Name: B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 B형 간염 바이러스 리포터 시스템을 활용한 항바이러스제 고속 스크리닝 방법을 HepG2 세포에서. 이 기술은 HBV 복제 초기 단계를 모니터링하여 신약 개발 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 연구는 일본 의료연구개발기구(AMED)의 간염 연구 프로그램과 일본 문부과학성(MEXT)의 과학 연구 보조금(Grants-in-Aids for Scientific Research)의 지원을 받았습니다.

리포터 단백질을 코딩하는 재조합 HBV 1. 제조 <ol><li> 인 HepG2 세포의 제조 <ol><li> 세포 배양 배지를 준비 (둘 베코 변형 이글 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS로 보충 (DMEM)), 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 100 U / ㎖의 비 필수 아미노산). </li><li> 배지 10 ml의 형질 전날에 10 cm 콜라겐 코팅 접시 플레이트 4 × 10 6 인 HepG2 세포. 가습 된 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃ 인 HepG2 세포를 인큐베이션. 주 : 약 4 × 106 인 HepG2 세포 배양 배지 10 ㎖의 10cm 콜라겐 코팅 접시에 도금되는 경우, 그들은 70~90% 합류 다음날 것이다. </li></ol></li><li> 형질 <ol><li> pUC1.2HBV 델타 엡실론 (15)의 5 μg의 및 pUC1.2HBV / NL (15)의 5 μg의와 형질 인 HepG2 세포 형질을 사용하여제조업체의 지침에 따라 시약. </li><li> 다음날, 배지를 제거하고 신선한 배지를 가하여 10. </li><li> 1 주일 형질 감염 후, 50 ㎖ 튜브에 재조합 HBV를 포함하는 배양액을 옮기고 1.3.1 단계로 진행. 형질 감염된 세포를 함유하는 플레이트에 신선한 배지 10 ㎖를 추가한다. 참고 : 재조합 B 형 간염 바이러스의 생산 4 주 동안 유지된다. HBV 재조합 체를 함유하는 배지 1 개월 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 재조합 B 형 간염 바이러스의 정제 <ol><li> 원심 분리하여 재조합 HBV (5 분 동안 2,300 XG)을 함유하는 배지에서 세포 파편을 제거한다. </li><li> 0.45 μm의 멤브레인 필터를 통해 뜨는을 전달합니다. </li><li> 문화 매체에 : 26 % PEG / 1.5 M의 NaCl (130g, 염화나트륨, 49g, 0.5 M EDTA 산도 8.0의 1 mL 및 1 M HEPES pH를 5 ml의 7.6 500 ml의 폴리에틸렌 글리콜 6000)의 동일한 볼륨을 추가 포함하는 재조합HBV 가볍게 섞는다. 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 2,300 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 TNE 0.5 ㎖ (10 mM 트리스, 50 밀리미터의 NaCl, 1 mM의 EDTA)에서 펠렛을 녹인다. </li><li> 5 분 동안 2,300 XG에서 원심 분리하여 이물질을 제거합니다. </li><li> TNE 0.8 ml의 20 % 자당 상에로드 재조합 B 형 간염 바이러스를 포함 TNE 0.5 ml의. </li><li> 15 ° C에서 3 시간 동안 100,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 가능한 상층 액만큼을 폐기하고, 펠렛을 저장합니다. 배지의 개시 40 mL의 무 혈청 DMEM 1 ㎖에 재현 탁을. </li><li> 4 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 0.45 μm의 필터를 통해 필터링합니다. -80 ° C에서 0.5 ml의 분취 및 저장을 준비합니다. 주 : 원래 바이러스 시료의 리포터 단백질의 오염이 관찰되는 경우, 2 시간 동안 100,000 XG에 TNE에서 5~30% 자당 밀도 구배 초 원심 분리에 의해 바이러스를 정제 또는 아프로 CSCL 밀도 평형화 원심50 시간 동안 150,000 XG에 m 1.1-1.6 g / ㎖. </li></ol></li></ol> 재조합 B 형 간염 바이러스의 감염 (2) <ol><li> 10 % FBS, 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 250 μg의 / ㎖ G-418, 100 U / ㎖로 보충 된 DMEM에서 HBV 감염에 취약 안정적 NTCP (HepG2 세포 / NTCP) (15)를 발현하는 문화 인 HepG2 세포 가습 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 비 필수 아미노산. </li><li> 하루 감염 전에 플레이트 약 5 × 104 인 HepG2 / 배지 0.1 ㎖ 중의 96 웰 콜라겐 코팅 된 플레이트에 NTCP 셀 (14). </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 해동 재조합 B 형 간염 바이러스 유리 병에 남아있는 얼음의 작은 비트가있을 때까지. </li><li> 다음 결합하여 감염 배지를 준비 : 1X 인산 완충 식염수 (PBS), 디메틸 설폭 사이드 2 μL (DMSO)에 40 % PEG8000 10 μl를 재조합 HBV 10 ㎕의 신선한 배지 78 μL96- 웰 플레이트의 웰 당. </li><li> 96 웰 플레이트의 한 웰에 재조합 B 형 간염 용액 100 μl를 추가합니다. </li><li> 어느 날 감염 후, 바이러스 부분에서 오염 기자 단백질을 제거하는 웰 당 300 ㎕의 PBS에 감염된 세포를 3 회 반복한다. </li><li> 일주 이하 2 %의 DMSO를 함유하는 배지 200 μL에 감염된 세포를 인큐베이션. </li></ol> 3. 분석 <ol><li> 일주일 감염 후, PBS로 감염된 세포를 3 회 반복한다. </li><li> 감염된 세포에 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분간 배양 플레이트를 흔들어 후 5 분 동안 2000 × g으로 원심 분리기. </li><li> 루미 판에 기자 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 기자 기판을 포함하는 루미 판에 세포 용 해물 20 μl를 추가합니다. 잠시 텍싱하여 섞는다. </li><li> 루미에 접시를 놓고 15을 읽기 시작합니다. </li></ol>

<ol><li>Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+in+cirrhosis%3A+incidence+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors.</a> Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).</li>
<li>Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+strategies+are+required+to+cure+and+eliminate+HBV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection.</a> Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).</li>
<li>Wursthorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peginterferon+alpha-2b+plus+adefovir+induce+strong+cccDNA+decline+and+HBsAg+reduction+in+patients+with+chronic+hepatitis+B%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B.</a> Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).</li>
<li>Stuyver, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+for+antiviral-resistant+human+hepatitis+B+virus+mutations+in+the+polymerase+region%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region.</a> Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).</li>
<li>Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+for+infection+with+hepatitis+B+virus+that+uses+primary+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).</li>
<li>Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+experimental+infection+of+primary+human+hepatocytes+with+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus.</a> Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).</li>
<li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li>
<li>Murakami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+direct+acting+antiviral+agents+for+HBV+using+in+silico+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).</li>
<li>Ladner, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+human+hepatitis+B+virus+%28HBV%29+in+stably+transfected+hepatoblastoma+cells%3A+a+novel+system+for+screening+potential+inhibitors+of+HBV+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).</li>
<li>Yan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+is+a+functional+receptor+for+human+hepatitis+B+and+D+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus.</a> Elife. 3, (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-competent+infectious+hepatitis+B+virus+vectors+carrying+substantially+sized+transgenes+by+redesigned+viral+polymerase+translation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation.</a> PLoS. One. 8, 60306(2013).</li>
<li>Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+replicative+and+nonreplicative+hepatitis+B+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors.</a> Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).</li>
<li>Hong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+hepatitis+B+virus+vectors+efficiently+deliver+protein+and+RNA+encoding+genes+into+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes.</a> J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).</li>
<li>Hall, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+luciferase+reporter+from+a+deep+sea+shrimp+utilizing+a+novel+imidazopyrazinone+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate.</a> ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).</li>
<li>Nishitsuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+reporter+system+to+monitor+early+stages+of+the+hepatitis+B+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Sci%22%5BJournal%5D)">Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle.</a> Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).</li>
<li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hepatitis+B+virus+genotypes+on+the+intra-+and+extracellular+expression+of+viral+DNA+and+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens.</a> Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).</li>
<li>Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W. Hepadnaviruses. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?id=dxIrrMrot3gC&printsec=frontcover&source=gbs_ge_summary_r&cad=0">Field Virology. Volume 1</a>. Knipe, D., Howley, P. , Wolters Kluwer. 2185-2221 (2013).</li>
<li>Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+elements+of+hepatitis+B+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Viral.+Hepat%22%5BJournal%5D)">Regulatory elements of hepatitis B virus transcription.</a> J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).</li>
<li>Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+transcription+in+the+infected+liver%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus transcription in the infected liver.</a> EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).</li>
<li>Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+major+transcripts+of+ground+squirrel+hepatitis+virus%3A+the+presumptive+template+for+reverse+transcriptase+is+terminally+redundant%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant.</a> Cell. 42 (1), 297-308 (1985).</li>
<li>Haines, K. M., Loeb, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+of+the+RNA+primer+and+the+DNA+template+influence+the+initiation+of+plus-strand+DNA+synthesis+in+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus.</a> J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).</li>
<li>Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1690862">Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription.</a> Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

B 형 간염 게놈 코어, 폴리머, 표면 및 X의 ORF (그림 1) 등 4 차 오픈 리딩 프레임 (ORF를)가 있습니다. 이 네 HBV 개의 ORF의 전사가 단단히 네 프로모터에 의해 조절된다 다음 precore / 핵심 프로모터 인핸서 II를 포함, S1 프로모터, S2 프로모터 및 X 프로모터 인핸서 (18) I를 포함. 3.5 킬로바이트 및 3.4 킬로바이트의 mRNA는 각각 PreCore 및 핵심 단백질로 번역된다. 큰 봉투 단백질 (L)의 가장 큰 subgenomic mRNA를 (2.5 킬로바이트)에서 생산되며, 중간 (M) 작은 표면 단백질 (S)는 짧은 성적 증명서 (2.1 킬로바이트)로 변환됩니다. 0.8 킬로바이트 성적 증명서는 X 단백질 19, 20의 번역을위한 템플릿입니다. pregenomic RNA의 5 &#39;및 3&#39;말...

B 형 간염 바이러스 (HBV) 만성 감염은 만성 간 질환 (1)의 주요 위험 인자이다. 현재의 치료 전략은 인터페론 - 자극 된 유전자의 기능이 관통 HBV의 POL 기능 및 / 또는 감염된 개인에서 면역 반응을 활성화 타입 I 인터페론의 투여뿐만 아니라 간접적으로 억제 HBV의 증식을 억제 뉴클레오티드 유사체에 기반하지만, 이러한 치료는 HBV를 제거 할 수없는 DNA 완전히 3. 또한, 안티 폴 화제에 내성 HBVs의 출현 문제 4이다. 직접 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 라이프 사이클의 상이한 단계를 타겟팅 결합 항 바이러스제의 투여가 성공적으로 억제하거나 바이러스 (들)를 박멸 도시 하였다. 이 아이디어는 H의 상이한 단계에 직접 작용 항 HBV 제 (들)의 개발과 마찬가지로BV 라이프 사이클 미래 HBV 치료를 설정하는 것이 중요하다. 일반적으로, 대상 바이러스의 시험 관내 배양 시스템에서 간단한의 설립은 항 바이러스 제제의 개발을 용이하게한다. 그러나, 항 HBV 제를 선별 할 수있는 시험 관내 배양 시스템의 개발에 대한 적어도 두 개의 장벽이있다. 첫 번째는 HBV 감염 / 확산 편리한 생체 외 세포 배양 시스템의 부족이다. 확립 된 세포주에서 전파 예컨대 HIV와 같은 다른 HCV 바이러스, 달리 때문에 좁은 숙주 범위 제한을 포함하여 실험 관내에서 HBV 양성하기 어렵다. 이러한 HBV 감염, 5, 6에 취약 인간 간암 세포주 HepaRG, 특정 세포 배양 시스템의 사용은도 7에 이러한 문제를 극복하기 위해 개발되었다. 또한, 유로 키나아제 TY에서 분리 PXB 세포체육 플라스 미노 겐 활성제의 형질 전환 / 차 인간 간세포 (PHH) 접종 SCID 마우스는 HBV 감염과 복제 팔에 민감한 것으로 나타났다. 그러나 HepaRG에서 HBV 복제 수준은 HBV 감염 / 복제 수준의 일관성과 재생 불가능한 결과가 발생할 수 있습니다 배양 한 후 세포 분화 상태에 따라 달라집니다. PXB는 일반적으로 HBV 감염 실험에 사용되지만 가용성에 의해 제한된다. 테트라 사이클린 유도 HBV 발현 세포주 HepAD38도 널리 HBV 복제를 연구하는 데 사용했지만,이 시스템은 전사 후하지 HBV 감염 (9)의 입력 단계에서 평가를 허용한다. 최근에, HBV에 대한 기능적 수용체 나트륨 타우로 콜산의 cotransporting 폴리펩티드의 동정 (NTCP)는 가변 HBV 배양 시스템 (10)의 개발을 허용했다. 실제로, 이러한 Huh7 비 감수성 간암 세포에서 발현 NTCPHepG2 세포는 HBV 감염을 열 수있게하고, 따라서, HBV 감염 세포주의 선택은 실험 많은 한계를 해결 확장되었다. 두 번째 문제는 HBV 감염 및 복제를 평가하기위한 간단한 분석 시스템의 부족이다. HBV 감염의 평가는 일반적으로 HBV DNA, RNA 및 단백질을 분석함으로써 수행된다. 그러나 이러한 바이러스 마커의 정량은 종종 비용이 많이 들고 항상 간단하지가 시간 소비이다. 따라서, 간단한 분석 시스템의 개발은, 예컨대 리포터 유전자를 사용하여 같은 HBV 분석 시스템과 관련된 문제를 극복 할 수있다. 그러나, HBV 캡시드로 패키징 될 수있는 게놈 크기가 제한되기 때문에 - 미만 3.7 KB 11 - 리포터 유전자의 크기가 가능한 한 짧아야한다. 또한, 바이러스 복제에 필수적인 게놈 흩어져 여러 시스 엘리먼트의 존재에 대한 가능한 위치를 제한<html> 게놈에 리포터 유전자의 sertion. 몇몇 보고서는 HBV 게놈 11, 12, 13로, HIV-1 문신, 녹색 형광 단백질 및을 DsRed을 포함하여 외래 유전자를 삽입하려고했습니다. 그러나 이러한 재조합 HBVs는 HBV 감염 / 복제, 또는 HBV 감염 / 복제에 영향을 미치는 요인의 높은 처리량 검사 선별에 유용하지 않다. 이것은 주로 때문에 재조합 바이러스의 낮은 생산성과 비효율적 바이러스 생산에 의한 리포터 유전자 발현의 감소 된 강도이다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 우리는 바이러스 생산의 고 수율을 가진 리포터 HBV를 구축 하였다. 이 바이러스는 전사 엔트리에 상기 HBV 복제 사이클의 초기 모니터링을위한 매우 민감하다. 이 작은 (171 개 아미노산)이 발광 기자를 설계하기 때문에이를 위해 NanoLuc (NL)는 마커 유전자로서 선택되었다클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 14. 또한, NL 반딧불 또는 레 닐라 루시퍼보다 밝은 150 배 정도이고, 상기 발광 반응을 잘못된 히트 율이 높은 처리량 스크리닝 낮을 것으로 제안 ATP 독립적이다. 재조합 HBV의 생산 효율은 약 1/5 모 HBV의 이전 HBV 재조합 바이러스보고 수준과 유사하다; 이 항 HBV 제제의 질량 검사에 사용될 수 있지만, NL의 밝기 바이러스 생산성 문제를 극복한다. 기본 간세포를 사용하여 안티 HBV 요원의 검사는 HepaRG, HepAD38 및 NTCP-형질 간세포는 종래의 방법 (들)에 의해 항 HBV 에이전트의 심사에 유용 할 수 있습니다. 그러나, 여기에 설명 된 시스템은 간단한 처리, 고감도 및 스크리닝 저비용 등의 다양한 이점이있다. 이러한 장점 개발 및 치료 목적 HBV 새로운 에이전트를 식별하기위한 고 처리량 분석에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>나노-글로 루시페라제 분석 리젠</td>트 <td>프로메가</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액</td><td>나칼라이 테스크</td><td>09367-34&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 저감 혈청 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>100mm/콜라겐 코팅 접시</td><td>Iwaki</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection 시약</td><td>Thermo 피셔 사이언티픽</td><td>L3000001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 6000&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>81255</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Nacalai 테스크</td><td>31319-45&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mol / L EDTA 솔루션</td><td>Nacalai tesque</td><td>06894-14</td><td></td></tr><tr><td>트리스 - HCl</td><td>Nacalai 테스크</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP, 0.45 &mu; m, polyethethersulfone, 필터</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Collagen coated 96-well plate</td><td>Corning</td><td>NO3585</td><td></td></tr><tr><td>Passive Lysis 5x Buffer</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>GloMax 96 Microplate Luminometer</td><td>Promega</td><td>E6501</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30403-55</td><td></td></tr><tr><td>광도계 플레이트</td><td>Greiner bio-one</td><td>655075</td><td></td></tr><tr><td>HepG2-NTCP1-myc-clone22</td><td>-</td><td>-</td><td>Reference 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV delta epsilon</td><td>-</td><td>-</td><td>Reference 15</td></tr><tr><td>pUC1.2HBV/NL-</td><td></td><td></td><td>-Reference 15</td></tr><tr><td>50 ml tube</td><td>Violamo</td><td>1-3500-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3956</td><td></td></tr><tr><td>HBIG</td><td>Japan Blood Products</td> <td>Organization-IFN</td><td></td></tr><tr><td>-&beta;</td><td>모치다 제약</td><td>14987224005413</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3393</td><td></td></tr></tbody></table>

b 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

현재 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1) 및 C형 간염 바이러스(HCV)와 같은 게놈에 리포터 또는 마커 단백질과 같은 외부 유전자를 가지고 있는 다양한 바이러스의 재조합 형태를 구축할 수 있습니다. 이러한 재조합 바이러스는 일반적으로 감염된 세포에서 원래 바이러스의 수명 주기를 충실하게 모방하고 동일한 숙주 범위 의존성을 나타냅니다. 재조합 바이러스의 개발은 억제제의 효율적인 스크리닝과 특정 숙주 인자의 식별을 가능하게 합니다. 그러나 현재까지 재조합 B형 간염 바이러스(HBV)의 구축은 다양한 실험적 한계로 인해 어려웠습니다. 주요 한계는 HBV의 조밀한 게놈 크기와 1.3 게놈 크기를 초과하지 않는 상당히 엄격한 게놈 크기로, virions로 패키징되어야 합니다. 따라서, 게놈 DNA의 결실이 수행되지 않는 경우 삽입되는 외래 유전자의 크기는 0.4kb 미만이어야 합니다. 따라서 이러한 크기 제한을 극복하기 위해서는 일부 HBV DNA의 삭제가 필요합니다. 본 연구에서는 HBV pol 코딩 영역의 일부를 삭제하여 HBV 코어 코딩 영역의 일부를 리포터 유전자로 대체하여 HBV 복제 주기의 초기 단계를 모니터링하기 위해 리포터 유전자를 인코딩하는 재조합 HBV의 구축에 대해 보고합니다. 리포터 활동으로 모니터링한 재조합 HBV 감염 검출은 HBV 감염을 평가하기 위해 현재 사용 가능한 기존 방법을 사용한 검출보다 민감도가 높고 비용이 저렴했습니다. 이 시스템은 항 HBV 억제제, 숙주 인자 및 바이러스에 취약한 세포의 식별을 위한 고처리량 스크리닝을 포함한 여러 응용 분야에 유용할 것입니다.

도 1은 게놈에서 HBV 게놈의 RNA 전사는 바이러스 단백질 및 코딩 영역의 개략도를 도시한다. 게놈의 리포터 유전자 및 그 위치도 표시됩니다. 도 2는 리포터 유전자를 포함하는 HBV 리포터 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 나타낸다. pUC1.2HBV / NL 기자는 pUC1.2HBV (16)의 preCore의 mRNA의 전사 개시 사이트에서 염기 위치를 223-811을 삭제 한 후 리포터 유전자를 삽입하여 제작 하였다. 이입의 신호 서열의 점 돌연변이와 pUC1.2HBVdelta은 부위 특이 적 변이 PCR에 의해 생성 하였다. 리포터 플라스미드 (pUC1.2HBV / NL) 및 헬퍼 플라스미드 (pUC1.2HBVdelta)는 힌 DIII 에코 RI로 분해 한 다음 전기 영동 하였다. 는 pUC 플라스미드 3.0 킬로바이트 및 1...

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

이 재조합 HBV 리포터 시스템의 전반적인 목표는 항 B형 간염 바이러스 또는 HBV 억제제의 대량 스크리닝을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 항 HBV 억제제 스크리닝 및 호스트 HBV 인자의 규명과 같이 HBV 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 HBV 리포터 시스템을 통해 HBV 복제 주기의 초기 단계를 모니터링할 수 있다는 점입니다.세포 배양 배지를 준비한 후, transfection 전날 10 cm 콜라겐 코팅 디쉬에 4 × 10⁶개의 HepG2 세포를 배지와 함께 분주합니다. 세포를 37 °C의 습윤한 5% CO2 인큐베이터에서 배양합니다. 제조사의 지침에 따라 transfection 시약을 사용하여, 세포에 5 mcg의 pUC1 2HBV delta epsilon과 5 mcg의 pUC1 2HBV/NL을 transfection합니다.다음 날, 배양액을 제거하고 10 mL의 신선한 배양액을 첨가합니다. 그 후, 트랜스펙션 1주일 뒤에 재조합 HBV가 포함된 배양액을 50 mL 튜브로 옮깁니다. 이어서, 트랜스펙션된 세포가 담긴 플레이트에 10 mL의 신선한 배양액을 추가합니다.그 후 배양액을 수집하고 2,300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 재조합 HBV가 포함된 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 0.45 mcm 멤브레인 필터로 여과합니다. 그런 다음 여과액에 동일한 부피의 25% PEG, 1.5 molar NaCl을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 용액을 2,300 x g, 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액은 버리고 펠릿을 0.5 mL의 TNE 버퍼에 녹입니다. 이제 세포 잔해를 제거하기 위해 샘플을 다시 원심분리한 다음, TNE가 포함된 재조합 HBV 0.5 mL를 TNE 내의 20% sucrose 0.8 mL 위에 적층합니다.두 시료를 100,000 x g, 15 °C에서 3시간 동안 원심분리합니다. 상층액을 가능한 한 많이 제거하고, 초기 배양액 40 mL당 1 mL의 무혈청 DMEM을 사용하여 펠렛을 재현탁합니다. 현탁액을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 현탁액을 0.45 µm 필터로 여과합니다. 그런 다음 0.5 mL씩 분주하여 튜브를 -80°C에서 보관합니다. HBV 감염에 민감하며 나트륨 타우로콜산 공수송 폴리펩타이드(sodium taurocholate co-

development-hepatitis-b-virus-reporter-system-to-monitor-early-stages

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

재조합 B형 간염 바이러스 입자의 생산 및 정제

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

이 비디오는 재조합 HBV 리포터 시스템을 통해 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 검출하는 체외 기술을 보여줍니다. 숙주 세포를 감염시키면 재조합 바이러스 게놈은 루시퍼라제 리포터 효소를 발현하며, 이 효소는 기질을 산화시킬 때 생물 발광을 생성하여 바이러스 감염을 감지하는 데 도움이 됩니다.

바이러스 감염 검출을 위한 체외 재조합 바이러스 리포터 시스템

C형 간염 바이러스(HCV)는 간경변과 암을 포함한 간 질환을 일으키는 주요 인간 병원체입니다. HCV 감염성 세포 배양 시스템은 HCV 복제의 분자 메커니즘을 이해하고 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다. 여기에서는 HCV 복제 주기의 다양한 단계를 조사하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

우리는 스펙트럼 구별 리포터 형광의 단계 - 특이 적 발현을 통해 바이러스 감염 및 유전자 발현의 실시간 측정을 가능하게하는 형광 리포터 백시 니아 바이러스의 사용을 설명한다. 우리 세부 정확하게 바이러스 복제가 저분자 저해에 응답하여 영향되는 단계를 식별하기위한 플레이트 기반 방법.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

여기에서는 새로운 항바이러스제를 식별하고 평가하기 위해 바이러스 진입의 특정 단계를 검사하는 프로토콜을 제시합니다.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

이 원고는 인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα를 발현하는 새로운 엔지니어링 293T-NE-3NR및 전통적인 간 세포(HepG2-NE, 인간 NTCP를 표현하는 HepG2-NE)에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

비 간염 293T-NE-3NRs 세포에 있는 B형 간염 바이러스 감염을 모델링

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

B형 간염 바이러스(HBV) DNA의 실시간 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 검출 및 정량화는 B형 간염 바이러스 감염을 진단하고 모니터링하기 위한 민감하고 정확한 방법입니다. 여기에서는 HBV DNA 검출 및 샘플의 바이러스 부하 측정을 위한 프로토콜을 제시합니다.

B형 간염 바이러스 DNA의 실시간 중합효소 연쇄 반응 기반 검출 및 정량

배우세요 B형 간염 바이러스 리포터 시스템을 활용한 항바이러스제 고속 스크리닝 방법을 HepG2 세포에서. 이 기술은 HBV 복제 초기 단계를 모니터링하여 신약 개발 연구에 활용됩니다.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

더 많은 동영상 탐색