Name: 공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 학습하세요 KSHV 감염에 의한 혈관내피세포의 악성 전환 메커니즘을 생체 외 배양 모델을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 카포시 육종 및 혈관신생 관련 질환의 새로운 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 지원 K12 HD068322 (SCM)에 의해; R01 CA179921 및 P51 OD011092 (AVM); 그리고 수상 14PRE20320014 미국 심장 협회 (SB)에서.

참고: BSL-2 조건 하에서이 프로토콜에서 설명 하는 모든 절차를 수행 합니다.
 1. KSHV 재고 준비 <ol><li>준비 TNE 버퍼: ddH 2 O 292.24 mg EDTA를 해산, 225 mL를 가져오고 pH 8에 조정. DdH 2 O 605.7 mg Tris를 녹이, 225 mL을 고 pH 8에 조정. EDTA와 트리 스 솔루션을 결합, 4.38 g NaCl을 추가, 500 mL를 최종 볼륨을 조정, 필터링, 소독 및 4 ° C .에서 저장</li>
	<li>문화 KSHV 긍정, 5% CO 2 RPMI 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 약 1 제 보충에 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 EBV 부정적인 기본 유출 림프 종 셀 선 BCBL-1 mL 당 10 6 셀 x 1.2.</li>
	<li>KSHV 생산을 유도 하기 위해 신선한 매체와 문화 1:2 분할 및 20 ng/mL의 최종 농도에 Phorbol Myristate 12 13-아세테이트 (PMA)을 추가 하 고 5 일에 대 한 문화를 품 어. 대신, 나트륨 낙 산 염 (NaB, 0.1 m m) 용균성 바이러스 성 복제를 유도 하기 위해 3 일에 대 한 세포 치료.</li>
	<li>바이러스 성 입자를 수확, 먼저 작은 셀을 신선한 튜브 supernatants 전송 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 표면에 뜨는 문화 원심.</li>
	더 명확히 세포질 파편의 전송을 피하기 상쾌한 <li>4에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 ° c. 
	참고:로 명확한 문화 supernatants의 여과 살 균 0.45 μ m 필터를 수행할 수 있습니다 통해 고속 원심 분리에 대안. 우리는 여과;를 사용 하 여 titer에 상당한 드롭 관찰 따라서, 우리가 일상적으로 수행 두 번째 원심 분리 단계 대신.</li>
	<li>다음, 6 ultracentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 명확히 문화의 약 30 mL와 TNE 버퍼에서 25% 자당 해결책의 5 mL을 오버레이.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 진공에서 4 ° C에서 2 시간에 대 한 75000 x g에서 균형.</li>
	<li>문화 표면에 뜨는 가만히 따르다, 가능한 만큼 상쾌한 및 자당 솔루션을 제거 하려면 각 튜브의 오 점 그리고 TNE 버퍼의 150 µ L에 표시 되지 않을 수 있습니다 바이러스 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>수영장 모든 resuspended 바이러스, 잘, 그리고 동결-80 ° C .에서 25 µ L aliquots</li>
</ol> 2. E 6와 E7 유 두 종 바이러스 유전자 EC의 변환 참고: 우리는 일상적으로 기본 적 성장을 위한 표준 조직 배양 플라스 크를 사용 그러나, EC의 불만족 성장을 가져온 경우 다음 상업 문화 플라스 크를 사용 하 여 고려해 야 합니다.
<ol><li>문화 기본 인간의 피부 microvascular 또는 림프 EC 5% 플러스 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 CO 2 EC 성장 매체에서 (EGM; EC 기저 매체 [EBM] EGM-2 BulletKit [FBS, 포함 된 보충을 포함 날린, 인간 섬유 아 세포 성장 인자-B, 혈관 EC 성장 인자, 인슐린 같은 성장 인자-1, 아 스 코르 빈 산, 인간 상피 성장 인자, 항생제, 및 헤 파 린]) 약 50% 합류 하 T75 셀 문화 플라스 크에.</li>
	<li>변환, 문화 PA317 LXSN 16E6E7 세포 37 ° C에 습도 인큐베이터에서 24 , 35 플러스 5% CO 2 DMEM 10 %FBS에 제 보충에 T150 셀 문화 플라스 크 들은 약 90% 합칠 때까지. 다음 매체의 16 mL에서 밤새 품 어.</li>
	<li>Centrifuging 300 x g 실 온에서 5 분에 의해 PA317 매체를 명확히.</li>
	<li>명확히 PA317 매체의 12 mL와 EC 문화와 오버레이 셀에서는 EGM를 제거 하 고 4 헤에 대 한 품 어 
	참고: Centrifuging 16 mL 5 분 결과 명확히 상쾌한의 12 mL의 주의 후속 제거에 의해 방해 하지 소형 펠 릿에 대 한 300 x g에서 조절된 하는 매체의. 그러나, 필요한 경우 기본 EC 문화 PA317 LXSN 16E6E7 셀의 전송 (포장 셀 라인은 신속 하 게 자라 다 EC), 다음 전송 되기 전에 0.45 μ m 필터를 통해 바른된 상쾌한의 여과 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>밤새 품 어 고 신선한 EGM PA317 매체의 6 mL.</li>
	<li>Refeed EC 12 mL와 함께 신선한 EGM 추가 48 헤 알을 품고 고</li>
	<li>EC, 하위 문화 매체를 제거 없이 양이온, PBS의 12 mL로 씻어 여 상업 효소 분리 솔루션 (예를 들어, TrypLE)의 3 개 mL를 추가 그리고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심. 결과 셀 펠 릿 신선한 EGM에서 resuspend와 3 x T75 플라스 플라스 크 당 12 mL EGM의 최종 볼륨을 균등 하 게 나눌.</li>
	<li>E6 및 E7 불리고 EC에 대 한 선택, 두 구절, 후 transduced EC 수 있습니다 감염에 대 한 도금 또는 액체 질소에서 냉동에 대 한 200 µ g/mL의 최종 농도에 G418 추가.</li>
</ol> 3. KSHV로 불리고 EC의 감염 <ol><li>감염 전날에 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 EC 수확. EGM의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 셀의 5 µ L를 사용 하 여 준비 Trypan 블루에서 1/10 희석. hemocytometer를 사용 하 여 라이브 셀 및 씨앗 10 5 라이브 셀 6 잘 플레이트에 잘 당 EGM의 2 mL x 2.5.</li>
	<li>감염의 날, EGM 제거 잘, 당 3 mL PBS의 칼슘과 마그네슘을 가진 세포를 씻어 고 다음 추가 2 mL EBM. 
	참고: 그것은 필수적 이다 감염, 동안 EGM 보다 EBM을 사용 하도록 EGM에서 헤 파 린을 바이러스 성 입자의 바인딩 및 대상 적의 후속 감염 억제</li>
	<li>KSHV, 세포를 감염 시킬 각 음을 5 ~ 20 µ L 바이러스 주식을 추가 하 고 소용돌이를 섞어 접시. 모의 감염 된 세포 각 잘 하는 같은 TNE 버퍼 양의 추가.</li>
	<li>실 온에서 30 분 400 x g에서 격판덮개 원심 고 90 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어</li>
	<li>연구의 목표는 조사 초기 이벤트 동기 바이러스 감염, 예를 들면에 드 노 보 감염 초기 이벤트를 요구 하는 경우이 시점에서 바이러스 inoculum을 제거 합니다. 린스 및 2 mL와 함께 셀 refeed 신선한 EGM. 그렇지 않으면, 2 mL EGM 추가 하 고 밤새 문화를 품 어.</li>
	<li>감염 후 다음 매일 2 mL EGM 셀 하루 refeed.</li>
	<li>셀은 약 90% 합칠 때 위에서 설명한 대로 상업 효소 분리 솔루션을 사용 하 여 효소 소화에 의해 수확 후 총 통과 번호와 통로 지적 T75에 3 개의 우물에서 셀 풀 감염 된 후.</li>
	<li>모의 및 KSHV-감염 된 EC 어느 시간에 세포 실험에 사용 하거나 수 액체 질소에서 냉동 두 개 이상의 더 많은 구절에 대 한 1:3 분할으로 확장. 
	참고: e 6와 E7 불리고 EC의 분할와 마찬가지로 모의 KSHV 감염 세포의 유지 보수 문화 분할 해야 합류 (85 ~ 90%)에 도달 하기 전에.</li></ol>
 4. 면역 형광에 의해 KSHV 감염 확인 참고: KSHV 대기 시간 관련 핵 항 (라-1/ORF73)의 감염의 신뢰할 수 있는 양적 측정을 제공 합니다. 안티-라 나 항 체는 상용.
<ol><li>얼룩, 전날 플레이트 두 웰 스와 모의 또는 KSHV-감염 된 EC 1 x 10 5에서 24-잘 접시에 각각 당 세포 1 mL EGM에서에서 잘 하 고 밤새 품 어.</li>
	<li>세척 셀 두 번 500 µ L PBS 플러스 칼슘과 magniseum의. 30에 대 한 세척 락 플랫폼에 s.</li>
	<li>외부 ventillated 연기 후드, 실 온에서 15 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 세포 수정.</li>
	<li>셀 워시 버퍼 (0.1% 트라이 톤 X-100 플러스 PBS 플러스 양이온에 0.02% 염소 혈 청)의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 2% 염소 혈 청의 500 µ L로 세포를 차단.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>라벨의 모의 또는 KSHV-감염 된 200 µ L의 1 차적인 항 체와 EC 1시 10분 희석 한 잘로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에 0. 워시 버퍼만의 200 µ L에서 나머지 두 개의 우물을 품 어.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>로커에 실 온에서 30 분 동안 세척 버퍼에서 이차 항 체 희석 1: 100의 200 µ L로 모든 4 개의 우물을 라벨.</li>
	<li>셀 워시 버퍼의 500 µ L로 세 번 세척.</li>
	<li>각 잘 하려면 중간 포함 DAPI를 탑재 하는 coverslip 20 µ L을 적용 하 고 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 얼룩을 평가.</li>
	<li>적어도 200 셀에서 라 나 긍정적인 핵의 수를 계산 하 여 KSHV에 감염 된 세포의 백분율 감염을 확인 합니다. 재조합 KSHV Bac16 또한 GFP의 표현 위한 문화의 관찰을 통해 감시 될 수 있다 감염.</li>
</ol>

없음입니다.

발암 circumvents36는 유기 체 내에서 중요 한 보호 하는 다단계 프로세스입니다. KS 병 변 진정한 sarcomas에 만성 염증의 스펙트럼을 따라 존재, KSHV에 의해 중재 특정 pathophysiological 프로세스의 변환9를 지 원하는 셀 문화 모델에 몇 가지 연구를 실시 해야 합니다. 그것은 접촉 금지 및 앵커리지 종속 성장, 고기 세포 변화의 지표로 쉽게 개발 하지 않습니다 주목 해야한다 기본 EC 또는 EC telomerase의 외 인 식으로 불후의 감염 다음. 따라서, 여기에 설명 된 KS의 생체 외에서 모델 KS 종양 microenvironment의 모든 측면을 하거나 explanted KS 셀의 동작 정리 하지 않습니다, 하는 동안 그것은 감염에 의해 유도 된 호스트 세포 유전자 발현에 변화를 공부 하 고 적합 KS tumorigenesis 기여할 KSHV
<p class="jove_cont...

Kaposi 육 종 (KS)은 고급 면역 억제1의 설정에서 가장 일반적으로 발전 하는 다중 초점 angioproliferative 종양, 점 막, 피부 및 내장 사이트에 영향을 미치는. 4 개의 역학 양식 설명: 클래식, 일반적으로 지중해와 중동 유산;의 노인 들에 영향을 미치는 나태 한 형태 의원 성, 장기 이식; 다음 면역 억제 약물과 치료 결과 전염병, 에이즈-정의 암; 그리고 발병, 아프리카에서 풍토 성 지역에서 아이 들에 있는 일반적인 HIV 독립적인 형태. 에이즈의 치료에 대 한 효과적인 조합 방지 retroviral 약물 regimens의 도래와 함께 전염병 KS 훨씬 덜 일반적으로 개발 도상국에서 진단 이다. 그러나, 임상 적극적인 지방 병 및 전염병 양식 많은 아프리카 국가2,,34진단된 암 중 가장 일반적으로 남아 있습니다. 따라서, KS의 치료에 대 한 효과적인 병 인 대상 약물의 식별은 연구 우선권 이다.
조직학, EC 근원의 스핀 들 세포 불연속 혈관 네트워크5를 형성 하는 의하여 광범위 한 하지만 비정상적인 neovascularization KS 병 변 특징 이다. 이러한 비정상적인 혈관 ("혈관 슬릿") 그들의 독특한 색깔 장애를 주는 적혈구의 넘쳐 흐름을 수 있습니다. 또한, 병 변 수많은 백혈구 (림프 톨, 대 식 세포, 및 플라스마 세포) 만성 염증의 특성을 포함 합니다. KS 병 변 면역 재구성 다음의 회귀, KS 하이퍼 증식 병 변 및 진정한 종양6,,78,9의 기능을가지고 제안 설명 하고있다.
KS herpesvirus (KSHV), KS의 원인이 되는 대리인 199410에서 확인 되었다. 그때 많은 체 외에서 세포 배양 모델 개발 되었습니다 이후 병 인 연구를 활성화 하려면 셀을 포함 하 여 explanted 종양 생 검 재료와 기본에서 또는 telomerase를 표현 EC 감염 KSHV 생체 외에서11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. 현재 사용 가능한 모델의 아무도 완벽 하 게 KS 종양 microenvironment이 하지만 모든 KSHV 감염의 pathobiology의 우리의 이해에 귀중 한 지식을 공헌 했다. 다른 알려진된 tumorigenic 인간 herpesvirus 엡 스타인-바 바이러스 (EBV), 달리 KSHV 않습니다 하지 쉽게 변형 문화 드 노 보 감염19,20,21, 다음에 셀 그러나 22., microvascular 또는 림프는 E6 혼합의 기본 인간의 EC를 시험 하 여이 한계를 극복 하 고 인간 유 두 종에서 E7 유전자 입력 KSHV23,24 감염 전에 16 . 이러한 외 인 oncogenes의 표현은 극적으로 retinoblastoma 단백질 및 p5323,24의 저해를 추가 제공 하 여 일부에 KSHV에서 생체 외에서 의 변형 잠재력을 증가 한다. 이 EC 변환 방법은 키 변경 호스트를 식별 하기 위해 여러 실험실 세포 유전자 발현에 KSHV 감염에 의해 유도 된다 고 KS 세포 생존과 확산25,26 촉진을 나타나는 수 있다 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. 여기에 설명 된 프로토콜 간단 하 고 매우 재현, 그리고 나이 고 통과 일치 KSHV 감염 EC 및 모의 감염 컨트롤까지 1 차 셀 이상 경작 될 수 것입니다 생성 귀 착될 것 이다 종양 메커니즘 KSHV에 의해 고용의 수사에 대 한 허용. 프로토콜 기본 유출 림프 종 세포 선 BCBL-1, E6/E7 불후 EC에서에서 KSHV에 매우 취약도 야생 타입의 생산을 위한 메서드가 포함 되어 있지만 감염 재조합 BACmid KSHV BAC1630파생. BAC16의 준비에 대 한 프로토콜은 설명 되어33,34.

<table><tbody><tr><td>BCBL-1 세포</td><td>NIH AIDS 시약 프로그램</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>PA317 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>신생아 피부 미세혈관 내피 세포</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 기초 매체</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA/ORF 73</td><td>Advanced Biotechnologies</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLETMExpress, 칼슘</td><td></td><td></td>과 마그네슘이 함유된 페놀 레드 ThermoFisher 12604013 <td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> 없음 <td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

공부 하는 kaposi 육 종 herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi 육 종 (KS) KSHV, 내 피 세포 (EC)의 감염에 의해 시작 되 고 면역 억제의 설정에서 가장 자주 개발 확산 스핀 들 세포의 구성 된 특이 한 종양 이다. 연구의 십 년간에 불구 하 고 KS의 최적의 치료 남아 가난 하 게 정의 하 고 임상 결과 리소스 제한 설정에 특히 유리한 되지 않습니다. KS 병 변은 병 적인 신생, 만성 염증 및 발암에 의해 구동 됩니다 하 고 다양 한 생체 외에서 세포 문화 모델 이러한 프로세스 연구 개발 되었습니다. 그래서 EC 계보 세포 제공 스핀 들 세포 선구자의 가장 적합 한 생체 외에서 서로게이트 KS 내 피 기원, KSHV에 감염 된 세포에서 발생 합니다. 그러나, EC 수명이 제한 된 생체 외에서 때문에 그리고 KSHV에 의해 고용 되어 종양 메커니즘은 tumorigenic 다른 바이러스의 그들 보다, 그것은 어려운 되었습니다에서 변환의 과정을 평가 하기 위해 또는 telomerase 불후 적 따라서, 소설 EC 기반 문화 모델 쉽게 변환 KSHV 감염 다음을 지 원하는 개발 되었다. 인간 papillomavirus 유형 16의 E6 및 E7 유전자의 소성 식 확장된 문화의 나이 및 통로 일치 모의 및 KSHV-감염 된 EC에 대 한 허용 하 고 진정으로 변환의 개발을 지원 합니다 (즉, tumorigenic) 표현 형에 감염 된 세포 배양 . KS의 세공 및 높은 재현성이 모델 임상 설정으로 번역에 대 한 높은 잠재력을 가진 몇 가지 필수적인 신호 통로의 발견을 촉진 했다.

기본 EC의 형태는 고전적인 "자갈 돌"로 설명 하 고이 형태는 유 두 종 바이러스 E6, E7 유전자 (그림 1A)의 표현에 의해 수정 되지 않습니다. 혼자 E6 및 E7 유전자의 표현; 변형 된 표현 형을 유도 하지 않습니다. 따라서, 셀 문의 억제에 취약 하 고 문화에 합류에 도달 시 분할 하는 것을 중단 됩니다. 그러나 셀 증식 하 고 합류 trypsinization와 낮은 밀도, 모의 감염 컨트롤 사용을 위한 연령 및 통행 일치 문화의 유지 보수에 대 한 허용에 replating을 regrow.
KSHV와 E6/E7 불리고 EC의 감염 KS 병 변 (그림 1B)에 "스핀 들 세포" 표현 형의 연상은 문화에 극적인 형태 변화를 발생 합니다. 변형 된 형도는 매니페스트 부분에 접촉 금지의 손실에 의...

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

이 절차의 전반적인 목표는 KSHV에 감염된 내피 세포에서 연령 및 계대 일치 모의를 준비하여 적절한 대조군의 맥락에서 악성 변형을 유발하는 변경을 포함하여 숙주 세포 유전자 발현의 KSHV 관련 변화를 연구할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 KSHV 관련 암을 유발하는 숙주 세포 생물학의 주요 병태생리학적 변화를 정의하는 데 도움이 될 수 있으므로 질병 예방 또는 치료를 위한 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다. 이 시스템의 주요 장점은 KSHV 감염 후 내피 세포의 악성 변형이 빠르고 재현 가능하게 발생하여 연령 및 계대가 일치하는 대조 세포를 사용하여 발암 과정의 초기 이벤트를 연구할 수 있다는 것입니다.이 바이러스 종양 발생 모델은 카포시 육종 발병에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 암 유형에도 적용될 수 있습니다. 카포시 육종은 혈관 종양이기 때문에 이 세포 배양 모델의 의미는 병리학적 혈관 신생에 의해 유발되는 다른 질병 과정을 이해하는 데까지 확장됩니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 멸균된 TNE 버퍼를 준비하고 필터링합니다.그런 다음 용액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. 60ml의 RPMI 배지로 채워진 T150 플라스크에서 KSHV 양성 EBV 음성 1차 삼출 림프종 세포주 BCBL-1을 배양합니다. 셀을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하여 약 1-1.2 곱하기 10-밀리리터당 6번째 셀의 현탁액을 얻습니다.적절한 밀도에 도달하면 새로운 배지로 세포를 1-2로 분할하고 PMA를 밀리리터당 20나노그램의 최종 농도로 첨가하여 KSHV 생산을 유도합니다. 그런 다음 5일 동안 배양물을 배양합니다. 5일간의 배양 후 실온에서 5분 동안 300배 g의 세포 현탁액을 회전시켜 바이러스 입자를 수확합니다.그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 상층액을 섭씨 4도에서 2, 500배 g에서 10분 동안 다시 한 번 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 이제 명확 해졌으므로 TNE에 5 밀리리터의 25 % 자당 용액을 6 개의 초 원심 분리 튜브에 약 30 밀리리터의 상층액과 오버레이합니다.진공 상태에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 75, 000회 g로 균형 잡힌 튜브를 원심분리하십시오. 원심분리가 완료되면 상층액을 디캔팅하고 각 튜브의 가장자리를 닦아내어 액체를 최대한 많이 제거합니다. 그런 다음 펠릿화된 바이러스를 150마이크로리터의 TNE 완충액에 재현탁시키고 모든 샘플을 풀링합니다.풀링된 현탁액을 철저히 혼합하고 25마이크로리터 분취액으로 나눕니다. 재고 바이러스는 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. T75 플라스크에서 EGM 배지의 1차 인간 피부 미세혈관 또는 림프 내피 세포를 배양합니다.약 50%의 합류점에 도달할 때까지 세포 배양을 섭씨 37도, 5% 이산화탄소로 유지합니다. 내피 세포 형질도입 전에 PA317 LXSN 16E6E7 세포를 섭씨 37도에서 20ml의 DMEM으로 채워진 T150 세포 배양 플라스크에서 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 약 90%의 합류가 이루어지면 PA317 세포 배양의 배지를 16ml의 새로운 배지로 교체하고 밤새 세포를 배양합니다.하룻밤 배양 후 PA317 세포 배양액에서 배지를 채취하고 실온에서 5분 동안 300배 g의 원심분리로 정화합니다. 50% confluent 내피 세포 배양의 EGM 배지를 12ml의 정화된 PA317 배지로 교체합니다. 세포를 4시간 동안 배양합니다.그런 다음 6ml의 PA317 배지를 6ml의 새 EGM 배지로 교체하고 밤새 세포를 배양합니다. 그 후, 내피 세포 배양에서 배지를 제거하고 12ml의 신선한 EGM을 세포에 공급합니다. 추가로 48시간 동안 세포를 계속 배양합니다.내피 세포를 계대배양하려면 배지를 제거하고 12ml의 양이온이 없는 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음 상업용 효소 해리 용액 3ml를 추가하고 섭씨 37도에서 3분 동안 세포를 배양합니다. 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 300배 g으로 세포를 원심분리합니다.펠릿화되면 새로운 EGM 배지에 세포를 재현탁하고 현탁액을 3개의 T75 플라스크로 고르게 나눕니다. 배양물의 부피를 플라스크당 EGM 12ml로 조정합니다. 그런 다음 G418을 밀리리터당 200마이크로그램으로 첨가하여 형질도입된 내피 세포를 선택합니다.앞서 보여준 바와 같이 효소 분해에 의해 형질도입된 내피 세포를 수확합니다. 내피 세포 펠릿을 EGM 배지 1ml에 재현탁합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 세포 현탁액과 45마이크로리터의 Trypan Blue Solution을 혼합하고 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.6웰 플레이트의 웰당 2ml의 EGM 배지 2ml에 2.5배의 생존 가능한 세포를 10배로 파종합니다. 다음 날, EGM 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 함유된 PBS 3ml로 각 웰의 세포를 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 2ml의 EBM 배지를 추가합니다.세포를 KSHV로 감염시키려면 각 웰에 5-20마이크로리터의 바이러스 스톡을 추가하고 플레이트를 소용돌이쳐 현탁액을 혼합합니다. 모의 감염 세포를 포함하는 각 웰에 동일한 부피의 TNE 완충액을 추가합니다. 플레이트를 400배의 g으로 실온에서 30분간 원심분리한 후 섭씨 37도에서 90분간 배양합니다.그런 다음 각 웰에 2ml의 EGM 배지를 추가하고 밤새 배양물을 배양합니다. 배양 후 각 웰에서 EGM 배지를 제거하고 2ml의 새 EGM으로 교체합니다. 세포가 약 90% 합류점에 도달하면 앞서 보여준 것처럼 효소 분해로 세포를 수확합니다.3개의 웰에서 세포를 감염 후 통과 경로의 총 통과 경수로 표시된 T75 플라스크에 모읍니다. 테스트 또는 동결 전에 모의 세포 및 KSHV에 감염된 내피 세포 배양을 최소 2개의 추가 계대에 대해 1개에서 3개로 분할하여 확장합니다. 여기에 제시된 것은 모의에 감염된 내피 세포의 합류 현미경 이미지로, 고전적인 조약돌 모양을 드러냅니다.이러한 세포의 세포 분열은 배양액이 합류점에 도달할 때 접촉 시 억제됩니다. KSHV에 감염된 내피 세포는 카포시 육종 방추 세포를 연상시키는 길쭉한 방추체 모양의 형태를 발달시킵니다. 모의 감염 세포와 달리 KSHV에 감염된 내피 세포는 합류점에 도달하더라도 계속 증식하여 다층 세포 병소를 발달시킵니다.기질과의 접촉이 끊어지면 모의 감염된 내피 세포는 자가사멸 세포 사멸(anoikis)을 겪게 되며, 부드러운 한천에서 군체를 형성하지 않습니다. 반대로, KSHV에 감염된 세포는 부드러운 한천에서 배양할 때 아노이키와 성장 군체에 내성이 있습니다. KSHV에 감염된 내피 세포에서 방추 모양의 형태학의 발달은 바이러스 잠복 단백질 ORF73 및 그보다는 덜하지만 바이러스 진행성 인자 ORF59의 발현을 동반합니다.녹색 형광 단백질이 태그된 KSHV BAC16에 감염되었을 때, 내피 세포는 방추체 모양의 형태를 발달시켰고 GFP 발현을 보여주어 관찰된 표현형에서 KSHV 감염 사이의 우연한 관계를 확인했습니다. 개발 후 이 세포 배양 모델은 연구자들이 KSHV 감염에 의해 유도된 숙주 세포 mRNA 및 단백질 발현의 변화를 평가할 수 있는 길을 열었습니다. 결과적으로, 유망한 치료 표적을 나타내는 KSHV 매개 종양 발생의 기저에 있는 주요 병원성 메커니즘이 확인되었습니다.KSHV는 BSL-2 제제이므로 적절한 생물 안전성 억제 절차 및 관행에 따라 처리해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

숙주 세포 요인은 설치 및 Kaposi의 육종 (KS)의 유지에 중요한 역할을한다. 우리는 KSHV에 감염된 DMVEC 전지 변경 숙주 세포 요소를 식별하는 방법을 설명하고, KS 종양 조직 인치 바이러스에 의해 변경 세포 유전자 소설 치료제에 대한 잠재적인 대상 (S) 역할을합니다.

Kaposi의 육종 - 관련 Herpesvirus (KSHV)에 의해 유도된 유전자를 식별 Dysregulated

우리는 모델 herpesvirus, 감마 herpesvirus 68 (γHV68)의 lytic 복제에 호스트 신호 분자의 핵심 역할을 식별 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 유전자 변형 마우스 긴장과 γHV68 lytic 복제 배아 섬유 아세포를 활용, 프로토콜 phenotypic 특성화 및 바이러스 lytic 복제에서 바이러스 호스트 상호 작용의 분자 심문을 모두 할 수 있습니다.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

라이브 셀에서 개별 DNA 분자를 관찰하는 방법이 설명되어 있습니다. 기술은 관심의 DNA에 설계 구속력이 사이트에 휘황 태그 LAC 억제 단백질의 바인딩에 기반을두고 있습니다. 이 방법은 시간이 지남에 라이브 세포에서 많은 재조합 DNAs를 수행하도록 구성 할 수 있습니다.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

우리는 인간 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)와 엡스타인 - 바 바이러스 (EBV)와 밀접하게 관련되는 모델 헤르페스 바이러스, 뮤린 감마 허피스 바이러스 68 (γ HV68)로 감염된 마우스에서 항 바이러스 사이토 카인 생성을 측정하기 위해 프로토콜을 설명한다. 유전자 변형 마우스 종자와 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)를 활용하여, 우리는 항 바이러스 사이토 카인 생산 생체 내 및 생체 모두를 평가. 렌티 바이러스 전달하여 녹아웃 배아 섬유 아세포에서 선천성 면역 구성 요소의 표현을 "재구성", 우리는 더 특정 선천성 면역 분자를 정확하게 지적하고 차등 항 바이러스 사이토 카인의 생산을 조절하는 중요한 신호 이벤트를 해부하다.

사이토 카인 생산의 바이러스 성 회피에 타고난 면역 신호를 해부

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

우리는 현탁액 또는 부착물에서 서정적으로 감염된 인간 세포 내의 다중 헤르페스 바이러스 RNA를 시각화하기 위해 situ 혼성화 (FISH)에서 형광을 활용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 뉴클레오세포질을 생성하는 형광의 정량화를 포함하고 면역형광(IF)을 가진 숙주 및 바이러스 성 단백질의 동시 시각화를 위해 확장될 수 있다.

KSHV 감염 세포에서 특정 유전자 제품의 시투 혼성화 (FISH) 및 면역 형광 (IF)의 정량형 형광

이 프로토콜은 이중 생물 발광 이미징에 의해 종양 진행 및 혈관신생을 실시간으로 모니터링하는 종양 베어링 마우스 모델의 확립을 설명합니다.

종양 진행 및 혈관 신생의 이중 생물 발광 이미징

이 프로토콜은 인간 유방 세포의 변환을 평가하기 위해 실험적인 체외 도구를 제공합니다. 지하 막 매트릭스를 가진 3D 배양에서 세포 증식율, 앵커리지 독립적인 성장 능력 및 세포 혈통의 분포를 후속하는 상세한 단계가 설명되어 있습니다.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

이 프로토콜은 BAC16 유래 비리온을 사용하여 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스의 새로운 용해 감염을 모델링하는 시험관 내 시스템을 설명합니다. 이 방법을 사용하면 초기 바이러스 복제 및 전파를 조사할 수 있습니다. 감염성 바이러스 생산은 GFP 기반 감염 단위 분석 및 캡슐화된 바이러스 게놈의 실시간 PCR에 의해 정량화됩니다.

무세포 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스에 의한 새로운 용해 감염의 확립 및 정량화

학습하세요 KSHV 감염에 의한 혈관내피세포의 악성 전환 메커니즘을 생체 외 배양 모델을 통해 연구하는 방법을. 이 기법은 카포시 육종 및 혈관신생 관련 질환의 새로운 치료 표적을 발굴하는 데 활용됩니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

더 많은 동영상 탐색