중추 신경계에 대상 물질 전달을위한 마우스 미세 주입 기술를 통해 내부 경동맥

이 수술 기법의 전반적인 목표는 외인성 물질을 두개골을 관통하지 않고 쥐의 뇌로 전달하는 것입니다. 이 방법은 뇌에서 약물, 병원균 및 엑소좀의 작용에 관한 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 동물에게 최소한의 외상을 입히고, 신경 네트워크의 무결성을 보존하며, 뇌에서 높은 농도의 물질을 얻을 수 있다는 것입니다.

먼저 산소와 혼합된 이소플루란을 투여하여 유도실에서 마우스를 마취합니다. 마취 유도 후 실체 현미경으로 동물을 수술 표면으로 옮기고 노즈 콘을 배치하여 수술 마취 평면을 유지합니다. 헐떡임 없이 호흡수가 초당 약 1-2회 호흡이 되도록 합니다.

또한 동물이 수염 자극이나 발가락 꼬집기에 반응하지 않도록 하십시오. 멸균 면봉을 사용하여 각 눈에 안과 윤활제를 한 방울 떨어뜨려 건조를 방지합니다. 면도기로 수술 부위를 면도한 후 70% 에탄올과 클로르헥시딘을 바르십시오.

실체 현미경을 통해 보면서 수술용 가위와 집게를 사용하여 흉골 위에서 턱 아래까지 목의 정중선을 절개합니다. 겸자를 사용하여 지방 조직과 결합 조직을 조심스럽게 분리하여 기관을 노출시킵니다. 그런 다음 직경 5cm 정도의 부드럽고 둥근 물체를 목 뒤쪽 아래에 놓아 목을 확장하고 해당 부위를 더 노출시킵니다.

그런 다음 고리나 조직 견인기를 사용하여 기관 주위의 조직을 분리합니다. 기관의 왼쪽에서 결합 조직을 조심스럽게 핀셋으로 분리하여 왼쪽 총경동맥(CCA)을 드러냅니다. 겸자를 사용하여 모든 결합 조직을 조심스럽게 제거하여 외부 및 내부 경동맥의 시작 부분에 있는 CCA 분기를 노출시킵니다.

ECA와 ICA가 노출되면 겸자를 사용하여 1cm 나일론 봉합사 부분을 외부 경동맥 아래에 놓습니다. 그런 다음 두 번째 1cm 세그먼트를 배치합니다. 그런 다음 ECA의 가능한 가장 높은 지점에서 영구 매듭을 묶습니다.

ECA의 가능한 가장 낮은 지점, CCA 분기점 바로 위에 더 느슨하고 제거 가능한 매듭을 묶습니다. 그런 다음 용기 클립을 사용하여 가능한 가장 낮은 지점에서 CCA를 닫고 ICA를 닫습니다. 외부 경동맥을 작게 절개하기 전에 내부 경동맥을 적절하게 닫으면 출혈을 방지할 수 있습니다.

이제 미세 해부 스프링 가위를 사용하여 두 매듭 사이의 ECA를 2mm 자릅니다. 큰 절단은 물질의 누출을 유발하므로 절단을 작게 유지하는 것이 중요합니다. 주입할 물질 250마이크로리터가 들어 있는 투베르쿨린 주사기에 6인치의 모세관 튜브를 부착하여 주입 시스템을 조립합니다.

그런 다음 모세관 튜브의 끝을 ECA의 절개 부위에 부드럽게 삽입합니다. 분기점과 CCA의 클립 사이의 중간에 도달할 때까지 팁을 계속 전진시킵니다. 아래쪽 ECA 매듭을 묶습니다.

매듭이 모세관 유동성을 허용할 만큼 느슨하고 누출을 방지할 수 있을 만큼 충분히 조여져 있는지 확인합니다. 그런 다음 ICA에서 클립을 제거합니다. 주사기 피스톤에 부드럽게 압력을 가하여 초당 약 10마이크로리터의 속도로 물질을 주입할 수 있습니다.

테스트 물질을 주입한 후 클립을 ICA에 다시 놓습니다. 모세관 튜브를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 아래쪽 ECA 매듭을 완전히 묶습니다.

ICA 및 CCA에서 클립을 제거합니다. 그런 다음 견인기 또는 티슈 고리와 베개를 제거합니다. 멸균 식염수로 봉합할 부위를 세척한 후 나일론 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다.

수술 후 불편함을 완화하기 위해 승인된 항염증제와 진통제를 투여한 후, 동물을 케이지에 넣고 최소 1시간 동안 발열 패드를 놓고 회복 상태를 모니터링합니다. 이 히스토그램은 좌측 내부 경동맥을 통해 바이러스 주입 7일 후 실시간 PCR에 의한 HIV 검출을 보여줍니다. 예상대로 바이러스 수치는 좌반구에서 더 높습니다.

이 면역형광 이미지는 내부 경동맥을 통해 세포외 소포를 주입한 후 엑소좀 마커인 GFP 태그 CD63을 묘사하는 쥐의 뇌 단면을 보여줍니다. 녹색으로 표시된 세포외 소포체를 발현하는 CD63은 쥐의 뇌 미세혈관과 관련이 있습니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 20분 안에 완료할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 신경퇴행성 질환 분야의 연구자들이 생쥐의 약물, 병원체 및 엑소좀 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.