Name: 중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 학습하세요 마우스 미세주입 기술을 통해 내부 경동맥으로 뇌에 약물을 전달하는 방법을. 최소 침습으로 신경망을 보존하며 높은 농도의 물질 전달이 가능합니다.

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우리 실험실에서 이 모델을 처음 사용하게 해주신 Dr. Lei Chen (뉴욕 마운트 시나이 아이칸 의과대학)과 우리 실험실에서 이 기술을 전파해 주신 Dr. Gretchen Wolff (독일 암 연구 센터, 독일 하이델베르크)에게 감사드립니다. HL126559, DA039576, MH098891, MH63022, MH072567, DA027569 및 NSC 2015/17/B/NZ7/02985에서 부분적으로 지원됩니다.

다음 프로토콜에 관련된 절차는 마이애미 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 또한, 모든 절차는 실험 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 승인을 시설에서 진행되고있다. 외과 마우스 1. 준비 <ol><li> 실험실 마취 시스템을 이용하여, 산소와 혼합하여 이소 플루 란 마취 마우스. 2 L에 %와 산소 흐름 4-5 사이에 설정에서 이소 플루 란을 사용하여 / 상업 시스템에 분 (재료 표 참조). 실체 현미경 하에서 수술면에 동물을 전송하고, 노즈콘을 사용하여 마취를 유지 (- 2 L / 분으로 2.5 1.5 산소 유량 설정 이소 플루 란을 사용한다). <ol><li> 허걱없이 2 호흡 / 초 - 마우스 호흡 속도가 1 주위에 있는지 확인하십시오. 또한, 동물의 수염 자극 반응 페달 (R)가 발생하지 않도록eflex (발가락 핀치). , 수술 동안 적어도 매 5 분 호흡 속도와 노력을 모니터링합니다. 설치류 마취 모니터링을 위해 특정 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 수의학 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 건조 함을 예방하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 각각의 눈에 대한 안과 용 윤활제 방울을 적용한다. 항 염증 및 통증을 완화하는 진통제의 투여는 권장합니다. </li><li> 동물의 뒷면에 누워, 코 콘을 사용하여 마취를 유지한다. </li><li> 지역을 에탄올 70 %와 클로르헥시딘로 3 회 닦아 동물의 목 영역을 청소합니다. (아래에 설명)을 면도칼을 사용하여 동물의 수술 영역을 면도. </li></ol> 경동맥 2. 해부 (CCA) <ol><li> 실체 현미경 하에서 전체 미세 절차를 수행합니다. 수술 가위를 사용하고 집게은 가슴 위에서 t 이하로, 목에 얕은 중간 선 절개를 수행그는 (약 3 ~ 4 cm)를 턱. </li><li> 집게를 조심스럽게 분리 지방 및 결합 조직을 사용하여 기관을 노출시킨다. </li><li> 더 영역을 노출, 목을 연장 마우스의 목에의 뒷면에 베개 (라운드 개체, 직경 약 0.5 cm)를 놓습니다. </li><li> 조직 권취 또는 후크를 사용하여 조직을 분리한다. </li><li> 기관의 동물의 왼쪽에서 조심스럽게 왼쪽 CCA를 노출 할 수있는 결합 조직을 분리 tweeze. </li><li> 사용 포셉 신중하게 CCA의 분기점을 노출하는 모든 결합 조직, 모두 외부 및 내부 경동맥의 시작을 제거합니다. </li></ol> 약물 주입을위한 CCA 3. 준비 <ol><li> 집게를 사용하여, 외부 경동맥에서 나일론 봉합사 (약 1cm 각)의 두 개의 세그먼트 (ECA)를 삽입합니다. </li><li> ECA의 가능한 가장 높은 지점에서 영구 매듭을 놓습니다. </li><li> ECA의 가능한 가장 낮은 지점, 바로 CCA의 분기점 위의 장소에서이동식 매듭. 이 매듭은 상부 매듭에 비해 느슨합니다. </li><li> 가장 낮은 지점에서, 용기 클립을 사용하여 CCA를 닫습니다. </li><li> 용기 클립을 사용하여 내 경동맥 (ICA)를 닫는다. </li><li> 사용하여 미세 절제 스프링 가위는 두 매듭 사이 ECA (약 2mm)에 작은 상처를 수행합니다. </li></ol> ICA를 통해 4. 약물 주입 <ol><li> 주입 시스템을 조립합니다. 모세관 튜브 6 인치 (이상적인 크기 : 2.5 mm X 1.2 mm)를 부착 물질의 250 μl를 포함하는 투베르쿨린 주사기는 (마약, 병원균, 다른 사람의 사이에서 세포 외 소포를) 주입 및 수행 절개로 부드럽게 모세관 팁을 삽입한다 단계 3.6 인치 </li><li> 가 분기와 CCA를 폐쇄 클립 사이의 중간 점에 도달 할 때까지 모세관을 아래로 슬라이드를 계속합니다. </li><li> 낮은 ECA 매듭을 묶어. 매듭은 모세관 유동을 허용 할 정도로 느슨하고 leakin을 방지하기에 충분히 단단한 지 확인지. </li><li> ICA에에서 클립을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 주사기 피스톤 허용 물질 주입 초당 약 10 μL에 압력을 적용합니다. </li></ol> 5. 사후 주입 절차 <ol><li> 장소는 ICA에 다시 클립. </li><li> 조심스럽게 모세관 튜브를 제거합니다. </li><li> 완전히 낮은 ECA 매듭을 묶어. </li><li> ICA에와 CCA에서 클립을 제거합니다. </li></ol> 6. 절개 결산 및 수술 후 케어 <ol><li> 트랙터 또는 조직 후크와 베개를 제거합니다. </li><li> 멸균 생리 식염수를 사용하여 청소 봉합 영역입니다. </li><li> 나일론 봉합사 / 바늘과 집게를 사용하여 절개를 닫습니다. </li><li> 항 염증 및 진통이 수술 후 불편 함을 완화하기 위해 관리 할 수 ​​있습니다. </li><li> 적어도 1 시간 모니터 복구를 위해 가열 패드에 배치 새장에 동물을 배치합니다. </li></ol>

<ol><li>Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+microport+technique+for+applications+in+cerebrovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research.</a> J Neurosci Res. 87 (7), 1718-1727 (2009).</li>
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여기에 설명 된 주입 미세는 본체 (1), (12)을 통해 원치 않는 확산을 방지 CNS에 다양한 생물학적 기능 외인성 물질을 전달하는 매우 성공적인 것으로 판명되었습니다. 혈액 - 뇌 장벽을 중단 여러 CNS 관련 질환의 병리학 적 특징이다; 따라서 혈뇌 장벽 외인성 물질의 관계를 평가하는 것은 매우 중요하고 흥미 롭다. 선물이 수술 모델 동물에 제한 외상의 원인과 매우 낮은 사망률 (1), (12)와 연결되어 있습니다. 또한, 상기 절차는 CNS 기능 또는 뇌 혈류 1 (12)과 간섭하지 않는다. 이 방법의 가장 중요한 측면만을 허용해야하는 상기 ECA 올바른 ...

중추 신경계의 생체 내 모델 (CNS) 질환은 뇌에 이러한 약물, 병원균 또는 엑소 좀과 같은 외래 물질의 효과적인 전달을 필요로한다. 따라서, 이상적인 전달 방법은 동물에게 최소의 외상을 유발하는 신경 네트워크의 무결성을 유지하고, 뇌 한 높은 약물 농도를 달성한다. 지방 물질 전달의 여러 가지 수술 방법은 인트라 - 시스, 뇌내, 뇌 실내 주사 나 주입, 2, 3, 4, 5를 포함하여 기술되었다. 이러한 방법은 그러나, CNS 외상으로 간주하고, 관심 물질의 낮은 양의 관리를 허용한다. 또한, 외인성 물질이 빠르게 뇌척수액 (6)에 의해 제거 할 수 있다고 제안되어왔다 </s업&gt; 및 상술 한 기술이 사용될 때 뇌 실질 저 투과 범위는 7 관찰되었다. 그들은 CNS에 물질 전달이 낮은 효과를 발휘하지만 경구, 폐, 피하, 정맥 내 경로 등의 전신 전달 방법은 흔히 다른 기관 (8), (9)의 흡수로 인해, 동물 모델에서 이용된다. 따라서, 전달 노선들은 부작용 및 독성이 10, 11의 위험을 증가 투여 물질의 높은 투여 량을 필요로한다. 여기서는 효과적으로 직접 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 제공하는 마우스 미세 주입 기술을 설명한다. 중추 신경계에 대한 전달을 대상으로하는 것 외에도,이 기술은 정상적인 생리 장벽을 우회하므로 biologica에 매우 관련이없는뇌 내로 치료제 또는 병원체 통로 (L)에 관여 프로세스.

<table><tbody><tr><td>마취 기구</td><td>Vetequip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tool</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>수술용 집게 스트레이트 팁</td><td>Fine Science Tool</td><td>00108-11</td><td></td></tr><tr><td>수술용 집게 각진 팁</td><td>Fine Science Tool</td><td>00109-11</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>나일론 봉합</td>사 <td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 104</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜빙 (Micro-Renathane 0.010" x 0.005" per ft.)&nbsp;</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE01050</td><td></td></tr><tr><td>폐쇄 봉합사</td><td>VWR</td><td>95057-036</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>피라말</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로</td><td>라이드 피셔사이언티픽</td><td>50-121-8005</td><td></td></tr></tbody></table>

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

중추신경계(CNS) 질환과 그에 따른 혈액뇌장벽 파괴 질환의 동물 모델은 외인성 물질을 뇌로 전달해야 합니다. 이러한 외인성 물질은 해로운 영향을 유발하거나 치료 전략을 구성할 수 있습니다. 외인성 물질이 뇌로 전달되는 가장 일반적인 방법은 피하 또는 정맥 주사 경로와 같은 전신 전달을 기반으로 합니다. 일반적으로 사용되지만 이러한 접근 방식에는 뇌로의 낮은 전달 효능을 포함하여 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 반면, 국소적으로 중추신경계로 물질을 전달하는 수술 방법은 더 특이적이며 다른 장기에 의한 외인성 물질의 흡수를 방지합니다. CNS 전달을 위한 여러 가지 수술 방법을 사용할 수 있습니다. 하지만, 그들은 매우 충격적인 경향이 있다. 여기에서는 내부 경동맥을 통해 물질을 뇌로 효과적으로 전달하는 마우스 주입 미세수술 기법에 대해 설명하며, 이는 외상을 최소화하고 정상적인 CNS 기능을 방해하지 않습니다.

여기에 설명 된 마우스 미세 주입 기술은 매우 다목적 뇌 전이의 형성 (1) (12)의 대표 모델에서 종양 세포의 전달을 포함하여 직접 뇌에 다른 물질을 전달하기 위해 사용되어왔다. 이 기술은 또한 CNS 다른 병원균의 병리학 적 양상을 평가하기에 적합하다. HIV 감염의 마우스 모델에서, 주입은 수술 CCA 직접 바이러스 입자를 주입 하였다. 우리는 7 일 수술 후 CNS 실시간 PCR에 의해 HIV 양성 것으로 나타났습니다. 또한, 동측 반구 감염은 6-10 반대편 반구 (그림 2)보다 높은 주름이었다. 여기에 설...

본 프로토콜은 내부 경동맥을 통해 뇌로 물질을 직접 효과적으로 전달하는 마우스 미세 수술 주입 기술을 설명합니다.

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

이 수술 기법의 전반적인 목표는 외인성 물질을 두개골을 관통하지 않고 쥐의 뇌로 전달하는 것입니다. 이 방법은 뇌에서 약물, 병원균 및 엑소좀의 작용에 관한 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 동물에게 최소한의 외상을 입히고, 신경 네트워크의 무결성을 보존하며, 뇌에서 높은 농도의 물질을 얻을 수 있다는 것입니다.먼저 산소와 혼합된 이소플루란을 투여하여 유도실에서 마우스를 마취합니다. 마취 유도 후 실체 현미경으로 동물을 수술 표면으로 옮기고 노즈 콘을 배치하여 수술 마취 평면을 유지합니다. 헐떡임 없이 호흡수가 초당 약 1-2회 호흡이 되도록 합니다.또한 동물이 수염 자극이나 발가락 꼬집기에 반응하지 않도록 하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 각 눈에 안과 윤활제를 한 방울 떨어뜨려 건조를 방지합니다. 면도기로 수술 부위를 면도한 후 70% 에탄올과 클로르헥시딘을 바르십시오.실체 현미경을 통해 보면서 수술용 가위와 집게를 사용하여 흉골 위에서 턱 아래까지 목의 정중선을 절개합니다. 겸자를 사용하여 지방 조직과 결합 조직을 조심스럽게 분리하여 기관을 노출시킵니다. 그런 다음 직경 5cm 정도의 부드럽고 둥근 물체를 목 뒤쪽 아래에 놓아 목을 확장하고 해당 부위를 더 노출시킵니다.그런 다음 고리나 조직 견인기를 사용하여 기관 주위의 조직을 분리합니다. 기관의 왼쪽에서 결합 조직을 조심스럽게 핀셋으로 분리하여 왼쪽 총경동맥(CCA)을 드러냅니다. 겸자를 사용하여 모든 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 외부 및 내부 경동맥의 시작 부분에 있는 CCA 분기를 노출시킵니다.ECA와 ICA가 노출되면 겸자를 사용하여 1cm 나일론 봉합사 부분을 외부 경동맥 아래에 놓습니다. 그런 다음 두 번째 1cm 세그먼트를 배치합니다. 그런 다음 ECA의 가능한 가장 높은 지점에서 영구 매듭을 묶습니다.ECA의 가능한 가장 낮은 지점, CCA 분기점 바로 위에 더 느슨하고 제거 가능한 매듭을 묶습니다. 그런 다음 용기 클립을 사용하여 가능한 가장 낮은 지점에서 CCA를 닫고 ICA를 닫습니다. 외부 경동맥을 작게 절개하기 전에 내부 경동맥을 적절하게 닫으면 출혈을 방지할 수 있습니다.이제 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 두 매듭 사이의 ECA를 2mm 자릅니다. 큰 절단은 물질의 누출을 유발하므로 절단을 작게 유지하는 것이 중요합니다. 주입할 물질 250마이크로리터가 들어 있는 투베르쿨린 주사기에 6인치의 모세관 튜브를 부착하여 주입 시스템을 조립합니다.그런 다음 모세관 튜브의 끝을 ECA의 절개 부위에 부드럽게 삽입합니다. 분기점과 CCA의 클립 사이의 중간에 도달할 때까지 팁을 계속 전진시킵니다. 아래쪽 ECA 매듭을 묶습니다.매듭이 모세관 유동성을 허용할 만큼 느슨하고 누출을 방지할 수 있을 만큼 충분히 조여져 있는지 확인합니다. 그런 다음 ICA에서 클립을 제거합니다. 주사기 피스톤에 부드럽게 압력을 가하여 초당 약 10마이크로리터의 속도로 물질을 주입할 수 있습니다.테스트 물질을 주입한 후 클립을 ICA에 다시 놓습니다. 모세관 튜브를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 아래쪽 ECA 매듭을 완전히 묶습니다.ICA 및 CCA에서 클립을 제거합니다. 그런 다음 견인기 또는 티슈 고리와 베개를 제거합니다. 멸균 식염수로 봉합할 부위를 세척한 후 나일론 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.수술 후 불편함을 완화하기 위해 승인된 항염증제와 진통제를 투여한 후, 동물을 케이지에 넣고 최소 1시간 동안 발열 패드를 놓고 회복 상태를 모니터링합니다. 이 히스토그램은 좌측 내부 경동맥을 통해 바이러스 주입 7일 후 실시간 PCR에 의한 HIV 검출을 보여줍니다. 예상대로 바이러스 수치는 좌반구에서 더 높습니다.이 면역형광 이미지는 내부 경동맥을 통해 세포외 소포를 주입한 후 엑소좀 마커인 GFP 태그 CD63을 묘사하는 쥐의 뇌 단면을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 세포외 소포체를 발현하는 CD63은 쥐의 뇌 미세혈관과 관련이 있습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 20분 안에 완료할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 신경퇴행성 질환 분야의 연구자들이 생쥐의 약물, 병원체 및 엑소좀 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

신경 과학 메세지가되면서 더 정교, 뇌 구조의 조사 및 회로 정확성 및 높은 해상도의 향상된 수준을 필요로합니다. 우리는 50 미크론의 팁 직경 borosilicate microcannula을 이용하여 뇌 내에 만성 주입 시스템의 준비와 주입하는 방법을 개발했습니다.

Neuroactive 대리점 지속 배달 Microinfusion 시스템의 구축 및 주입.

출처: Zamboni, M., et al., induction of leptomeningeal cells modification by cisternal injection. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 유도 약물을 전달하는 절차를 보여줍니다. 주사는 형광 영상으로 확인된 뇌척수액을 통해 접근할 수 있는 뇌 표면 세포에서 형광 마커 발현을 선택적으로 유도합니다.

Cisterna Magna Injection을 통한 마우스 모델의 표적 약물 전달

출처: Lim, M., et al. 암세포의 내부 경동맥 주입에 의한 뇌 전이 모델링. J. Vis. Exp. (2022)이 영상에서는 마취된 쥐가 암세포를 총경동맥(CCA)에 주입하여 뇌로의 표적 전달을 촉진하는 수술을 받습니다. 이 시술에는 경동맥의 정확한 봉합 및 조작이 포함되어 주입된 세포를 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 하여 시간이 지남에 따라 뇌의 종양 형성을 촉진합니다.

암세포의 내부 경동맥 주입을 통한 뇌종양 전이 모델링

출처: Leda, AR, et al. 내경동맥을 통해 CNS로 표적 물질을 전달하기 위한 마우스 미세수술 주입 기술. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 내경동맥(ICA)을 통해 테스트 물질을 뇌에 표적으로 주입하는 것을 용이하게 하도록 설계된 미세 수술 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 혈류를 일시적으로 제한하여 제어된 전달을 보장하기 위한 정밀한 봉합과 혈관 조작이 포함됩니다. 모세혈관이 외경동맥(ECA)에 삽입되어 분기점을 향해 전진합니다. 주입 시 이 물질은 전신 순환을 우회하고 혈액-뇌 장벽을 통과하여 뇌 실질로의 표적 전달을 달성합니다.

내경동맥으로의 주입을 통한 마우스 뇌로의 표적 물질 전달

혈액 - 뇌 장벽 장애는 뇌에 특정 약물의 전달을 에이즈. 마니 톨은 물리적 장벽을 방해하기 위해 간 arterially 혈관을 수축 주변 세포를 전달했습니다.

혈액 - 뇌 장벽 장애의 쥐 모델 Neurovascular 치료학 타겟이 분명한 허용하려면

치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.

Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

신경 줄기 세포를 전달하는 방법, 용액 또는 현탁액을 주입하기 위한 적응성, 일반적인 경동맥을 통해 (마우스) 또는 외부 경동맥 (쥐) 허혈성 뇌졸중 후보고된다. 주입된 세포는 뇌 의 자당종 전체에 광범위하게 분포되며 전달 후 최대 30d까지 검출될 수 있다.

쥐와 마우스 두뇌에 신경 줄기 세포의 동맥 내 납품: 대뇌 허혈에 응용 프로그램

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 대부분의 뇌 전이 마우스 모델은 사망률 및 치료 개입 결과의 혼란 분석을 혼란시키는 전신 전이에 의해 복잡합니다. 여기에 제시된 것은 최소한의 전신 종양으로 일관된 두개 내 종양을 생성하는 암세포의 내 경동맥 주사를위한 프로토콜입니다.

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

주입 후 마우스 모델에서 경동맥 내 동맥을 복구하면 주입된 물질의 분포에 부정적인 영향을 미치지 않고 동맥으로의 혈류가 되돌아갑니다. 주사 부위 복구는 동일한 동맥을 통한 후속 주입을 용이하게 하고 완전한 Circle of Willis가 없는 마우스 균주에서 뇌 허혈을 예방합니다.

새로운 주입 부위 복구 기법을 통한 마우스 모델의 반복 경동맥 내 주입 촉진

여기에서는 미니 뇌졸중 모델에서 유세포 분석을 사용하여 허혈성 뇌졸중 후 면역 세포 기능을 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 신경면역 상호 작용을 자세히 검사할 수 있으며 다른 신경퇴행성 질환을 연구하는 데 적용할 수 있어 뇌졸중 병리학의 면역 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

학습하세요 마우스 미세주입 기술을 통해 내부 경동맥으로 뇌에 약물을 전달하는 방법을. 최소 침습으로 신경망을 보존하며 높은 농도의 물질 전달이 가능합니다.

중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

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