Name: 조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 배우세요 LAP-태그 유도 안정 세포주를 생성하여 단백질 기능과 시공간 현지화 및 상호작용 네트워크를 연구하는 방법을. HEK293 세포를 이용한 고효율 단백질 복합체 정제 기술을 익히세요.

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이 작업은 National Science Foundation Grant NSF-MCB1243645(JZT)의 지원을 받았으며, 이 자료에 표현된 모든 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 National Science Foundation의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

주 : 관심있는 단백질을 유도 LAP 태깅 안정한 세포주의 생성의 개요는도 1에 도시되어 LAP 표지 된 단백질의 발현, 정제 및 질량 단백체 준비의 개요가도 3에 도시되어 분석한다. 1. LAP-태그 벡터로 관심의 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 복제 <ol><li> 셔틀 벡터로 관심의 유전자의 ORF를 복제. <ol><li> N 말단 융합 또는 C 말단 융합 어느 용 프라이머 내의 적절한 attB1과 attB2 사이트와 관심의 ORF를 증폭하는 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용한다. PCR 조건 프라이머 서열 표 2 표 1을 참조하십시오. </li><li> 겔을 1 % 아가 로스 겔에서 이러한 문제를 해결하여 PCR 산물을 정제. 겔에서 올바른 크기의 증폭 밴드를 절제하고, DNA의 g를 사용하여 겔 조각에서 압축을 풉니 다제조업체의 지침에 따라 엘 추출 키트. </li><li> 셔틀 벡터를 포함하는 attP 및 PCR 제품은 제조자의 지시에 따라 벡터에 재결합 할 수있는 재조합 효소로 PCR 산물을 함유하는 정제 attB 부화 (M aterials의 도표 참조). 참고 : 빈 셔틀 벡터와 LAP 태그 벡터가 CCD의 B 유전자를 포함하고 CCD의 B 내성 박테리아 세포에 전달되어야한다 (재료 표 참조). ORF가이 벡터 내로 삽입 될 때 그러나 ccdB 유전자를 클로닝하는 ORF와 벡터를 전파 할 때 그에 DH5α 표준 대장균을 사용하여 아웃 재결합된다. </li><li> 루리아 브로 쓰 (LB) 50mg을 한천 플레이트 / ml의 카나마이신 (13) 상에 변환 된 세포 반응 생성물 1 μL로 DH5α 대장균 세포를 형질 접시. </li><li> 카나마이신 내성 콜로니를 선택합니다. </li><li> LB 내에서 선택한 식민지를 성장50 ㎎ / ㎖ 카나마이신으로 직경은 DNA 미니 - 프렙을 표 3에 열거 된 시퀀싱 프라이머를 사용하여 DNA 시퀀싱에 의해 유전자 통합을 확인한다. </li></ol></li><li> LAP-태그 벡터에 셔틀 벡터에서 관심의 유전자를 전송. <ol><li> LAP-태그 벡터와에 따라, LAP-태그 벡터에 셔틀 벡터에서 관심의 유전자의 전달을 매개 재조합 효소 (융합 N 말단에 대한 pGLAP1)과이자 ORF의 서열 확인 유전자를 함유하는 셔틀 벡터를 품다 제조업체의 지침 (자료 참조). 주의 : 원하는 프로모터, 에피토프 태그에 기초하여 사용될 수있다 LAP / TAP 벡터 시리즈와 N 또는 C 말단 태그는 표 4에서 찾아 볼 수있다. </li><li> 100 ㎎ / ㎖ 암피실린 (13)과 함께 LB 한천 플레이트 상에 형질 전환 세포 반응 생성물 1 μL로 DH5α 대장균 세포를 형질 접시. </li><li> 암피실린 내성 콜로을 선택가 다진. </li><li> , 100 ㎎ / ㎖ 암피실린와 LB 미디어에서 선택한 식민지를 성장하는 DNA 미니 사전을, 표 5에 나열된 순서 프라이머를 사용하여 DNA 염기 서열에 의해 유전자의 통합을 확인합니다. </li></ol></li></ol> 관심의 LAP-태그 유전자를 표현합니다 유도 안정 세포주의 2 세대 <ol><li> 관심있는 프로젝트에 가장 적합한 세포주를 선택합니다. 대안 적으로, 구조적 TetR를 표현하고 (원료 참조) 관심 LAP 태깅 유전자가 안정적으로 게놈 내로 통합 될 수있는 FRT 부위를 포함하는 기존의 세포주에서 숙주 세포 라인을 생성한다. 주 :이 프로토콜은 4 테트라 사이클린 (-Tet)의 결여이며, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 만든] -Tet DMEM / F12 배지에서 배양되는 TetR 및 FRT 부위를 포함하는 HEK293 세포주를 사용 . </li><li> 하이 그로 마이신의 최소 농도를 결정하는 것은이 연소로 (1) 내의 숙주 세포주를 죽이는 데 필요한약물 첨가 후 KS. 농도는 대부분 100 ㎖ μg의 / 800 μg의 / ㎖ 사이의 범위로, 숙주 세포 라인에 따라 다를 수 있습니다. 참고 : 37 ° C와 5 % CO 2 1 ~ 2 주 이내에 죽을 것 100 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신과 -Tet DMEM / F12 미디어에서 성장 HEK293 세포. </li><li> 공동 형질 flippase의 재조합 효소는 형질 전환 시약을 사용하여 HEK293 세포에 LAP-태그 벡터 (세포의 게놈 내에서 FRT 사이트에 관심있는 LAP-태그 유전자의 통합을 매개) 발현 벡터를 같은 제조업체의 지침에 따라 . 4의 비율을 사용하여 재조합 벡터의 1 LAP 벡터 (14)에. 주 : 최적의 비율은 형질 숙주 세포주 및 방법에 의존하고, 적정을 요구할 수있다. 4의 비율 : 1은 대부분의 세포 라인에 적합합니다. 음성 대조군으로 모의 형질 플레이트를 포함합니다. </li><li> 어느 날 후 형질 전환, 새로운 미디어와 -Tet DMEM / F12 미디어를 교체합니다. </li><li> 이틀 후 transfecti25 %의 합류로, 분할 세포. 셀 ~ 부착 5 시간은, 단계 2.2 소정의 농도로 하이 그로 마이신 함유 -Tet DMEM / F12 미디어를 추가 할 수 있습니다. HEK293를 들어 세포는 100 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신을 사용합니다. 주 : HEK293 세포주를 포함하는 FRT 또한 블라스트 저항과 관련된 따라서 5 μg의 / ㎖ 블라스트이 TetR위한 선택하여 누설 식을 최소화하는 안정한 세포주의 선택 과정에 사용되는 TetR를 포함한다. </li><li> 별개의 세포 초점이 투명 판에 대한 불투명 한 점을 닮은이 나타날 때까지 필요에 따라 -Tet DMEM / F12 미디어를 하이 그로 마이신이 함유 교체합니다. </li><li> 200 μL 피펫 팁과 각 셀의 초점의 상단에 트립신 20 μl를 추가하고 최대 피펫 아래로 2 회. 장소 24 웰 플레이트에서 세포와 하이 그로 마이신 함유 -Tet DMEM / F12 미디어의 지속적인 성장에 의해 세포를 확장합니다. </li><li> 고정 셀 또는 라이브 셀 형광 현미경으로 유도 LAP-태그 단백질 발현을위한 화면 세포 및 / 또는LAP-태그 (15) 내에서 GFP 태그 웨스턴 블로 팅. </li></ol> LAP-태그 단백질 복합체의 3 정화 참고 : 이전의 경험을 바탕으로 일반적인 LAP-태그 단백질 정제에 사용되는 조건 및 볼륨에 다음 LAP-태그 단백질 정제 프로토콜 세부 권장 사항. 그러나주의 경험적 최적화가 최상의 결과를 제공하기 위해 관심의 단백질 복합체 단백질 발현 수준에 대해 수행되는 것을 보장하기 위해 행사되어야한다. <ol><li> 세포 성장과 세포 수확. <ol><li> 지속적으로 37 ° C, 5 % CO 2에서 -Tet DMEM / F12 미디어에 더 큰 판 및 / 또는 롤러 병에 모든 HEK293 세포를 계대에 의해, 단백질 복합체의 TAP 분리에 대한 검증 LAP-태그 세포주를 확장합니다. </li><li> 테트 / Dox를 유도 세포주, harvestin 전에 0.2 μg의 / ㎖ 테트 / Dox를 세포에 도달 ~ 70 % 포화 상태의 농도에서 10 내지 15 시간 동안 유도g 세포. 참고 : 농도와 유도 시간이 각각의 단백질 결정되어야한다, 10 ~ 15 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖ 테트 / Dox가의 적정 권장합니다. </li><li> 교반 또는 트립신 및 펠릿 세포 5 ~ 10 분 동안 875 XG에 의해 수확 세포. </li></ol></li><li> 커플 링 방지 GFP 항체 단백질 A 구슬에 <ol><li> A A 0.5 ml의 세포 펠렛으로부터 제조 해물, 포장 세포 부피 (PCV)에서 면역에 대한 항체의 40 μg의를 사용합니다. 참고 : 다른 요소들 사이의 LAP-태그 단백질의 풍부에 따라 달라집니다 필요한 항체의 양 및 최적화가 필요합니다. 10 ~ 40 μg의의 적정 권장합니다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 PBST (PBS + 0.1 % 트윈 20)에 160 ㎕의 포장 볼륨 (PV) 단백질 A 구슬 평형. PBST 1 ㎖로 3 회 반복한다. 참고 : 여기에 모든 세척이 10 초 동안 5,000 XG에 구슬을 원심 분리하여 수행된다. </li><li> 를 Resuspend 구슬 500 μL의 PBST과 친 화성의 80 μg의 추가160 μL 비드 각 튜브 - 정수 토끼 항 GFP 항체. 실온에서 1 시간 (RT) 동안 혼합한다. </li><li> PBST 1 ml의 구슬을 2 회 반복한다. 그런 다음, 0.2 M 붕산 나트륨, pH가 9 (20 ml의 0.2 M 붕산 나트륨 + 15 ml의 0.2 M 붕산)의 1 ml의 구슬을 2 회 반복한다. 최종 세척 후, 1 ml의 최종 볼륨을 가지고 0.2 M 붕산 나트륨의 900 μL, pH가 9를 추가합니다. </li><li> 20 mm의 최종 농도 220 MM의 dimethylpimelimidate (DMP) 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 실온에서 부드럽게 튜브를 회전합니다. 220 mM의 DMP를 들어, 0.2 M 붕산 나트륨, pH가 9 877 ㎕를 한 50 mg의 병의 내용을 재현 탁하고 비드 현탁액에 바로 추가 할 수 있습니다. </li><li> DMP와 함께 배양 한 후, 잔류 가교제를 비활성화하는 0.2 M 에탄올 아민, 0.2 M의 NaCl 산도 8.5의 1 ml의 구슬 1 시간을 씻는다. 같은 버퍼 1 ㎖과에 재현 탁 비즈 실온에서 1 시간 동안 회전합니다. 펠렛의 구슬과 0.2 M 에탄올 아민, 0.2 M의 NaCl의 pH 8.5의 500 μL에 재현 탁 구슬. 비즈 severa에 대한 안정4 ° C에서 리터 개월. </li></ol></li><li> 세포 용해 및 복합 정제를위한 버퍼의 준비 <ol><li> pH가 7.4 용액함으로써 (세포 용해를위한 300 mm의 가장 비드 세척 200 mm의 세척 구슬 100 mM의 용출에 앞서 단백질 X는 LAP 버퍼의 원하는 염 농도 [mM의 KCl을] 임) LAPX 버퍼를 준비 의 50 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), X 밀리미터의 KCl, 1 mM의 에틸렌 글리콜 테트라 산 (EGTA), 1 ㎜의 MgCl 2, 10 % 글리세롤을 함유. 주 :이 완충액의 성분은 살아있는 세포에서의 환경에 근사하는 데 사용된다. HEPES는 7.2-8.2의 pH 분노의 버퍼로 사용됩니다. KCl을 버퍼의 이온 강도를 유지하기 위해 사용되는 염이다. EGTA 마그네슘에 비하여 칼슘 수준을 감소시키기 위해 칼슘 이온 결합하는 킬레이트 제이다. 글리세롤의 MgCl 2 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 사용된다. </li><li> 0.05 % 노닐 phenoxypol 추가하여 LAPX N 버퍼를 준비LAPX 버퍼에 yethoxylethanol. 주 : 노닐 phenoxypolyethoxylethanol 단백질을 가용화 중성 세제이지만, 이에 따라 높은 농도의 추출 과정에 사용되는 단백질 - 단백질 상호 작용을 유지하고이어서 결합 및 세척 단계에서 저하된다. </li></ol></li><li> 세포 용 해물의 제조 <ol><li> 0.5 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) 및 프로테아제 억제제로 LAP300 2.5 ㎖ 중에 PCV 500 μl를 재현 탁. 10 % 노닐 phenoxypolyethoxylethanol (최종 0.3 %)의 90 μl를 추가하고 반전으로 섞는다. </li><li> 10 분 동안 얼음에 놓습니다. 10 분 동안 21,000 XG에 원심 분리기. 이 저속 상층 액 (LSS)를 수집합니다. 젤 분석을위한 LSS의 10 μL 샘플을 가져 가라. </li><li> 4 ° C에서 1 시간 동안 100,000 XG에서 TLA100.3 튜브와 스핀에 LSS를 전송합니다. 튜브에,이 고속 뜨는 (HSS)를 수집하고 얼음에 배치합니다. 젤 분석을위한 HSS의 10 μL 샘플을 가져 가라. 참고 : 최상위 지질 층을 복용하지 마십시오D 하단 대부분 세포 파편 층. 지방층은 HSS를 수집하기 전에, 진공 흡인에 의해 제거되어야한다. </li></ol></li><li> 첫째 선호도 캡처 : 안티 GFP 비즈에 바인딩 <ol><li> 사전 용출 항체 결합 구슬 비 결합을 제거하는 용출 버퍼 [20 mM 트리스, pH 7.4의 3.5 M의 MgCl 2] 1 ㎖로 3 회 세척 (0.5 ml의 세포 펠렛 (PCV) 당 구슬의 160 μl를 사용) 항체와 배경을 줄일 수 있습니다. 신속하게 수행합니다. 오랜 시간 동안 높은 소금에 구슬을 두지 마십시오. </li><li> LAP200 N의 1 ml의 구슬을 3 회 반복한다. HSS는 4 ° C에서 1 시간 동안 항체 구슬 추출 섞는다. 10 분 동안 21,000 XG에 원심 분리기. 상층 액의 10 μl의 샘플을 가지고 (즉, (FT)를 통해 흐름) 젤 분석. </li><li> 0.5 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제와 LAP200 N의 1 ml의 구슬을 3 회 반복한다. 0.5 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제와 LAP200 N의 1 ml의 구슬을 2 회 (5 분마다)를 씻으십시오. 2t 신속하게 세척1 0.5 mM의 DTT와 LAP200 N ㎖의 담배 식각 바이러스 (TEV) 단백질 분해 효소를 추가하기 전에없이 단백질 분해 효소 억제제와 IME를. </li></ol></li><li> TEV 절단 <ol><li> LAP200 N 1 ml의 10 μg의 TEV 단백질 분해 효소를 희석하고 밤새 4 ° C에서 튜브를 회전합니다. 참고 :이 단계는 모든 LAP-태그 단백질을 최적화 할 수는 LAP-태그 단백질 복합체의 보존에 도움이 될 수 TEV 단백질 분해 효소의 농도를 조절하여 몇 시간에 완료 할 수 있습니다. </li><li> 새로운 튜브에 펠렛 구슬과 전송 상층 액. 잔여 단백질을 제거하기 위해 0.5 mM의 DTT 160 ㎕를 LAP200 N과 단백질 분해 효소 억제제 (트리플 농도)로 두 번 구슬을 씻어. 젤 분석을위한 뜨는의 10 μL 샘플을 가져 가라. </li></ol></li><li> 둘째 선호도 캡처 : S 단백질 아가로 오스 바인딩 <ol><li> 80 μl의 S 단백질 아가로 오스 슬러리의 1 튜브 (40 μl의 포장 수지) LAP200 N 1 ml의 3 회 반복한다. 참고 : S의 제자EIN의 RNase 활성을 재구성 할 S-tag에 결합하고 다른 두번째 에피토프 태그를 함유하는 RNA 단백질 복합체에 대해 고려되어야한다. </li><li> 추가 TEV는 4 ° C에서 3 시간 동안 S 단백질 아가로 오스 구슬과 바위에 뜨는 용출. 펠렛의 구슬과 0.5 mM의 DTT 및 프로테아제 억제제와 LAP200 N 1 ㎖로 3 회 씻는다. LAP100 1 ml의 구슬을 2 회 반복한다. </li></ol></li><li> 단백질 용출 <ol><li> 10 분 동안 97 ° C에서 4X 램 믈리 시료 완충액과 열 50 μl를 첨가하여 아가 S 단백질을 단백질을 용출시킨다. 주 : 단백질은 용출 완충액 (20 mM 트리스, pH 7.4의 3.5 M의 MgCl 2)로 비드로부터 용출된다. </li></ol></li></ol> 4. 질량 분광법 분석에 의해 상호 작용 단백질을 확인 <ol><li> 볼 (도데 실 황산나트륨 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 실버 염색 겔에 의해 수집 된 샘플을 분석하여, 정제의 품질을 테스트 <strong&gt; 자료 표)와 용출액을 면역 블과 그림 4 참조 LAP-태그 정화는 16 일 않도록 방지 GFP 항체와 프로빙에 의해. </li><li> 화학 양론과 화학량 론적 공동 정화 종을 식별하기 위해 최종 용출 샘플을 채취하고 SDS-PAGE하여 구분합니다. 질량 분석 호환 단백질 얼룩 젤을 얼룩. 가장 눈에 띄는 밴드와 겔에서 그들 사이의 공간을 절제 및 질량 분석 별도로 (16)에 의해 분석을 처리합니다. 참고 : 최종 정제 용출액을 분리하여 질량 분석 5를 제조하는 다양한 방법이있다. 예를 들어, LAP 정제 된 복합체는 높은 염 (3.5 M의 MgCl 2)를 한꺼번에 질량 분석계 (17)에 의해 분석 될 수 도중에 전체 단백질 집단을 이용하여 S - 단백질 비드로부터 용출된다. 대안 적으로, 최종 용출액 한 SDS-PAGE에 의해 mm 전자 수있는 단일 한 mm 대역에 대해 분리 될 수있다xcised 분석. 이 분석을 방해 할 수있는 비드 또는 입자상 물질의 복합체를 클리어한다. </li></ol>

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개설 된 프로토콜은 LAP 태그 벡터에 관심있는 유전자의 복제를 설명, 유도 LAP-태그 안정적인 세포주의 생성, 단백체 분석을위한 LAP-태그 단백질 복합체의 정제. 다른 LAP / TAP 태그 방식에 대해,이 프로토콜은 모든 세포 경로 내에서 단백질 현지화 및 단백질 - 단백질 상호 작용을 매핑하는 높은 처리량 방법과 호환되도록 간소화되었습니다. 이 접근 방법은 널리 몇 가지 이름을 세포주기 진행, 방추사 조립체 스핀들 극 항상성 및 ciliogenesis에 중요한 단백질의 기능적 특성에 적용된 이러한 단백질 misregulation 인간 질환 (15)로 유도 할 수있는 방법의 이해를 원조했다 16,19,20. 예를 들어, 우리 그룹 최근 스핀들 조립체 15,21 STARD9에서의 유사 분열 키네신 기능 및 규제 (후보 암 대상)을 정의하기 위해이 시스템을 사용하는 정의 할Tctex1d2의 네인 빛 체인 사이의 새로운 분자 링크 짧은 리브 다지증을 비롯한 다양한 기형 증후군 (SRPS) (19), 그리고 중간 2 유비퀴틴 리가 아제의 돌연변이 X-링크 지적 장애 (16)으로 이어질 수있는 방법을 이해하는 새로운 분자 링크를 정의 할 수 있습니다. 다른 실험실도 성공적으로 Tctn1, 마우스 고슴도치 신호의 조절이하는 ciliopathy 관련 단백질 복합체의 일부라고 판단 하나를 포함하여,이 방법을 적용한 조직 의존적으로 22, 23에 규정 된 섬모 막 조성 및 ciliogenesis가. 따라서,이 프로토콜은 크게 임의의 셀룰러 경로의 해부에 적용될 수있다. 이 프로토콜에서 중요한 단계는 하이 그로 마이신 내성 LAP 태깅 안정한 세포주의 선택이다. 특별한주의가 제어 플레이트의 모든 세포가 증폭 실험 접시에 초점을 선택하기 전에 죽은되도록주의해야한다. 하이 그로 마이신은 adde 할 수있다LAP-태그 안정적인 세포주의 일상적인 세포 배양시 d를 추가로 모든 세포가 FRT 사이트에서 관심있는 LAP-태그 유전자를 유지할 수 있도록합니다. 우리는 모든 LAP 태깅 된 단백질이 작동하게하고 단백질 기능을 테스트하는 데 사용할 수있는 장소의 분석을 위해 중요하다는 것을 경고한다. 단백질의 기능을 테스트하는 데 사용 분석의 예는 siRNA를 유도 표현형 및 시험 관내 활성 분석의 구조를 포함한다. 큰 LAP 태그가 추가 된 잠재적 인 문제점을 해결하기 위해 이전에 관심 단백질의 기능 및 위치 파악을 방해 할 가능성이 적은 FLAG 같은 작은 태그를 포함하고,이 시스템과 호환 TAP 태그 벡터를 생성 한 4. 또한, LAP 태그 벡터 C 말단 LAP 표지 된 단백질 또는 LAP / TAP 태그는 N에서 허용되지 않는 경우에 사용할 수있는 이러한 시스템과 호환되는 C 말단 TAP 표지 된 단백질을 생성하기 위해 존재 단백질의 -terminus. 또한, 일정제 버퍼 (LAPX N)의 전자 염 세제 농도를 높이거나 유료 또는 너무 많은 상호 작용이 관찰되는 경우, 정제 엄격함을 감소하도록 변형 될 수있다. 유사하게, 직렬 친 화성 정제 절차는 거의 또는 전혀 인터랙이 확인되면 이에 번의 정제 방식이 사용될 수 있으며, 손실 될 수 정제 과정 약한 인터랙 하나보다 더 엄격하다. 다른 GFP 에피토프 태그 방식은 단백질 현지화 및 정제 연구 (24, 25)에 대한 태그 대규모 GFP 단백질을 허용하는 존재한다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이러한 모든 규제 요소, 모방 내인성 유전자 발현 (24)를 포함 그들의 네이티브 환경에서 관심의 GFP - 태그 유전자를 표현하는 박테리아 인공 염색체를 이용하는 BAC TransgenOmics 접근 방식을 포함한다. 최근 CAS9 / 단일 가이드 RNA (sgRNA) 리보 핵산 단백질 복합체 (RNP들)을 종료하는 데 사용 된ogenously 자신의 내인성 유전자 좌위 (25)로부터 GFP - 태그 유전자의 발현을 허용하는 분할 GFP 시스템과 관심의 유전자를 태그. 이러한 접근 방식 모두 여기에 설명 된 LAP 태그 프로토콜에 비해 내생 조건에서 태그 단백질의 발현을 활성화하지만, 그들이 관심있는 태그 유전자의 유도 및 조정 가능한 표현을 허용하지 않습니다. 또한, 그들은 TAP에 대해 태깅 탠덤 에피토프에 적용될 아직. 다른 태그 시스템은 또한 유도 성 에피토프 태그 안정된 세포주를 생성하기위한 여기에 설명 된 시스템과 호환되기 위해 변형 될 수있다라는 점이다. 예를 들면, 근접성 - 의존성 비오틴 식별 (BioID)의 상호 작용으로 인해 단백질 (26) 사이에 공간 및 시간 관계를 정의하는 능력에 상당한 관심을 얻고있다. 이 기술은 대장균 비오틴 리가 피라의 난잡한 균주 오티 닐에 융합 단백질을 이용효소의 ~ 10 nm의 반경 내에있는 단백질이야. 바이오틴이 단백질은 친 화성 비오틴 화성 캡처를 사용하여 정제 및 질량 분석에 의한 조성 분석이다. 피라 복잡한 (27) 내에 강한 상호 작용 파트너를 검출하기에 특히 적합하게되는, 심지어 일시적 밀접 어떤 단백질 오티 것이다. 또한, 정제 기법은 내인성 단백질 - 단백질 상호 작용은 그대로 유지되므로 위양성의 비율을 줄이고, 변성 조건 하에서 수행 될 수 있다는 것을 필요로하지 않는다. 현재 프로토콜 내에서, 피라 태그 벡터에 의해 pGLAP1 벡터의 대체 근접성에 기반을 검출에 친 화성을 기반으로 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별에서이 시스템을 변환 할 수 있습니다. 다양한 효소 - 기질 상호 작용 사이의 시공간 단백질 - 단백질 INTE을 매핑하는 경우와 같이 이러한 시스템은 과도 단백질 상호 작용을 검출하는 매우 유리할 것이다중심체과 섬모 (26, 28)에 대해 수행 된 정의 구조 내에서 ractions.

특성화되지 않은 단백질의 세포 기능을 조사하려면 생체 내 시공간 세포 내 국소화와 상호 작용하는 단백질 파트너를 결정하는 것이 중요합니다. 전통적으로 관심 단백질의 N 또는 C-말단에 융합된 단일 및 탠덤 에피토프 태그는 단백질 국소화 및 단백질 상호 작용 연구를 용이하게 하는 데 사용되었습니다. 예를 들어, TAP(Tandem Affinity Purification) 기술은 효모와 포유류 세포주 모두에서 소량의 단백질 복합체를 분리할 수 있게 해주었습니다1,2. 국소화 및 친화성 정제(LAP) 기술은 녹색 형광 단백질(GFP)을 항원결정기 태그 중 하나로 도입하여 국소화 성분을 포함하도록 TAP 절차를 수정하는 보다 최근의 개발입니다3. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 살아있는 세포에서 단백질의 세포 내 국소화에 대한 더 깊은 이해를 얻는 동시에 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 매핑하기 위해 TAP 복합 정제를 수행할 수 있는 능력을 유지할 수 있습니다. 
그러나 포유류 세포에서 TAP/LAP 기술의 광범위한 사용을 방해하는 많은 문제가 있습니다. 예를 들어, 관심 있는 TAP/LAP 표지 단백질을 발현하는 안정적인 세포주를 생성하는 데 필요한 시간; 이는 일반적으로 관심 유전자를 바이러스 벡터로 클로닝하고 원하는 발현 수준을 가진 단일 세포 안정 인테루트를 선택하는 데 의존합니다. 또한 많은 세포 경로는 구성적 단백질 과발현(낮은 수준에서도)에 민감하며 시간이 지남에 따라 세포를 정지시키거나 세포 사멸을 유발할 수 있어 TAP/LAP 안정적인 세포주 생성을 불가능하게 만들 수 있습니다. 이러한 제약 및 기타 제약 조건으로 인해 LAP/TAP 방법론이 단백질 국소화 및 단백질 복합체 규명을 위한 고처리량 시스템이 되는 데 방해가 되었습니다. 따라서 클로닝 및 세포주 기술의 현재 혁신을 활용하는 포유류 세포를 위한 유도 가능한 고처리량 LAP-태깅 시스템의 개발에 상당한 관심이 있어 왔습니다. 
여기에서는 클로닝 및 포유류 세포주 기술의 발전을 적용하는 Doxycycline/Tetracycline(Dox/Tet) 유도성 LAP-태그 단백질로 안정적인 세포주를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 LAP 태그가 지정된 단백질 세포 내 국소화, 단백질 복합체 정제 및 상호 작용 단백질의 식별과 관련된 데이터 수집을 간소화합니다4. 친화성 단백질체학(affinity proteomics)은 단백질 복합체 규명을 위해 광범위한 기술을 활용하지만5, 당사의 접근 방식은 이러한 복합체와 고유한 상호 작용 네트워크의 식별을 촉진하는 데 도움이 되며 다수의 단백질 성분을 포함하는 복잡한 생물학적 경로를 조사하는 데 필요한 고처리량 단백질 태깅(high-throughput protein tagging)에 적합합니다. 이 접근법의 핵심은 체외, 박테리아 및 바큘로바이러스와 같은 다양한 유기체, 포유류 세포에서 유전자 발현을 위한 일련의 벡터로 표적 유전자를 충실도가 높고 신속하게 클로닝할 수 있는 클로닝 전략의 발전입니다6,7. 또한 ORFeome 협업은 과학계8-11에서 사용할 수 있는 클로닝의 이러한 발전을 통합한 벡터에서 수천 개의 시퀀스 검증 개방형 판독 프레임을 복제했습니다. 우리 시스템에서 pGLAP1 LAP-tagging vector는 많은 수의 클론을 동시에 클로닝할 수 있게 하여 고처리량 LAP-tagging을 용이하게 합니다. 이 신속한 클로닝 절차는 사전 결정된 단일 게놈 자리에 삽입된 LAP 태그 관심 유전자가 있는 세포주를 생성하기 위한 간소화된 접근 방식과 결합됩니다. 이는 게놈 내에 단일 FRT(flippase recognition target) 부위를 포함하는 세포주를 사용하며, 이는 LAP 태그가 지정된 유전자의 통합 부위입니다. 이러한 세포주는 또한 LAP 태그가 지정된 유전자의 업스트림에서 Tet operator(TetO2)에 결합하고 Dox/Tet가 없을 때 발현을 침묵시키는 tetracycline repressor(TetR)를 발현합니다. 이를 통해 주어진 시간에 LAP 태그가 지정된 단백질의 Dox/Tet 유도 발현을 가능하게 합니다. 많은 세포 경로가 경로를 제어하는 중요한 단백질의 수치에 민감하고 이러한 단백질이 낮은 수준에서도 구조적으로 과발현될 때 세포 성장을 저지하거나 세포 사멸을 유발할 수 있기 때문에 유도 가능한 LAP-태그 단백질 발현 능력을 갖는 것이 중요합니다12.

<table><tbody><tr><td>Flp-In T-REx 코어 키트</td><td>FRT 부위 및 TrtR 발현 PETG를 포함하는 세포주를 생성하기 위한</td><td>Invitrogen</td><td>K6500-01</td> 키트</tr><tr><td>, 5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-734</td><td>성장 세포용 롤러 병</td></tr><tr><td>PETG, 2.5x</td><td>Nunc, Inc.&nbsp;</td><td>73520-420</td> 세포 스태커<td>를 위한 롤러 병</td></tr><tr><td></td><td>Corning CellSTACK</td><td>3271</td><td>세포 스태커는 세포 성장을 위한</td></tr><tr><td>500 ml 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td>세포 채취를 위한 431123 튜브</td></tr><tr><td>Anti-GFP 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td>Rabbit anti GFP 항체</td></tr><tr><td>Affiprep Protein A beads</td><td>Biorad</td><td>156-0006</td><td>anti-GFP 항체 접합 매트릭스로 사용</td></tr><tr><td>Dimethylpimelimidate (DMP)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21667</td><td>anti-GFP 항체를 Protein A beads</td></tr><tr><td>TLA100.3 튜브</td>에 접합하는 데 사용됩니다.<td>Beckman</td><td>349622</td><td>Tubes for centrifuging protein lysatates during the clear step</td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Invitrogen</td><td>12575-015</td><td>N-말단 LAP-태그 단백질의 GFP 태그를 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>Precession Protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27-0843-01</td><td>C-말단 LAP-태그 단백질의 GFP 태그를 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>S-단백질 아가로스</td><td>Novagen</td><td>69704</td><td>LAP 태그가 지정된 단백질 복합체의 정제 중 두 번째 친화성 매트릭스로 사용됨</td></tr><tr><td>QIAquick DNA 겔 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704/28706</td> 아가로스 겔 BP clonase II Invitrogen 11789020<td>에서 PCR 산물을 정제하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ORF PCR 산물을 pDONR221 셔틀 벡터로 클로닝하는 데 사용</td></tr>LR <tr><td>clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>11791020</td><td>관심 유전자의 ORF를 pGLAP1 LAP-tagging vector</td></tr><tr><td>ccdB Survival 2 T1R E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>A10460</td><td>shuttle vector 및 pGLAP empty vectors propgating에 사용</td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td>인간 세포에 벡터를 transfection하기 위한 Transfection 시약</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Invitrogen</td><td>Q100-19</td><td>Dox/Tet에 의해 유도되는 단백질 발현 유도 약물&nbsp;</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311</td><td>Dox/Tet 유도성 단백질 발현 유도 약물&nbsp;</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td>안정되어 있는 LAP 표를 붙인 integrants</td></tr><tr><td>Kanamycin 코닝 Kanamycin</td><td>코닝</td><td>61-176-RG</td> 를 선정하기 <td>위한 약 Kanamycin 저항하는 세균성 식민지 선택을 위한</td></tr><tr><td>약 Ampicillin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-5</td><td>Ampicillin 저항하는 세균성 식민지 선택을 위한 약</td></tr><tr><td>4-20% Tris Glycine SDS-PAGE 젤</td><td>Biorad</td><td>4561094</td><td>단백질 샘플 분리 및 최종 LAP-tag 정제 용출에 사용됨</td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Biorad</td><td>1610449</td><td>정제 과정 전반에 걸쳐 수집된 샘플과 LAP-태그가 부착된 pufications의 용리액을 은 염색에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Coomassie Blue stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>LAP 태그 정제를 visulize SDS-PAGE 젤을 염색하고 단백질 밴드를 절단하는 데 사용, 질량 분석 호환</td></tr><tr><td>가능한 셔틀 벡터 pDONR221</td><td>Invitrogen</td><td>12536017</td><td>관심 유전자의 ORF 클로닝을 위한 셔틀 벡터</td></tr><tr><td>Flippase 발현 벡터 pOG44</td><td>Invitrogen</td><td>V600520</td><td>세포주를 포함하는 FRT 부위의 게놈에 LAP-tagged 유전자를 통합하기 위한 Flippase recombinase를 발현하는 Vector</td></tr><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10966018</td><td>관심 유전자의 ORF의 PCR 증폭에 사용됨</td></tr><tr><td>4x Laemmli sample buffer</td><td>Biorad</td><td>1610747</td> bead matrix Luria broth (LB) media<td>에서 정제된 LAP-tagged 단백질 복합체를 용출하기 위한 Sample buffer</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>BP9723-2</td><td>DH5 &alpha 성장에 사용 박테리아</td></tr><tr><td>DNA miniprep kit</td><td>Promega</td><td>A1222</td><td>DNA 플라스미드 minipreps</td></tr><tr><td>DMEM/F12 배지</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td>Hek293 인간 세포 FBS</td></tr><tr><td>결핍 Tet</td><td>Altanta Biologicals</td><td>S10350</td><td>성장에 사용 유도성 LAP-tagged 안정된 세포주 생성 및 성장을 위한 -Tet DMEM/F12 배지 제작에 사용</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>플레이트에서 Hek293 세포 초점을 들어올리기 위해</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>프로토콜 버퍼를 만드는 데 사용되며, EDTA-free</td></tr><tr><td>10% nonyl phenoxypolyethoxylethanol&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11332473001</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>프로토콜 버퍼</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>붕산나트륨</td><td>Fisher</td><td>S249-500</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher</td><td>A78-500</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>에탄올 아민</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>프로토콜 버퍼</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td>프로토콜 버퍼</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>프로토콜 버퍼</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>제작</td>에 사용 Fisher <td>BP172-25</td><td>프로토콜 버퍼</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher 제작에 사용</td><td>M33-500</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>프로토콜 버퍼 제작에 사용</td></tr></tbody></table>

조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 lap-태그 안정 세포주

Inducible LAP-tagged Stable Cell Lines for Investigating Protein Function, Spatiotemporal Localization and Protein Interaction Networks

단일 단백질이 단독으로 작용하는 것보다 다중 단백질 복합체가 세포 항상성을 조절하는 분자 경로를 제어하는 경우가 많습니다. 이 원리에 기초하여, 본래 상호 작용 파트너와 함께 이러한 경로의 기능에 필요한 중요한 단백질의 정제는 이러한 경로의 단백질 구성 성분을 매핑할 수 있게 했을 뿐만 아니라 이러한 단백질이 이러한 경로를 조절하기 위해 어떻게 조정되는지에 대한 더 깊은 이해를 제공했습니다. 이러한 맥락에서 단백질의 시공간 국소화와 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 이해하면 경로 내에서 단백질의 역할을 정의하는 데 도움이 될 수 있을 뿐만 아니라 단백질의 잘못된 조절이 어떻게 질병 발병으로 이어질 수 있는지 알 수 있습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 TAP(Tandem Affinity Purification) 및 LAP(Localion and Affinity Purification)와 같은 단백질 정제를 위한 여러 가지 접근 방식이 설계되고 성공적으로 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식을 경로 규모의 단백질체 분석에 적용하기 위해서는 이러한 전략에 클로닝 및 포유류의 안정적인 세포주 생성에 대한 현대 기술 개발로 보완되어야 합니다. 여기에서는 단백질 세포 내 국소화 및 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 조사하기 위해 LAP-tagged 인간 유도 가능한 안정적인 세포주를 생성하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 세포 분열을 포함한 여러 세포 경로의 해부에 성공적으로 적용되었으며 고처리량 단백질체학 분석과 호환됩니다.

이 시스템의 유용성을 강조하기 위해, 타우 미소 관 결합 단백질의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 갖는 PCR 제품 attB1과 attB2 사이트를 함유하는 프라이머 타우 ORF 증폭 (표 1)과 배양하여 셔틀 벡터 내로 클로닝 셔틀 벡터 및 셔틀 벡터 내로 PCR 산물의 삽입을 매개 재조합 효소. 반응 생성물 타우 삽입을 위해 서열화 된 카나마이신 내성 콜로니로부터 DH5α 박테리아 13 및 플라스미드 DNA를 형질 전환 하였다. 시퀀스 검증 셔틀 타우 벡터는 다음의 pGLAP1 벡터로 셔틀 - 타우 벡터를 배양하여 LAP (EGFP-TEV-S-단백질) 태그로 프레임에 타우를 융합 pGLAP1 벡터로 타우 ORF를 전송하는 데 사용되었다 및 pGLAP1에 셔틀 벡터에서 ORF의 전달을 매개 재조합 효소. 반응 생성물을 DH5α 균을 형질 전환했다암피실린 내성 콜로니에서 13 플라스미드 DNA는 LAP-타우 융합 프레임 있다는 보장하기 위해 염기 서열했다. 순서 pGLAP1-LAP-타우 후 단일 flippase 인식 대상 LAP-태그 유전자 통합 사이트가 그들의 게놈 내에서 (FRT) 사이트를 포함 HEK293 세포에 flippase 재조합 효소를 발현하는 벡터로 형질 공동 된 검증 14. 이 세포주는 또한 LAP-태그 유전자의 상류 구정 운영에 결합 테트 / Dox가의 부재에서 발현을 침묵 TetR를 표명했다. 안정적인 통합 체 5 일 동안 100 μg의 / ㎖ 하이 그로 마이신과 -Tet DMEM / F12 매체로 선정되었다. 개별 하이 그로 마이신 내성 세포의 초점은 상단에 트립신 20 μl를 추가하고 아래로 2 회를 ​​피펫 팅에 의해 수거 하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 넣고 -Tet DMEM / F12 배지에서 연속 성장에 의해 팽창되었다. 하이 그로 마이신 내성 세포 있는지 확인하려면LAP (S)는 타우를 발현 할 수 있었다 HEK293 LAP 타우 세포는 15 시간 단백질 추출물 0.1 μg의 / ㎖의 Dox를로 유도 하였다는 유도되지 않은 및 유도 Dox를 세포로부터 제조 하였다. 이 추출물을 PVDF 막으로 전달, SDS-PAGE에 의해 분리하고, 로딩 대조군으로 튜 블린에 대한 GFP 및 immunoblotted 하였다. 도 4a, LAP 타우에서 보듯 (항 GFP 항체로 가시화) 만 존재 Dox를 표현 하였다. 이전 내생 타우 (18)에 대해 표시했다으로 LAP-타우 제대로, 유사 분열시 유사 분열 미세 소관 스핀들에 현지화 된 것을 확인하려면, HEK293 LAP-타우 세포는 15 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖ Dox가로 유도하고, 세포를 4 %로 고정 하였다 파라 포름 알데히드와 공동 스테인드 DNA (훽스트 33342) 및 미세 소관 (안티 - 튜 불린 항체)를 참조하십시오. 지속적으로, LAP-타우는 유사 분열의 중기 (그림 4B) 동안 유사 분열 스핀들에 현지화했다. 그 LAP-타우와 상호 작용하는 단백질을 확인하려면이 SYS로 정제 할 수있다TEM, HEK293 LAP 타우 세포는 교반 수확 15 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖의 Dox를로 유도 롤러 병으로 ~ 70 % 전면 생장 성장 LAP300 완충액으로 용해하고, LAP 타우은 상기 프로토콜을 사용하여 정제 하였다. LAP-타우 정화의 용출액은 SDS-PAGE에 의해 해결하고, 젤은 스테인드했다. 도 4c는 별표 (*)로 표시된 LAP-타우 정제, LAP-타우와 타우 상호 작용하는 단백질을 나타내는이 볼 수있는 여러 가지 다른 밴드 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig1.jpg"> 그림 1 : 관심의 단백질에 대한 LAP-태그 유도 성 안정 세포 라인의 세대의 개요. 관심 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)은 attB1과 attB2 사이트를 각각 5 '및 3'말단 서열을 플 랭킹으로 증폭 (프라이머 서열에 나타내 표 1) 내로 클로닝 셔틀 벡터. 관심의 유전자 서열 확인 셔틀 벡터는 다음 pGLAP1 벡터에 목적 유전자를 전달하기 위해 사용된다. 관심의 유전자 pGLAP1 벡터 확인 시퀀스는 단일 flippase 인식 대상 LAP에 대한 통합 사이트가 자신의 게놈 내에서 (FRT) 사이트를 포함하여 원하는 세포주에 flippase 재조합 효소를 함유하는 벡터로 공동 - 형질 -tagged 유전자. 이 세포주는 또한 LAP-태그 유전자의 상류 구정 리프레 구정 운영에 결합 (TetR) (TETO 2)를 표현하고 구정 / Dox가의 부재에서 발현을 침묵. 관심의 LAP-태그 유전자는 다음 FRT 사이트에 재결합하고 안정적인 통합 체는 하이 그로 마이신으로 선택됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/&gt; 그림 2 : LAP-태그 안정 세포주에 대한 응용 프로그램의 개요. LAP 태깅 유도 안정한 세포주 Dox를 첨가하여 관심 LAP 표지 된 단백질을 발현하도록 유도하고 세포주기의 여러 단계에서 동기화 될 수도 있고 임의의 신호 전달 경로를 활성화하는 화학 물질 또는 리간드로 자극 될 수있다. 관심있는 LAP-태그 단백질의 세포 내 현지화 라이브 셀 또는 고정 된 세포 이미징에 의해 분석 될 수있다. LAP 표지 된 단백질은 탠덤 친화 정제와 그들의 상호 작용 단백질 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)에 의해 확인 될 수있을 수있다. 마지막 Cytoscape 미끼 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크를 생성하는데 사용될 수있다. DOX는 TEV는 TEV 단백질 분해 효소 절단 부위를 나타내고, EGFP가 녹색 형광 단백질을 강화 나타냅니다, IP는 면역 침전을 나타내고, 독시사이클린을 나타내고, S는 S-태그를 나타냅니다.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig3.jpg"> 그림 3 : 질량 분석에 대한 LAP-태그 단백질 발현, 정제 및 제조의 개요. LAP-태그 단백질 발현의 1) 성장과 유도 해물의, 2) 세포 수확 및 용해, 3) 준비, 4) 항 GFP 구슬에 해물의 결합, 5) TEV 단백질 분해 효소 절단 : 프로토콜은 9 단계가 있습니다 GFP의 태그가, 6) S 단백질 비드 해물 결합 7) 미끼 단백질 및 상호 작용 단백질, 및 8-9) 질량 분석 기반 프로테옴 분석을위한 시료의 준비의 용출. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54870/54870fig4.jpg"> 그림 4 : LAP-타우 식의 검증. (A) 웨스턴 블롯 (WB) 각각 LAP 태깅 된 타우 단백질과 튜 불린로드 제어를 검출 안티 GFP 및 안티 튜 불린 항체로 프로빙 유도 유도 비와 Dox를 LAP 타우 HEK293 세포로부터 단백질 샘플 분석. 세포가 Dox가로 유도하는 경우 그 LAP-타우 만 표현되어 있습니다. LAP-타우를 표현 (B) 유사 분열 세포를 고정하고 공동 스테인드 안티 - 튜 불린 항체 및 LAP 타우의 세포 내 현지화와 DNA (훽스트 33342) 및 튜 불린 (욕조)에 대한이 형광 축소 복사하여 분석 하였다. 그 LAP-타우가 유사 분열시 유사 분열 스핀들과 스핀들 극에 지역화합니다. (C) 실버는 LAP-타우 정화의 젤 스테인드. MW는 분자량을 나타내고, CL은 삭제 해물, 그리고 E의 인도어를 나타냅니다ATES 최종 용출액. 샘플은 4-20 % SDS-PAGE에서 실행하고, 겔 실버 정제 된 단백질을 시각화하기 위해 염색했다. LAP-타우에 해당하는 대역은 별표와 볼 수있는 단백질을 정화 공동 대응 여러 가지 다른 밴드로 표시되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> N- 말단 융합 </td><td></td></tr><tr><td> 앞으로 </td><td> 5' GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> 역 </td><td> 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> C 말단 융합 </td><td></td></tr><tr><td> 앞으로 </td><td> 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr><tr><td> 역 </td><td> 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G - (&gt; 18gsn) -3 ' </td></tr></tbody></table> 표 1 : 정 및 셔틀 벡터에 삽입하는 ORF 또는 관심을 증폭하기위한 프라이머 역. attB 사이트는 굵은 글씨로 강조되어 있으며, GSN은 18 개 이상의 유전자 특정 뉴클레오티드 프라이머에 추가되는 것을 의미한다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> 단계 </td><td> 온도 </td><td> 시각 </td></tr><tr><td colspan="2"> 초기 변성 </td><td> 94 ° C </td><td> 2 분 </td></tr><tr><td rowspan="3"> PCR 증폭 사이클 (35) </td><td> 변성하다 </td><td> 94 ° C </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 어닐링 </td><td> 55 ° C (프라이머 Tm은에 따라 다름) </td><td> 30 초 </td></tr><tr><td> 넓히다 </td><td> 72 ° C </td><td> 1 분 / 킬로바이트 </td></tr><tr><td colspan="2"> 보류 </td><td> 4 ° C </td><td> 무기한 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 관심의 개의 ORF의 증폭을위한 PCR 조건. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 벡터 </td><td> 앞으로 시퀀싱 프라이머 </td><td> 시퀀싱 프라이머 역 </td></tr><tr><td> 셔틀 벡터 </td><td> 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' </td><td> 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 ' </td></tr></tbody></table> 표 3 : 셔틀 벡터에 대한 순방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 신분증 </td><td> 구조 </td><td> 부모의 </td><td> 발기인 </td><td> 혈중 알코올 농도가 해상도 </td><td> 엄만 해상도 </td><td> 구정 등록? </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> N-용어 EGFP-TEV-S 펩티드 </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> 앰프 </td><td> HYG </td><td> 예 </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> N-용어 국기-TEV-S 펩티드 </td><td> pcDNA5 / FRT / TO </td><td> CMV </td><td> 앰프 </td><td> HYG </td><td> 예 </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> N-용어 EGFP-TEV-S 펩타이드; C-용어 V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> 앰프 </td><td> HYG </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> N-용어 국기-TEV-S 펩타이드; ; C-용어 V5 </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td></td><td> HYG </td><td> 아니 </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> C-용어 S 펩타이드 - PreProt X2-EGFP </td><td> pEF5 / FRT-V5 </td><td> EF1a </td><td> 앰프 </td><td> HYG </td><td> 아니 </td></tr></tbody></table> 표 4 : 변수 발기인, 에피토프 - 태그 및 N에 대한 Dox를 유도 성 표현 기능 또는 C 말단 단백질 태그와 함께 사용 가능 LAP / TAP 일러스트의 목록입니다. 벡터가 시판되고있다. 혈중 알코올 농도가 해상도가 세균의 내성 마커를 표시, 엄만 해상도는 포유 동물 세포 저항 마커, 구정의 등록 번호를 표시? 식 구정 / Dox가의 조절 성 여부를 나타냅니다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 벡터 </td><td> 앞으로 시퀀싱 프라이머 </td><td> 시퀀싱 프라이머 역 </td></tr><tr><td> pGLAP1 </td><td> 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP2 </td><td> 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' </td><td> 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP3 </td><td> 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP4 </td><td> 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' </td><td> 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' </td></tr><tr><td> pGLAP5 </td><td> 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' </td><td> 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 ' </td></tr></tbody></table> 표 5 : pGLAP 벡터에 대한 순방향 및 역방향 시퀀싱 프라이머.

단백질 기능, 시공간 세포 내 국소화 및 단백질-단백질 상호 작용 네트워크를 조사하기 위해 LAP(localization and affinity purification) 태그가 지정된 유도 가능한 안정 세포주를 생성하는 방법을 설명합니다.

조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주

Multi-protein complexes, rather than single proteins acting in isolation, often govern molecular pathways regulating cellular homeostasis. Based on this ...

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 기능, 시공간 국소화 및 단백질 상호 작용 네트워크를 조사하기 위해 유도 가능한 국소화 및 친화성 정제 또는 LAP 태그가 지정된 안정적인 세포주를 생성하는 것입니다. 이 방법은 단백질 기능, 단백질 세포주기 영하 국소화 및 단백질 상호 작용과 관련된 분자 및 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 단백질 그룹의 고처리량 분석에 적합하고 생물학적 경로의 단백질 구성 요소를 해부하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.이 절차를 시작하려면 관심 유전자의 open reading frame을 LAP-tagged 벡터에 복제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HEK293 세포에 transfection합니다. transfection 하루 후 마이너스 Tet DMEM/F12 배지를 새 배지로 교체합니다. transfection 2일 후 세포를 25%confluence로 분할합니다.세포가 부착될 때까지 약 5시간 동안 기다립니다. 그런 다음 hygromycin 함유 마이너스 Tet DMEM/F12 매체를 미리 결정된 농도로 첨가합니다. HEK293 세포의 경우 밀리리터당 100마이크로그램 하이그로마이신을 사용합니다.투명 플레이트에 불투명한 반점과 유사한 뚜렷한 세포 초점이 나타날 때까지 필요에 따라 배지를 교체합니다. 각 세포 초점의 상단에 20마이크로리터의 트립신을 추가하고 200마이크로리터 피펫 팁으로 위아래로 두 번 파이프를 연결합니다. 24-well plate에 세포를 옮기고 hygromycin-containus Tet DMEM/F12 media에서 지속적인 증식을 통해 세포를 확장합니다.단백질 복합체의 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification, TAP) 분리를 위해 검증된 LAP-tagged 세포주를 확장합니다. 이를 위해 모든 HEK293 셀을 더 큰 플레이트 및/또는 롤러 병에 지속적으로 통과시키고 섭씨 37도에서 Tet DMEM/F12 매체를 빼고 5%의 이산화탄소를 배출합니다. Tet/Dox 유도 세포주의 경우, 세포가 약 70%의 포화도에 도달할 때 Tet/Dox 밀리리터당 0.2마이크로그램의 농도를 첨가하여 10-15시간 동안 세포를 유도합니다.교반 또는 트립신화(trypsinization)에 의해 세포를 수확한다. 그런 다음 875 배 g으로 5-10 분 동안 펠릿으로 만듭니다. 항-GFP 항체를 단백질 A 비드에 결합하려면 1.5ml 튜브에서 160마이크로리터의 패킹 볼륨 단백질 A 비드를 PBST와 평형화합니다.PBST 1ml로 구슬을 세 번 씻습니다. 이 절차의 각 세척 단계에 따라 비드를 5000회 g에서 10초 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 500마이크로리터의 PBST에 비드를 다시 현탁시킨 후 160마이크로리터의 비드를 포함하는 각 튜브에 80마이크로그램의 친화력 정제 고속 항-GFP 항체를 추가합니다.실온에서 1시간 동안 섞습니다. 1ml의 PBST로 비드를 두 번 세척한 다음 1ml의 0.2몰 붕산나트륨, pH로 비드를 두 번 세척한 다음 최종 세척 후 900마이크로리터의 붕산나트륨 완충액을 추가하여 최종 부피를 1ml로 만듭니다. 그런 다음 100마이크로리터의 220몰 DMP를 비드 현탁액에 추가하여 최종 농도를 20밀리몰로 만듭니다.튜브를 실온에서 30분 동안 부드럽게 회전시킵니다. DMP로 배양한 후 0.2몰 에탄올아민 1ml, pH 0.2몰 염화나트륨 8.5로 비드를 한 번 세척하여 잔류 교차결합제를 비활성화합니다. 그런 다음 동일한 버퍼의 1ml에 비드를 다시 현탁시키고 실온에서 1시간 동안 회전합니다.비드를 펠릿화한 후 추가로 500마이크로리터의 버퍼에 다시 현탁합니다. 준비된 비드는 섭씨 4도에서 몇 달 동안 안정적입니다. 세포 용해물을 준비하려면 500마이크로리터의 충전된 세포 부피를 0.5밀리몰 DTT 및 프로테아제 억제제를 사용하여 2.5ml의 LAP 300으로 다시 현탁합니다.90 마이크로 리터의 10 % 노닐 페녹시 폴리에틸렌 에톡시 에탄올을 넣고 반전으로 혼합합니다. 혼합물을 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 21, 10 분 동안 000 번 g에서 원심 분리기.원심분리 후 이 저속 상등액을 수집하고 겔 분석을 위해 10마이크로리터 샘플을 따로 보관합니다. 저속 상등액을 TLA 100.3 튜브에 옮긴 후 섭씨 4도에서 1시간 동안 100, 000회 g으로 회전합니다. 이 고속 상등액을 튜브에 모아 얼음 위에 놓고 겔 분석을 위해 10마이크로리터 샘플을 예약합니다.anti-GFP beads에 대한 결합을 통한 첫 번째 친화성 캡처의 경우, uncoupled antiboly를 제거하고 background를 줄이기 위해 1ml의 용리 버퍼로 3회 세척하여 항체 결합 bead를 사전 용리합니다. 이 작업을 신속하게 수행합니다. 구슬을 고염분에 장기간 두지 마십시오.다음, LAP 200 N.Next의 1 밀리리터로 구슬을 3 번 세척하십시오, 고속 상등액 추출물을 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 항체 구슬과 섞으십시오. 추출물을 21, 000 회 g에서 10 분 동안 원심 분리 한 후 겔 분석을 위해 상등액의 10 마이크로 리터 샘플을 예약합니다. 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 LAP 200 N 1ml로 비드를 3회 빠르게 세척합니다.동일한 버퍼를 사용하여 비드를 두 번 더 세척하고 세척할 때마다 5분의 배양 시간을 갖습니다. 그런 다음 프로테아제 억제제가 없는 0.5밀리몰 DTT가 함유된 LAP 200 N 1ml로 비드를 빠르게 두 번 더 세척한 후 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제를 첨가합니다. 1ml의 LAP 200 N에 TEV 프로테아제 10마이크로그램을 비드에 첨가하고 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 회전시킵니다.다음 날, 구슬을 펠릿으로 만들고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 160마이크로리터의 LAP 200 N으로 비드를 두 번 헹구어 잔류 단백질을 제거합니다. S 단백질 아가로스에 결합을 통해 두번째 친화력 붙잡음을 위해, 80 마이크로 리터 S 단백질 아가로스 슬러리의 1개의 관을 S 단백질 구슬에 TEV에 의하여 용출된 상청액 200 N.Add의 1 밀리리터로 세척하고, 4 섭씨 온도에 3 시간 동안 그(것)들을 흔듭니다.비드를 펠릿화한 후 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 LAP 200 N 1밀리리터로 3회 세척합니다. 그런 다음 1ml의 LAP 100으로 비드를 두 번 세척합니다. 50마이크로리터의 4x Laemmli 샘플 버퍼를 추가하고 섭씨 97도에서 10분 동안 가열하여 S-단백질 아가로스에서 단백질을 용리합니다.질량 분석 분석으로 상호 작용하는 단백질을 식별하려면 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis로 수집된 샘플을 분석하여 정제 품질을 테스트합니다. 결과 젤을 은색으로 염색합니다. 또한 용리액을 면역 블롯하고 항 GFP 항체로 프로브하여 LAP-tagged 정제가 작동하는지 확인합니다.화학량론적 및 substoichiometric co-purifying species를 식별하려면 최종 용출 샘플을 채취하여 SDS-PAGE로 분리합니다. 질량 분석법과 호환되는 단백질 염색으로 겔을 염색합니다. 겔에서 가장 눈에 띄는 띠와 그 사이의 공간을 절제하여 질량 분석법에 의한 분석을 위해 띠를 별도로 처리합니다.다음은 비유도 및 Dox 유도 LAP-Tau HEK293 세포의 단백질 샘플에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석입니다. 세포는 항 Tubulin 항체로 프로브되어 Tubulin 로딩 컨트롤을 검출하고 anti-GFP로 프로브하여 LAP-tagged Tau 단백질을 검출합니다. LAP-Tau는 세포가 Dox로 유도될 때만 발현됩니다.LAP-Tau를 발현하는 Mytotic cell을 고정하고 DNA와 Tubulin을 anti-Tubulin 항체와 함께 공동 염색하고, LAP-Tau의 세포 내 국소화를 형광 현미경으로 분석했습니다. LAP-Tau는 유사분열 동안 유사분열 방추체와 방추극에 국한됩니다. 여기에 표시된 것은 LAP-Tau 정제의 대표적인 실버 염색 젤입니다.lane은 분자량, 투명화된 용해물 및 최종 용리물을 나타냅니다. 샘플은 4-20%SDS-PAGE 겔에서 실행되었으며 정제된 단백질을 시각화하기 위해 겔을 은으로 염색했습니다. LAP-Tau에 해당하는 밴드는 별표로 표시되며, 공동 정제 단백질에 해당하는 여러 다른 밴드를 볼 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 유도성 LAP-tagged 안정 세포주를 생성하는 방법과 단백질체학 분석 및 단백질 상호 작용 네트워크 식별을 위해 LAP-tagged 단백질의 생화학적 정제를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 선충 세포에서 현장 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다. 관심 단백질의 근접성은 2차 항체에 부착된 PLA 프로브의 도움으로 원형 DNA 템플릿을 생성합니다. 프로브는 긴 단일 가닥 DNA를 생성한 후 검출기 프로브의 혼성화를 생성하는 증폭 용액을 사용하여 추가로 증폭되어 세포 내 단백질-단백질 상호 작용의 국소화를 가능하게 합니다.

In Situ 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위한 근접 결찰 분석(Proximity Ligation Assay)

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

단백질 상호 작용 : SILAC의 면역 실험은 새로운 단백질을 발견하기위한 강력한 수단을 나타냅니다. 있도록하여 제어 및 시험 샘플, 진정한 상호 작용 모두에서 단백질 풍부 정확한 상대적 정량화 간단 실험 오염물 구별 될 수 있고, 선호도가 낮은 상호 작용은 덜 엄격한 버퍼 조건의 사용을 통해 유지.

SILAC - 면역 정량 프로테오믹스를 사용하여 포유 동물 세포에있는 단백질 상호 작용 파트너의 식별

여기, 우리는 고정 된 세포에서 소포체와 미토콘드리아의 내생 적 상호 작용을 시각화하고 고감도로 정량화 할 수있는 절차를 설명합니다. 프로토콜은이 미토콘드리아 관련 막 계면에서 이노시톨에게 1,4,5- 트리 포스페이트 수용체 / 혈당 조절 단백질 75 / 전압 가변 음이온 채널 / 시클로 필린의 D 복합체 타겟팅 시츄 근접 결찰 분석법 최적화 기능.

소포체와 미토콘드리아의 상호 작용의 연구에 의해<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석 고정 세포의

세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.

Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

여기, 우리가 근접 결 찰 분석 결과 (PLA)를 사용 하 여 높은 감도와 고정된 셀에 MST1/MST2 heterodimerization를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.

박테리아, 효모 및 인간 세포에서 일시적으로 형성된 분자 샤페론 어셈블리의 시투 모니터링

여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.

플래그-비오틴 탠덤 정화에 의해 중재된 상호 연결 및 면역 침전을 통해 단백질-RNA 상호 작용의 전사-전체 프로파일링

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

배우세요 LAP-태그 유도 안정 세포주를 생성하여 단백질 기능과 시공간 현지화 및 상호작용 네트워크를 연구하는 방법을. HEK293 세포를 이용한 고효율 단백질 복합체 정제 기술을 익히세요.

조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주

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