공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

이 절차의 전반적인 목표는 KSHV에 감염된 내피 세포에서 연령 및 계대 일치 모의를 준비하여 적절한 대조군의 맥락에서 악성 변형을 유발하는 변경을 포함하여 숙주 세포 유전자 발현의 KSHV 관련 변화를 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 KSHV 관련 암을 유발하는 숙주 세포 생물학의 주요 병태생리학적 변화를 정의하는 데 도움이 될 수 있으므로 질병 예방 또는 치료를 위한 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 이 시스템의 주요 장점은 KSHV 감염 후 내피 세포의 악성 변형이 빠르고 재현 가능하게 발생하여 연령 및 계대가 일치하는 대조 세포를 사용하여 발암 과정의 초기 이벤트를 연구할 수 있다는 것입니다.

이 바이러스 종양 발생 모델은 카포시 육종 발병에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 암 유형에도 적용될 수 있습니다. 카포시 육종은 혈관 종양이기 때문에 이 세포 배양 모델의 의미는 병리학적 혈관 신생에 의해 유발되는 다른 질병 과정을 이해하는 데까지 확장됩니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멸균된 TNE 버퍼를 준비하고 필터링합니다.

그런 다음 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 60ml의 RPMI 배지로 채워진 T150 플라스크에서 KSHV 양성 EBV 음성 1차 삼출 림프종 세포주 BCBL-1을 배양합니다. 셀을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하여 약 1-1.2 곱하기 10-밀리리터당 6번째 셀의 현탁액을 얻습니다.

적절한 밀도에 도달하면 새로운 배지로 세포를 1-2로 분할하고 PMA를 밀리리터당 20나노그램의 최종 농도로 첨가하여 KSHV 생산을 유도합니다. 그런 다음 5일 동안 배양물을 배양합니다. 5일간의 배양 후 실온에서 5분 동안 300배 g의 세포 현탁액을 회전시켜 바이러스 입자를 수확합니다.

그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 상층액을 섭씨 4도에서 2, 500배 g에서 10분 동안 다시 한 번 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 이제 명확 해졌으므로 TNE에 5 밀리리터의 25 % 자당 용액을 6 개의 초 원심 분리 튜브에 약 30 밀리리터의 상층액과 오버레이합니다.

진공 상태에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 75, 000회 g로 균형 잡힌 튜브를 원심분리하십시오. 원심분리가 완료되면 상층액을 디캔팅하고 각 튜브의 가장자리를 닦아내어 액체를 최대한 많이 제거합니다. 그런 다음 펠릿화된 바이러스를 150마이크로리터의 TNE 완충액에 재현탁시키고 모든 샘플을 풀링합니다.

풀링된 현탁액을 철저히 혼합하고 25마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 재고 바이러스는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. T75 플라스크에서 EGM 배지의 1차 인간 피부 미세혈관 또는 림프 내피 세포를 배양합니다.

약 50%의 합류점에 도달할 때까지 세포 배양을 섭씨 37도, 5% 이산화탄소로 유지합니다. 내피 세포 형질도입 전에 PA317 LXSN 16E6E7 세포를 섭씨 37도에서 20ml의 DMEM으로 채워진 T150 세포 배양 플라스크에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 약 90%의 합류가 이루어지면 PA317 세포 배양의 배지를 16ml의 새로운 배지로 교체하고 밤새 세포를 배양합니다.

하룻밤 배양 후 PA317 세포 배양액에서 배지를 채취하고 실온에서 5분 동안 300배 g의 원심분리로 정화합니다. 50% confluent 내피 세포 배양의 EGM 배지를 12ml의 정화된 PA317 배지로 교체합니다. 세포를 4시간 동안 배양합니다.

그런 다음 6ml의 PA317 배지를 6ml의 새 EGM 배지로 교체하고 밤새 세포를 배양합니다. 그 후, 내피 세포 배양에서 배지를 제거하고 12ml의 신선한 EGM을 세포에 공급합니다. 추가로 48시간 동안 세포를 계속 배양합니다.

내피 세포를 계대배양하려면 배지를 제거하고 12ml의 양이온이 없는 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 상업용 효소 해리 용액 3ml를 추가하고 섭씨 37도에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300배 g으로 세포를 원심분리합니다.

펠릿화되면 새로운 EGM 배지에 세포를 재현탁하고 현탁액을 3개의 T75 플라스크로 고르게 나눕니다. 배양물의 부피를 플라스크당 EGM 12ml로 조정합니다. 그런 다음 G418을 밀리리터당 200마이크로그램으로 첨가하여 형질도입된 내피 세포를 선택합니다.

앞서 보여준 바와 같이 효소 분해에 의해 형질도입된 내피 세포를 수확합니다. 내피 세포 펠릿을 EGM 배지 1ml에 재현탁합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 세포 현탁액과 45마이크로리터의 Trypan Blue Solution을 혼합하고 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.

6웰 플레이트의 웰당 2ml의 EGM 배지 2ml에 2.5배의 생존 가능한 세포를 10배로 파종합니다. 다음 날, EGM 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 3ml로 각 웰의 세포를 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 EBM 배지를 추가합니다.

세포를 KSHV로 감염시키려면 각 웰에 5-20마이크로리터의 바이러스 스톡을 추가하고 플레이트를 소용돌이쳐 현탁액을 혼합합니다. 모의 감염 세포를 포함하는 각 웰에 동일한 부피의 TNE 완충액을 추가합니다. 플레이트를 400배의 g으로 실온에서 30분간 원심분리한 후 섭씨 37도에서 90분간 배양합니다.

그런 다음 각 웰에 2ml의 EGM 배지를 추가하고 밤새 배양물을 배양합니다. 배양 후 각 웰에서 EGM 배지를 제거하고 2ml의 새 EGM으로 교체합니다. 세포가 약 90% 합류점에 도달하면 앞서 보여준 것처럼 효소 분해로 세포를 수확합니다.

3개의 웰에서 세포를 감염 후 통과 경로의 총 통과 경수로 표시된 T75 플라스크에 모읍니다. 테스트 또는 동결 전에 모의 세포 및 KSHV에 감염된 내피 세포 배양을 최소 2개의 추가 계대에 대해 1개에서 3개로 분할하여 확장합니다. 여기에 제시된 것은 모의에 감염된 내피 세포의 합류 현미경 이미지로, 고전적인 조약돌 모양을 드러냅니다.

이러한 세포의 세포 분열은 배양액이 합류점에 도달할 때 접촉 시 억제됩니다. KSHV에 감염된 내피 세포는 카포시 육종 방추 세포를 연상시키는 길쭉한 방추체 모양의 형태를 발달시킵니다. 모의 감염 세포와 달리 KSHV에 감염된 내피 세포는 합류점에 도달하더라도 계속 증식하여 다층 세포 병소를 발달시킵니다.

기질과의 접촉이 끊어지면 모의 감염된 내피 세포는 자가사멸 세포 사멸(anoikis)을 겪게 되며, 부드러운 한천에서 군체를 형성하지 않습니다. 반대로, KSHV에 감염된 세포는 부드러운 한천에서 배양할 때 아노이키와 성장 군체에 내성이 있습니다. KSHV에 감염된 내피 세포에서 방추 모양의 형태학의 발달은 바이러스 잠복 단백질 ORF73 및 그보다는 덜하지만 바이러스 진행성 인자 ORF59의 발현을 동반합니다.

녹색 형광 단백질이 태그된 KSHV BAC16에 감염되었을 때, 내피 세포는 방추체 모양의 형태를 발달시켰고 GFP 발현을 보여주어 관찰된 표현형에서 KSHV 감염 사이의 우연한 관계를 확인했습니다. 개발 후 이 세포 배양 모델은 연구자들이 KSHV 감염에 의해 유도된 숙주 세포 mRNA 및 단백질 발현의 변화를 평가할 수 있는 길을 열었습니다. 결과적으로, 유망한 치료 표적을 나타내는 KSHV 매개 종양 발생의 기저에 있는 주요 병원성 메커니즘이 확인되었습니다.

KSHV는 BSL-2 제제이므로 적절한 생물 안전성 억제 절차 및 관행에 따라 처리해야 한다는 것을 잊지 마십시오.