조사 단백질 기능, 시공간 현지화 및 단백질 상호 작용 네트워크를위한 유도 LAP-태그 안정 세포주

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 기능, 시공간 국소화 및 단백질 상호 작용 네트워크를 조사하기 위해 유도 가능한 국소화 및 친화성 정제 또는 LAP 태그가 지정된 안정적인 세포주를 생성하는 것입니다. 이 방법은 단백질 기능, 단백질 세포주기 영하 국소화 및 단백질 상호 작용과 관련된 분자 및 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 단백질 그룹의 고처리량 분석에 적합하고 생물학적 경로의 단백질 구성 요소를 해부하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 관심 유전자의 open reading frame을 LAP-tagged 벡터에 복제하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 HEK293 세포에 transfection합니다. transfection 하루 후 마이너스 Tet DMEM/F12 배지를 새 배지로 교체합니다. transfection 2일 후 세포를 25%confluence로 분할합니다.

세포가 부착될 때까지 약 5시간 동안 기다립니다. 그런 다음 hygromycin 함유 마이너스 Tet DMEM/F12 매체를 미리 결정된 농도로 첨가합니다. HEK293 세포의 경우 밀리리터당 100마이크로그램 하이그로마이신을 사용합니다.

투명 플레이트에 불투명한 반점과 유사한 뚜렷한 세포 초점이 나타날 때까지 필요에 따라 배지를 교체합니다. 각 세포 초점의 상단에 20마이크로리터의 트립신을 추가하고 200마이크로리터 피펫 팁으로 위아래로 두 번 파이프를 연결합니다. 24-well plate에 세포를 옮기고 hygromycin-containus Tet DMEM/F12 media에서 지속적인 증식을 통해 세포를 확장합니다.

단백질 복합체의 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification, TAP) 분리를 위해 검증된 LAP-tagged 세포주를 확장합니다. 이를 위해 모든 HEK293 셀을 더 큰 플레이트 및/또는 롤러 병에 지속적으로 통과시키고 섭씨 37도에서 Tet DMEM/F12 매체를 빼고 5%의 이산화탄소를 배출합니다. Tet/Dox 유도 세포주의 경우, 세포가 약 70%의 포화도에 도달할 때 Tet/Dox 밀리리터당 0.2마이크로그램의 농도를 첨가하여 10-15시간 동안 세포를 유도합니다.

교반 또는 트립신화(trypsinization)에 의해 세포를 수확한다. 그런 다음 875 배 g으로 5-10 분 동안 펠릿으로 만듭니다. 항-GFP 항체를 단백질 A 비드에 결합하려면 1.5ml 튜브에서 160마이크로리터의 패킹 볼륨 단백질 A 비드를 PBST와 평형화합니다.

PBST 1ml로 구슬을 세 번 씻습니다. 이 절차의 각 세척 단계에 따라 비드를 5000회 g에서 10초 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 500마이크로리터의 PBST에 비드를 다시 현탁시킨 후 160마이크로리터의 비드를 포함하는 각 튜브에 80마이크로그램의 친화력 정제 고속 항-GFP 항체를 추가합니다.

실온에서 1시간 동안 섞습니다. 1ml의 PBST로 비드를 두 번 세척한 다음 1ml의 0.2몰 붕산나트륨, pH로 비드를 두 번 세척한 다음 최종 세척 후 900마이크로리터의 붕산나트륨 완충액을 추가하여 최종 부피를 1ml로 만듭니다. 그런 다음 100마이크로리터의 220몰 DMP를 비드 현탁액에 추가하여 최종 농도를 20밀리몰로 만듭니다.

튜브를 실온에서 30분 동안 부드럽게 회전시킵니다. DMP로 배양한 후 0.2몰 에탄올아민 1ml, pH 0.2몰 염화나트륨 8.5로 비드를 한 번 세척하여 잔류 교차결합제를 비활성화합니다. 그런 다음 동일한 버퍼의 1ml에 비드를 다시 현탁시키고 실온에서 1시간 동안 회전합니다.

비드를 펠릿화한 후 추가로 500마이크로리터의 버퍼에 다시 현탁합니다. 준비된 비드는 섭씨 4도에서 몇 달 동안 안정적입니다. 세포 용해물을 준비하려면 500마이크로리터의 충전된 세포 부피를 0.5밀리몰 DTT 및 프로테아제 억제제를 사용하여 2.5ml의 LAP 300으로 다시 현탁합니다.

90 마이크로 리터의 10 % 노닐 페녹시 폴리에틸렌 에톡시 에탄올을 넣고 반전으로 혼합합니다. 혼합물을 얼음 위에 10분 동안 놓습니다. 21, 10 분 동안 000 번 g에서 원심 분리기.

원심분리 후 이 저속 상등액을 수집하고 겔 분석을 위해 10마이크로리터 샘플을 따로 보관합니다. 저속 상등액을 TLA 100.3 튜브에 옮긴 후 섭씨 4도에서 1시간 동안 100, 000회 g으로 회전합니다. 이 고속 상등액을 튜브에 모아 얼음 위에 놓고 겔 분석을 위해 10마이크로리터 샘플을 예약합니다.

anti-GFP beads에 대한 결합을 통한 첫 번째 친화성 캡처의 경우, uncoupled antiboly를 제거하고 background를 줄이기 위해 1ml의 용리 버퍼로 3회 세척하여 항체 결합 bead를 사전 용리합니다. 이 작업을 신속하게 수행합니다. 구슬을 고염분에 장기간 두지 마십시오.

다음, LAP 200 N.Next의 1 밀리리터로 구슬을 3 번 세척하십시오, 고속 상등액 추출물을 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 항체 구슬과 섞으십시오. 추출물을 21, 000 회 g에서 10 분 동안 원심 분리 한 후 겔 분석을 위해 상등액의 10 마이크로 리터 샘플을 예약합니다. 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 LAP 200 N 1ml로 비드를 3회 빠르게 세척합니다.

동일한 버퍼를 사용하여 비드를 두 번 더 세척하고 세척할 때마다 5분의 배양 시간을 갖습니다. 그런 다음 프로테아제 억제제가 없는 0.5밀리몰 DTT가 함유된 LAP 200 N 1ml로 비드를 빠르게 두 번 더 세척한 후 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제를 첨가합니다. 1ml의 LAP 200 N에 TEV 프로테아제 10마이크로그램을 비드에 첨가하고 튜브를 섭씨 4도에서 밤새 회전시킵니다.

다음 날, 구슬을 펠릿으로 만들고 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 160마이크로리터의 LAP 200 N으로 비드를 두 번 헹구어 잔류 단백질을 제거합니다. S 단백질 아가로스에 결합을 통해 두번째 친화력 붙잡음을 위해, 80 마이크로 리터 S 단백질 아가로스 슬러리의 1개의 관을 S 단백질 구슬에 TEV에 의하여 용출된 상청액 200 N.Add의 1 밀리리터로 세척하고, 4 섭씨 온도에 3 시간 동안 그(것)들을 흔듭니다.

비드를 펠릿화한 후 0.5 밀리몰 DTT와 프로테아제 억제제가 함유된 LAP 200 N 1밀리리터로 3회 세척합니다. 그런 다음 1ml의 LAP 100으로 비드를 두 번 세척합니다. 50마이크로리터의 4x Laemmli 샘플 버퍼를 추가하고 섭씨 97도에서 10분 동안 가열하여 S-단백질 아가로스에서 단백질을 용리합니다.

질량 분석 분석으로 상호 작용하는 단백질을 식별하려면 Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis로 수집된 샘플을 분석하여 정제 품질을 테스트합니다. 결과 젤을 은색으로 염색합니다. 또한 용리액을 면역 블롯하고 항 GFP 항체로 프로브하여 LAP-tagged 정제가 작동하는지 확인합니다.

화학량론적 및 substoichiometric co-purifying species를 식별하려면 최종 용출 샘플을 채취하여 SDS-PAGE로 분리합니다. 질량 분석법과 호환되는 단백질 염색으로 겔을 염색합니다. 겔에서 가장 눈에 띄는 띠와 그 사이의 공간을 절제하여 질량 분석법에 의한 분석을 위해 띠를 별도로 처리합니다.

다음은 비유도 및 Dox 유도 LAP-Tau HEK293 세포의 단백질 샘플에 대한 대표적인 웨스턴 블롯 분석입니다. 세포는 항 Tubulin 항체로 프로브되어 Tubulin 로딩 컨트롤을 검출하고 anti-GFP로 프로브하여 LAP-tagged Tau 단백질을 검출합니다. LAP-Tau는 세포가 Dox로 유도될 때만 발현됩니다.

LAP-Tau를 발현하는 Mytotic cell을 고정하고 DNA와 Tubulin을 anti-Tubulin 항체와 함께 공동 염색하고, LAP-Tau의 세포 내 국소화를 형광 현미경으로 분석했습니다. LAP-Tau는 유사분열 동안 유사분열 방추체와 방추극에 국한됩니다. 여기에 표시된 것은 LAP-Tau 정제의 대표적인 실버 염색 젤입니다.

lane은 분자량, 투명화된 용해물 및 최종 용리물을 나타냅니다. 샘플은 4-20%SDS-PAGE 겔에서 실행되었으며 정제된 단백질을 시각화하기 위해 겔을 은으로 염색했습니다. LAP-Tau에 해당하는 밴드는 별표로 표시되며, 공동 정제 단백질에 해당하는 여러 다른 밴드를 볼 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 유도성 LAP-tagged 안정 세포주를 생성하는 방법과 단백질체학 분석 및 단백질 상호 작용 네트워크 식별을 위해 LAP-tagged 단백질의 생화학적 정제를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.