종 절편 전에 다시 삽입을 요구 cytospin 준...

세포의 구조 및 울트라 서브 소기관 정보는 주로 투과형 전자 현미경 (TEM) 조직 또는 세포 펠렛으로부터 1,2- 연구에 의해 밝혀왔다. 조직의 단단한 부분은 쉽게 전자 현미경 연구에 이용 될 수있다. 그러나, TEM은 서스펜션의 셀에 1,3 도전을 유지하고 높은 세포 즉, 숫자, 세포의 수백만을 필요로 분석한다. 이 때문에, 서스펜션 희귀 세포 집단의 초 구조 해석은, 예를 들면, 조혈 세포 (조혈 모세포)를 용이하게 평가되지 않는다. cytospin 또는 단일 층 방법을 사용하여 부족한 샘플에서 TEM 분석을위한 여러 시도는 세포의 제한된 수의에서 중요한 정량적 데이터를 얻기 위해 실패합니다. 따라서, 높은 세포 수의 요구 희귀 세포 집단의 세포 내 미세 내용을 이해하는 강력한 도구의 사용을 제한한다. 셀의 한정된 수의 TEM 연구에 중요한 제약현탁액에서의 처리를 위해 셀의 위치 파악하고 이에 따라, 특히 작은 크기의 제한 셀로부터 TEM 연구 도전 남아있다. 여러 가지 다른 접근 방식이 한계에 대응하기 위해 채택 된 다음 BSA / 비스 아크릴 아미드 (BSA-BA) 세포 현탁액의 매개 중합, 커버 슬립을 포함하는 박막 지원에 그들을 볼 수 있도록하는 염료와 세포의 염색, 및 TEM은 cytospin 준비 4-6에서 분석한다. 소수의 세포가 매우 절편 이후 섹션에서 발견 된 그러나, 매우 제한된 성공은 달성되었다. 세포 단층이 절편의 응고 겔의 대부분은 눈에 보이지 않는 남아 있기 때문에 스파 스 세포를 식별의 주요 과제는 지속됩니다. 또한, 세포의 제조 cytospin 인해 셀 확산 셀 구조의 취약성 그들의 세포 조직을 변경할 수있다. 따라서, 이러한 본질적인 결점 더 희귀 한 세포 집단에서 TEM 연구를 수행하는 신규 한 방법을 보증일관성. 이러한 문제를 극복하기 위해, 희귀 세포 집단 (7)로부터의 TEM 연구를위한 새로운 대안 샘플 제조 방법을 설명 하였다. 여기서는 일관성 정량적 결과 부족한 생물학적 시료에서 TEM을 수행하는 효율적인 샘플 준비 프로토콜을보고한다. 에반스 블루 염색 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 남아있을 것입니다 적은 수의 세포, 즉, 만 골수 조혈 줄기 및 전구 세포에서 작은 세포 펠렛을 국산화 고정 후에 수행하고, 펠릿을 탈수 수지 매립 처리 전에 아가로 오스에 포함되었다. 이 방법은 함께 세포 클러스터와 미세 구조 및 LIN (식별 - 무서-1 + 형 c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC) 조혈 줄기 세포의 세포 내 기관의 효율 분석 가능 드문 0.2-0.5 %의 세포 집단을 골수이다. 이 실험 프로로토콜 울트라 구조 연구를 수행하고 희귀하지만 매우 중요한 인구에 대한 정량적 인 결과를 얻기 위해 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>파라포름알데히드 20% 수성 졸</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>15713</td><td>주의 흡입, 피부 접촉을 통해 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 흄 후드를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>글루테알데히드 70% 수성 졸</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16350</td><td>CAUTION 흡입, 피부 접촉을 통해 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 흄 후드를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>카코딜라데이트 완충액&nbsp;</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>12300</td><td>증류수에 0.1M 카코딜라데이트 완충액(pH 7.4)을 만들고 4°C에서 보관하십시오. <강한>주의</강한> 흡입 또는 피부 접촉으로 자극을 일으키지 않으며 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>에반스 블루&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>저융점 아가로스&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g 0.1 M 카코딜라데이트 완충액 50 ml에 2% OsO4 스톡, <강한>주의</강한> 흡입 또는 피부 접촉에 의해 매우 독성이 있음, 강한 산화제, 보호복 착용, 보안경, 흄 후드 사용.</td></tr><tr><td>LX-112 임베딩 키트(LADD&reg;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112를 함께 섞은 다음 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td>를 첨가하십시오<td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>에폭시 수지 Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>CAUTION 흡입, 피부 접촉에 의해 독성이 있습니다. 장갑, 보호복을 착용하고 흄 후드를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>CAUTION 흡입 시 독성이 있으므로 피부나 눈과의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트 (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>CAUTION 흡입 시 독성이 있으므로 피부나 눈과의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>Iscove의 수정된 둘베코의 매체 (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>구성: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. 자세한 https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>피라미드 팁 몰드&nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 실린더</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>초마이크로톰&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 메시 그리드 (nikil)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>전자 현미경</td><td>Hitachi 모델 H-7650&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미지 캡처 엔진 소프트웨어</td><td>AMT-600&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35mm 플라스틱 페트리 접시</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&nbsp;</td><td>전자 현미경 Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 섬광 유리병&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>속눈썹 도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탈 루프 도구&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tem 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

투과 전자 현미경 (TEM)을 세포 조직과 미세 구조의 세부 사항을 제공한다. 그러나, 이러한 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 희귀 세포 집단, 현탁액, 특히 세포의 TEM 분석에 의한 시료 전처리 동안 높은 세포 수의 요구에 한정 남아있다. 거기에서 부족한 시료 TEM 분석을위한 몇 cytospin 단층 또는 방법이 있지만,이 방법은 셀들의 한정된 수의 상당한 정량 데이터를 얻을 못한다. 여기서, TEM 연구 샘플 준비를위한 다른 신규 한 방법은 정량 분석을 가능 희귀 세포 집단에 대해 설명한다. 비교적 낮은 셀 번호, 즉 10,000 조혈 모세포는 성공적 일반적 TEM 연구에 사용되는 세포의 수많은 비교 TEM 분석에 사용 하였다. 특히, 에반스 블루 염색은 파라 포름 알데히드 - 글루 타르 알데히드 후 작은 세포 화소를 시각화 (PFA-GA) 고정을 시행 하였다아가로 오스에 포함 촉진하는 수 있습니다. 수많은 세포의 클러스터 초박형 섹션에서 관찰되었다. 세포는 잘 보존 된 형태가 있고, 골지 복잡하고 여러 미토콘드리아의 초 구조 세부 사항을 볼 수 있었다. 이 효율적 쉽게 재현 프로토콜은 저 세포 수의 샘플을 제조 할 수 있으며 제한되는 생물학적 시료에서 희귀 세포 집단에 정량적 TEM 분석을 위해 사용될 수있다.

샘플 준비에 대한 효율적이고 일관성 프로토콜은 세포의 낮은 숫자는 설명의 TEM 분석을 수행한다. 에반스 블루와 0.5 ml의 microcentrifuge 관에 세포의 이동과 후 고정 염색은 작은 세포 펠렛 7을 시각화 도움을 주었다. 아가로 오스의 산화 오스뮴과 Osmification는 탈수 및 매립 동안 어두운 세포 펠렛의 쉬운 검출되었다. 작은 세포 펠렛을 함유하는 블록 세미 얇은 부분이 함께 다수의 셀의 클러스터 (도 1A 및 1B)를 확인했다. 초박형 섹션 셀 클러스터 지역에서 잘라 전자 현미경 (그림 1C)에서 분석 하였다. 이러한 세포의 형태와 매우 구조가 아니라 (그림 1D) 보존되었다. 개별 세포의 전자 ...

여기에서는 투과전자현미경(TEM) 분석을 위해 세포 수가 적은 샘플을 준비하는 프로토콜을 제시합니다.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

이 절차의 전반적인 목적은 효율적이고 재현 가능한 방식으로 TEM 분석을 수행하기 위해 세포 수가 적은 시료를 준비하는 것입니다. 이 방법은 생의학 분야에서 실제 세포의 모든 구조와 더 나은 생리학적 환경을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 수의 세포로부터 정성적 및 정량적 결과를 모두 재현 가능한 방식으로 얻을 수 있다는 점입니다.먼저, FACS를 사용하여 10,000개의 조혈모세포(HSC)를 10% FBS가 함유된 600 µL의 isocoves modified dulbecco medium이 들어 있는 1.5 mL 마이크로원심분리관에 분리합니다. 스윙 버킷 로터가 장착된 원심분리기를 사용하여, 분리된 HSC를 1,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.부드럽게 흡입하여 배지를 200 µL만 남기고 모두 제거합니다. 세포를 고정하기 위해 갓 조제한 2X 고정액 0.2 mL를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그다음 0.1 M cacodylate 완충액 600 µL를 첨가하여 세포를 세척합니다.이번에는 30 °C에서 세포를 다시 원심분리합니다. 원심분리 후, 200 µL의 완충액만 남기고 모두 제거한 다음, cacodylate 완충액에 희석된 2 mg/mL evans blue 200 µL를 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양하여 세포를 염색합니다. 0.1 M cacodylate 완충액 600 µL를 사용하여 세포를 3회 세척합니다.그런 다음, 세포 현탁액을 0.5 mL 튜브로 옮기기 전에 남은 200 microliters의 완충액으로 세포를 재현탁합니다. 이 단계에서 튜브 내에 펠렛이 보여야 합니다. 탁상 원심분리기를 사용하여 1,000 times G에서 10분 동안 세포를 원심분리합니다.그런 다음, 이제 육안으로 확인 가능한 작은 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 버퍼를 조심스럽게 제거하고, 튜브에 50 µL의 버퍼를 남깁니다. 15 mL 튜브에 0.1 M cacodylate 버퍼 5 mL와 저융점 아가로스 200 mg을 넣어 4% 아가로스 용액을 준비합니다. 튜브를 100 mL 유리병에 담긴 끓는 물로 옮겨 아가로스를 녹입니다.세포 현탁액이 든 튜브에 아가로스 용액 200 µL를 넣습니다. 즉시 1,000 ×g, 30 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 세포가 튜브 바닥의 반고체 아가로스 내로 펠렛화된 것을 확인한 후, 아가로스를 굳히기 위해 튜브를 즉시 4 °C 또는 얼음 위에 20분 동안 둡니다.27게이지 바늘을 사용하여 세포 펠렛이 포함된 응고된 아가로스를 0.1 M cacodylate 완충액이 담긴 35 mL 플라스틱 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 메스를 사용하여 세포 펠렛이 포함된 응고된 아가로스를 약 1~2 mm 크기의 한 조각으로 잘라냅니다. 그런 다음 이를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.0.1 M cacodylate 완충액 600 µL를 넣고, 피펫을 사용하여 완충액을 넣고 제거함으로써 아가로스 세포 펠렛을 세척합니다. 아가로스 세포 펠렛에서 완충액을 제거한 후, 보호복과 장갑을 착용한 상태로 흄 후드 내에서 1% osmium tetroxide 용액 1 mL를 첨가합니다. 세포 펠렛을 4 °C에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후, 샘플을 3회 세척합니다. 캡이 있는 20 mL 유리 신틸레이션 바이알(scintillation vial)로 옮깁니다. 그다음 에탄올 계열을 사용하여 샘플을 탈수시킵니다.그런 다음 샘플을 에탄올에 희석한 LX 112 레진의 농도를 단계적으로 높여 침투시킨 후, 100% 레진에서 60분씩 두 번 배양합니다. 핀셋을 사용하여 샘플을 피라미드 팁 모양의 고무 몰드 바닥으로 조심스럽게 옮기고, 몰드를 채우기 위해 샘플 위에 순수 레진을 추가합니다. 레진을 중합시키기 위해 샘플을 60 °C에서 72시간 동안 배양합니다.수지가 중합되면 고무 몰드를 비틀어 몰드에서 분리하십시오. 중합된 수지 피라미드 내에 작은 검은색 세포 집락이 보여야 합니다. 시아노아크릴레이트를 사용하여 중합된 수지 피라미드를 절편 제작용 마운팅 실린더에 부착하십시오.블록을 울트라마이크로톰(ultramicrotome)에 장착한 후, 면도날과 다이아몬드 나이프를 사용하여 피라미드 블록을 다듬어 블록의 상단과 하단이 서로 평행하고 측면 각도가 균일한 짧고 넓은 사다리꼴 모양으로 만듭니다. 그런 다음 다이아몬드 나이프를 사용하여 세포 펠렛 주변의 블록을 다듬고, 세포 펠렛 아가로스 조각 주변의 플라스틱 부분을 제거합니다. 울트라마이크로톰으로 1 µm 두께의 절편을 자르고, 속눈썹 도구와 금속 루프를 사용하여 워터 보트(water boat)에서 유리 슬라이드로 절편을 옮깁니다.그 다음 슬라이드를 37 °C의 핫플레이트 위에 올려 건조시킵니다. 0.22 µm 필터가 장착된 시린지를 사용하여 섹션에 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 첨가하고 3분 동안 배양합니다. 그 후 증류수로 슬라이드를 헹구고 섹션을 건조시킵니다.건조 후 광학 현미경으로 절편을 확인하여 세포의 위치를 식별합니다. 다음으로 다이아몬드 칼을 사용하여 초박절편을 제작합니다. 그런 다음 속눈썹 툴(eyelash tool)을 사용하여 워터 보트(water boat)에서 2~3개의 절편을 200 mesh 그리드로 옮겨 유리 페트리 접시에 넣습니다.그리드가 담긴 접시를 30°C의 핫플레이트 위에 30분 동안 두어 절편을 건조시킵니다. 1% uranyl acetate를 몇 방울 가하고, 그리드를 염색하기 위해 실온에서 10분 동안 배양합니다. 그 후, 증류수를 사용하여 6~8회 헹굽니다.Reynolds 리드 시트레이트로 상온에서 5분 동안 염색한 후, 6~8회 헹굽니다. 그리드가 담긴 유리 페트리 접시를 37 °C의 핫플레이트로 옮겨 절편을 건조시킵니다. 마지막으로, 전자현미경을 사용하여 87 kV에서 절편을 분석합니다.여기 저배율로 제시된 것은 작은 세포 펠릿이 포함된 블록에서 얻은 톨루이딘 블루 염색 반박절편(semi-thin sections)으로, 세포 군집이 있음을 확인해 줍니다. 이 고배율 이미지는 세포의 온전한 형태를 보여줍니다. 본 도표는 우라닐 아세테이트와 시트르산 납으로 염색한 후 전자현미경으로 분석한 초박절편(ultra thin sections)의 세포 군집 전체 관찰 시야를 나타냅니다.여기 단일 HSC가 제시되어 있으며, 이는 세포의 형태와 초미세 구조가 잘 보존되었음을 보여줍니다. 개별 HSC를 고배율로 촬영한 정밀 전자현미경 사진은 세포 내 초미세 구조를 보여줍니다. 또한, 고배율 이미지를 통해 미토콘드리아와 같은 세포 소기관의 구조와 무결성이 잘 보존되었음을 확인할 수 있습니다.이 기술을 숙달하면 5~6시간 이내에 수행할 수 있으며, 고급 청색 염색 및 아가로스 임베딩을 거쳐 정상적인 TEM 프로세싱까지 적절하게 수행될 경우 5~6일이 소요됩니다. 따라서 이 영상을 시청하신 후에는 TEM 분석을 위한 실제 세포 준비물로부터 샘플을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

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