양적 3D 인 실리코 모델링 (q3DISM)

이 정량적 3D 인실리코 모델링(q3DISM 기법)의 전반적인 목표는 알츠하이머병의 설치류 모델의 뇌에서 단핵 식세포에 의한 아밀로이드-베타의 흡수를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 알츠하이머 환자의 뇌에 축적되어 노인성 플라크를 형성하는 아밀로이드-베타의 제거율을 정량화하기 위한 알츠하이머 연구 분야의 긴급한 요구를 해결합니다. 이 기술은 처음으로 in vivo 대식세포에 의한 아밀로이드-베타의 진정한 3D 재구성 및 정량화를 가능하게 합니다.우리는 in vivo에서 마이크로세포 식세포작용을 시각화하고 정량화할 수 있는 강력한 도구가 필요했기 때문에 아밀로이드-베타 증착을 연구하기 위해 cued 3-Dist를 사용하기 시작했습니다.

이 기술은 아밀로이드-베타의 효율적인 제거를 위해 어떤 약물이 대식세포를 자극하는지 평가하기 위해 실험적인 알츠하이머병 치료제를 테스트하는 데 유용할 수 있습니다. 조직 샘플이 면역 염색 준비가 되면 펜으로 둘러싸인 소수성 장벽 조직 영역을 차단 버퍼로 채우고 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 가습 챔버에서 섭씨 4도의 하룻밤 동안 차단 완충액을 첫 번째 관심 항체로 교체합니다.

다음 날 아침, 실온에서 가벼운 교반으로 5분짜리 PBS 수조 3회에서 샘플을 세척합니다. 세 번째 세척 후, 빛으로부터 보호된 실온에서 적절한 형광 2차 항체로 슬라이드를 배양합니다. 1시간 후 빛으로부터 보호된 PBS로 섹션을 세 번 더 세척합니다.

그런 다음 방금 설명한 것처럼 다음 2-4일 동안 관심 있는 다른 조직에 적합한 1차 및 2차 항체로 세포를 라벨링합니다. 세포 및 초세포 구획과 아밀로이드-베타 침전물을 효율적으로 염색하기 위해서는 한 번에 하나의 1차 항체만 라벨링한 다음 해당 2차 항체로 라벨링하는 것이 중요합니다. 시간이 많이 걸리지만 결과를 최적화하는 프로세스입니다.

2차 항체 염색을 마지막으로 세척한 후 어두운 곳에서 실온에서 절편을 밤새 완전히 건조시킵니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 형광 장착 매체로 밀봉된 커버 슬립으로 건조된 표본을 덮습니다. 컨포칼 현미경으로 샘플을 이미지화하려면 60x microscope objective를 선택하고 렌즈에 immersion oil을 추가합니다.

샘플을 현미경 스테이지 슬라이드 홀더에 놓고 오일이 슬라이드에 닿을 때까지 대물렌즈를 올립니다. 에피형광등 조명을 사용하여 초점면을 조정하여 해마 또는 대뇌 피질에서 아밀로이드 플라크를 찾습니다. 그런 다음, 해마 또는 피질의 아밀로이드 침전물을 둘러싸고 있는 활성화된 단핵 식세포의 컨포칼 이미지를 획득합니다.

정성적 3D 인실리코(in silico) 모델링을 위해서는 먼저 모든 Z 평면에서 동시에 염색되는 활성화된 대식세포 마커 염색의 공간적 근접성을 확인하기 위해 분석 소프트웨어 공동 국소화 모듈에서 과학적인 3D 이미지 처리를 통해 컨포칼 데이터 세트를 분석합니다. 활성화된 단핵 식세포(mononuclear phagocytes) 내에서 식질소좀(phagolysosome) 염색에 해당하는 공동국소화 채널(colocalization channel)을 생성합니다. 채널 A에 대해 TRITC를 선택하고 채널 B.In 에 대해 FITC를 선택합니다.모드 확인 창에서 임계값을 선택합니다.

공동 국소화 강도의 경우 Source Channels를 선택합니다. 편집을 클릭하여 공동 지역화 색상을 선택합니다. 그런 다음 각 채널의 임계값을 독립적으로 조정하여 특정 염색을 포함하고 배경 및 비특이적 신호를 제외합니다.

colocalized voxels는 모든 z-stacks에서 동시에 선택된 colocalization 색상으로 나타납니다. 그런 다음 공동 지역화 채널 빌드(Build Colocalization Channel)를 클릭합니다. 생성된 동일 로컬 채널이 디스플레이 조정 창에 나타납니다.

colocalization 채널을 클릭하여 채널 통계를 엽니다. 역치를 초과하여 공동국소화된 부피 물질 A의 비율은 식세포체가 차지하는 단핵구 부피를 나타냅니다. Colocalization Module을 사용하여 아밀로이드-베타 신호와의 공간적 근접성에 대한 공동국소화 채널을 분석하여 식질소체 내에 캡슐화된 아밀로이드-베타를 정량화합니다.

채널 A의 공동 국소화 데이터 세트와 채널 B에 대한 Cy5를 선택하고 방금 설명한 대로 공동 국소화 채널을 구축합니다. 공동 현지화 채널을 클릭하여 채널 통계를 다시 엽니다. 역치를 초과하여 공동국소화된 부피 물질 A의 비율은 아밀로이드-베타가 차지하는 식리소좀 부피를 나타냅니다.

Surpass 모듈을 사용하여 컨포칼 이미지 스택을 재구성하고 단핵구 식리소좀 내에 캡슐화된 아밀로이드-베타의 3D 모델을 생성합니다. Display Adjustment 창에서 TRITC를 선택하여 대식세포 염색만 표시하고 볼륨 속성에서 add new surface"를 클릭합니다. Settings(설정)의 5단계 중 1단계 algorithm(알고리즘)에서 Surface(표면)를 선택합니다.

색상에서 관심 있는 색상 유형을 선택하고 투명도를 적절하게 조정합니다. 그런 다음 관심 영역 선택 상자를 선택하고 다음을 클릭합니다. 5단계 중 2단계인 관심 영역에서 X, Y 및 Z 좌표를 조정하여 관심 셀 주위에 창을 그리고 다음을 클릭합니다.

5단계 중 3단계에서 소스 채널에서 TRITC 소스 채널을 선택하고 Smooth 상자를 선택합니다. 표면 영역 세부 수준을 0.4미크론으로 설정하고 다음을 클릭합니다. 5단계 중 4단계인 임계값에서 생성된 볼륨이 TRITC 채널 신호와 완벽하게 겹치도록 임계값을 조정하고 다음을 클릭합니다.

마지막으로, 5단계 중 5단계인 곡면을 분류하고 Filter Types 섹션에서 크기에 따라 작성할 볼륨에 포함하거나 제외할 객체를 선택합니다. 동일한 단계를 반복하여 FITC 채널이 있는 식리소좀과 Cy5 채널이 있는 아밀로이드-베타에 대한 3차원 표면을 만듭니다. 방금 시연된 바와 같이 정성적 3D 인실리코(in silico) 모델링 후, 형질전환 마우스와 쥐의 뇌에 있는 단핵구 식소체로의 아밀로이드-베타 흡수를 분석할 수 있습니다.

흥미롭게도, CD68 양성 식세포가 차지하는 부피는 생쥐와 쥐 모두에서 플라크에서 멀리 떨어져 있는 것과 비교하여 Iba1 양성 단핵 식세포에서 크게 증가하며, 이는 플라크에서 멀리 떨어진 세포에 비해 플라크 근처의 단핵 식세포가 식세포작용(phagocytosis)을 할 준비가 되어 있음을 보여줍니다. 또한 플라크와 관련된 단핵 식세포는 형질전환 마우스에서 플라크에서 멀리 떨어진 세포에 비해 아밀로이드-베타 흡수가 증가한 반면, 형질전환 쥐에서는 아밀로이드-베타 피브릴의 흡수가 전반적으로 매우 완만하게 관찰되며, 플라크로부터의 거리에 따른 함수로 아밀로이드-베타 피브릴 식세포작용의 뚜렷한 변화는 없습니다. 이 절차를 시도하는 동안 컨포칼 이미지의 품질이 매우 중요하며 공동 국소화 분석 중에 모든 채널에 대해 유사한 임계값을 적용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 이후 이 기술은 신경염증 분야의 연구자들이 알츠하이머병의 설치류 모델의 뇌에서 식세포 현상을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 설치류의 뇌 절편에 단핵 식세포, 식작용 소체 및 아밀로이드-베타에 대한 레이블을 지정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. in vivo에서 3-D에서 대뇌 아밀로이드-베타의 식세포작용을 정량화합니다.