질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기 초파리

이 절차의 전반적인 목표는 특정 염색 없이 노화, 유전자 변형 또는 환경적 영향을 포함한 다양한 요인으로 인해 발생하는 초파리 뇌의 신경 퇴행을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 신경퇴행성 질환 분야의 핵심 질문을 분석하는 데 매우 유용합니다. 예를 들어, 어떤 유전자 또는 환경적 요인이 이러한 질병을 유발하거나 기여합니까?

이 방법의 주요 장점은 대조 파리와 실험 파리가 하나의 샘플로 취급되기 때문에 체계적인 오류를 피하거나 최소화한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 뇌의 올바른 영역이 슬라이드에 있는지 확인하고 절단 중에 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시작하려면 먼저 집게를 사용하여 피험자의 목을 따라 목걸이에 실을 꿰십시오.

모든 머리를 같은 방향으로 정렬하고 머리나 눈이 손상되지 않도록 합니다. 섹션에서 파리의 순서를 쉽게 식별할 수 있도록 알려진 위치에 Eyeless Senoculus Fies를 무작위로 포함합니다. 또한, 관심 있는 파리 균주가 밝은 눈 또는 흰 눈을 가지고 있는 경우, 슬라이드를 염색하기에 충분한 색소가 존재하는지 확인하기 위해 스트립을 따라 간격을 두고 붉은 눈 파리가 날아갑니다.

파리의 순서를 기록하고, 하나 이상이 사용된 경우 목걸이 번호와 함께 기록하십시오. 목걸이가 완성되면 Carnoy의 용액에 3점 5-4시간 동안 놓습니다. 일련의 에탄올, 메틸 벤조에이트 및 파라핀 세척을 수행하여 파리 조직이 포매될 준비를 합니다.

다음으로, 섹션별로 고무 얼음 트레이에 목걸이를 놓습니다. 녹은 파라핀을 옷깃 위에 부드럽게 붓고 기포를 피하고 밤새 굳어지도록 합니다. 트레이에서 칼라가 들어 있는 파라핀 블록을 제거합니다.

면도날을 사용하여 칼라에서 파라핀 블록을 분리합니다. 옷깃을 부드럽게 떼어냅니다. 몸체는 칼라에 남아 있고 머리는 파라핀 블록에 남아 있습니다.

조직을 절단하려면 먼저 가열판을 섭씨 50도로 가열합니다. 면도날이나 금속 장착 블록과 같이 왁스와 접촉할 수 있는 도구를 접시에 올려 따뜻하게 합니다. 원하는 절편 방향을 결정한 다음 파라핀 세그먼트를 접촉 측에서 잠시 용융하여 장착 블록에 부착합니다.

면도날을 사용하여 플라이 헤드에서 여분의 파라핀을 잘라내어 내장된 헤드를 포함하는 작은 줄만 남도록 합니다. 장착 블록을 Microtome의 개체 홀더에 놓고 헤드를 블레이드 가장자리와 평행하게 정렬합니다. 7개의 마이크로미터 절편을 자르고 절편의 리본을 현미경 슬라이드로 옮깁니다.

리본이 팽창할 수 있도록 섭씨 37도의 가열된 플레이트에 약 1분 동안 슬라이드를 놓습니다. 여분의 물을 제거한 다음 슬라이드를 밤새 더 건조시키십시오. 건조되면 파라핀 제거제로 채워진 키가 큰 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 수직으로 놓고 30분에서 1시간 동안 파라핀 왁스를 제거합니다.

이 세척을 세 번 반복합니다. 마지막으로 용기에서 슬라이드를 제거하고 각 슬라이드에 매립 미디어 두 방울을 떨어뜨립니다. 섹션을 큰 커버 슬립으로 덮고 슬라이드를 하루에서 이틀 동안 건조시킵니다.

형광 현미경의 저배율에서 뇌의 방향을 결정하고 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 이 영역이 식별되면 필요한 이미지를 촬영합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 머리 당 액포 수를 세십시오.

관심 있는 액포를 선택하고 커버된 픽셀 수를 결정하여 액포 크기를 측정합니다. 이 이미지는 왼쪽에서 오른쪽으로 향하는 다른 플라이 헤드의 섹션을 보여줍니다. 위에서 아래로, 동일한 플라이 헤드의 연속적인 단면이 시각화됩니다.

Eyeless Senoculus 컨트롤 플라이는 화살표로 표시됩니다. 단면은 자연적으로 존재하는 형광 눈 색소에 의해 염색되며, 이는 절단하는 동안 단면을 씻어냅니다. 7일, 14일, 21일령 스위스 치즈 원 파리의 파라핀 머리 부분은 액포 수와 면적이 연령과 관련하여 점진적으로 증가하는 것을 보여줍니다.

이 퇴화는 액포를 세고 결합된 면적을 계산하여 정량화할 수 있으며 유의한 것으로 밝혀졌습니다. 마찬가지로, 야생형 파리의 경우 나이가 들면서 신경 퇴화가 발생하는 것으로 나타났습니다. 10일, 30일, 60일 야생형 파리의 머리 부분을 조사한 결과, 10일 상태에서 액포가 거의 또는 전혀 형성되지 않은 것으로 나타났습니다.

30일 된 사람들의 뇌에서 액포가 형성되기 시작했습니다. 60일 개체에서는 훨씬 더 많고 더 큰 면적의 액포가 존재했습니다. 마스터하면 일주일 이내에 섹션을 분석할 수 있습니다.

이 절차를 사용할 때는 목걸이에 있는 파리의 순서를 주의 깊게 기록하는 것이 중요합니다. 나중에 분석 후 식별할 수 있도록 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 섹션을 준비하고 초파리 뇌에서 발견되는 신경 퇴행을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.