쥐 간 문부 클램프 모델을 사용하여 직접 분절 인트라 간 납품 방법

이 독특한 쥐 간 hilar 클램프 모델의 전반적인 목표는 허혈 재관류 손상 개선에 대한 관심 약리학적 분자의 영향에 대한 연구를 가능하게 하는 것입니다. 이 방법은 허혈 재관류 손상을 중재하는 데 도움이 되도록 어떤 분자를 간에 직접 주입할 수 있는지에 대한 간 이식 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 분자가 문맥에 직접 주입되어 분포 부피를 줄인다는 것입니다.

이 기술의 의미는 허혈 재관류 손상 감소를 위해 장기 관류액에 추가될 수 있는 분자를 테스트할 수 있기 때문에 모든 장기의 이식으로 확장됩니다. 이 방법의 시각적 시연은 캐뉼레이션에 사용되는 문맥 분기의 크기가 작기 때문에 중요합니다. 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인하는 것으로 시작한 다음 해부 현미경 아래의 보온 패드에 쥐를 놓고 팔다리를 구속합니다.

다음으로, 치골에서 xiphoid까지 복부 정중선 절개를 한 다음 linea alba를 따라 복막을 유사하게 절개합니다. 방광이나 장이 손상되지 않도록 주의하면서 복부로 들어가 xiphoid process 근처의 복막 전방에서 간을 방출합니다. 간 우엽의 아래쪽 경계에 있는 피부와 복막을 가로로 절개하고 구부러진 모기 클램프를 사용하여 xiphoid 과정을 후퇴시킵니다.

갈비뼈 견인기를 사용하여 정중선에서 가능한 한 멀리 갈비뼈를 열고 팔시폼, 횡격막 및 위 인대를 절단합니다. 그런 다음 축축한 멸균 면봉을 사용하여 간을 뒤집고 필요에 따라 포르타에 접근하기 위해 추가 인대를 자릅니다. 식염수에 적신 거즈를 사용하여 간을 본능적으로 회전시킨 다음 문맥 위에 있는 느슨한 결합 조직과 문맥 길이 위에 있는 느슨한 결합 조직을 제거합니다.

겸자를 사용하여 느슨한 결합 조직을 통해 왼쪽 문맥, 동맥 및 담관 후방으로 밀어 넣어 창을 만들고 4-0 Potts 봉합사로 혈관을 느슨하게 둘러쌉니다. 그런 다음 오른쪽 신장의 문맥으로 가는 뒤쪽 가지 위에 있는 느슨한 결합 조직을 제거합니다. 다음으로, 인슐린 주사기를 사용하여 하대정맥에서 0.5ml의 혈액을 추출하고 혈액을 작은 바이알로 옮깁니다.

샘플을 원심분리하고 액체 질소에서 급속 동결하기 위해 새 바이알에 혈청을 수집합니다. 7-0 봉합사 두 조각을 자릅니다. 왼쪽 문맥 주위에 첫 번째 7-0 루프를 가능한 한 내측까지 배치하고 곡선 모기 클램프를 사용하여 정맥을 수축시킵니다.

문맥과의 교차점 근처에 있는 문맥의 뒤쪽 가지에 느슨하게 묶인 두 번째 7-0 루프를 놓습니다. 이제 주입 펌프에 0.9% 식염수 3ml의 시약이 들어 있는 5ml 주사기를 로드하고 튜브를 프라이밍합니다. 미세수술 클램프를 사용하여 원위 문맥을 잡고 캐뉼레이션 중 출혈을 줄이고, 작은 미세수술 가위를 사용하여 7-0 스테이 봉합사와 문맥과의 교차점 사이의 정맥에 0.5mm 구멍을 자릅니다.

27-0 카테터를 사용하여 좌측 문맥계를 캐뉼레이션하고 좌우 문맥의 분기점을 지나 카테터를 삽입합니다. 캐뉼라의 위치를 확인하기 위해 1ml의 생리식염수를 주입하고 간의 왼쪽 측면 및 정중 엽이 희어지는지 관찰합니다. 카테터가 오른쪽 문맥의 이륙을 지났지만 정중엽에 공급되는 문맥의 이륙을 벗어나지 않았는지 수동으로 평가한 다음 Potts 봉합사를 조이고 7-0 봉합사로 카테터를 고정하고 원위 문맥에서 클램프를 제거합니다.

15분 분만 동안 관심 시약 2ml를 즉시 주입하기 시작하고, 주입 전반에 걸쳐 동물의 활력 징후를 지속적으로 모니터링합니다. 허혈 시간이 시작된 지 1시간 후에 Potts 봉합사와 카테터를 제거한 다음 후방 분기의 7-0 봉합사를 문맥에 끼웁니다. 재관류를 시작한 지 2시간 후, 하대정맥에서 0.5ml의 혈액을 천천히 뽑아낸 다음 새 바이알로 혈액을 천천히 떨어뜨립니다.

필요에 따라 정맥에서 출혈을 멈추기 위해 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음 혈액을 원심 분리하고 방금 시연한 것처럼 다운스트림 처리를 위해 혈청의 절반을 스냅 동결합니다. 실험 종말점에서 횡격막을 원형으로 절개하고 간과 복막강을 연결하는 데 남아 있는 추가 결합 조직을 절단합니다.

간을 채취하여 좌엽과 정중엽에서 4개의 큰 샘플을, 우엽에서 4개의 큰 샘플을 얻습니다. 그런 다음 샘플을 라벨이 부착된 개별 바이알에 넣고 다운스트림 처리를 위해 조직을 액체 질소로 스냅 동결합니다. 생리식염수와 PEG-SOD가 주입된 힐라 클램프 동물에서 혈청 알라닌 아미노전이효소 측정은 재관류 후 120분에 혈청 대조군과 실험용 동물 간 효소 발현 수준 간에 상당한 차이를 보여줍니다.

우측, 비힐러 클램프 로브에서 조직 말론디알데히드 발현은 대조군과 실험군 간에 유의한 차이를 나타내지 않습니다. 그러나 좌측 post-hilar clamp 및 reperfusion lobe는 대조군 non-reperfused, non-infused lobe, 그리고 right PEG-SOD infused lobe에 비해 상당히 높은 수준의 조직 malondialdehyde 발현을 보여줍니다. 조직 글루타치온 발현에서도 동일한 패턴이 관찰됩니다.

웨스턴 블롯 분석은 PEG-SOD 주입으로 처리한 동물에서 감소된 hilar clamp 및 재관류 후 좌엽에서 절단된 cleaved caspase-3 발현 수준이 증가했음을 나타내며, 이러한 차이는 밀도 측정에 의해 유의미한 것으로 확인되었습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 3시간 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 원위 문맥 클램프를 배치할 때 캐뉼레이션을 위해 문맥 분기에 상당한 견인력을 얻는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차를 마스터하면 다양한 약리학적 물질의 영향을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 좌측 문맥 시스템을 캐뉼레이션하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.