수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

MicroSecure 배아 유리화법의 전반적인 목표는 인간 배아를 위한 안전하고 보안이 유지되며 간단하면서도 효과적인 무균 폐쇄 유리화 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 인간 배아의 유리화(vitrification)에서 품질 관리 변수를 최소화하기 위해 개발되어 신뢰할 수 있고 재현 가능한 성공을 보장합니다. 이 기술의 주요 장점은 생물학자와 실험실 간의 기술적 차이를 없애기 위해 노력한다는 것입니다.

우리의 기술은 수행하기가 너무 간단하여 연수생들에게 가장 큰 도전은 배아를 잃지 않고 파이펫팅하는 방법을 배우는 것입니다. 우리 방법의 이면에 있는 아이디어는 일반적으로 사용되는 두 가지 FDA 승인 항목을 조정하여 특수 장치의 필요성을 제거하는 것이었습니다. 내부적으로 라벨이 부착된 이오노머 보관 빨대와 멸균 플렉시펫.

이 기술의 시각적 시연은 성공적인 적용을 보장하는 기본 팁을 강조하기 때문에 매우 유용합니다. 절차를 시작하기 전에 멸균 0.3ml 정액 빨대를 플러그 바로 앞에 있는 기본 탁상용 임펄스 실러 전극의 테프론 표면에 놓고 내부 밀봉을 만듭니다. 핸들을 눌러 열을 활성화하고 빨간색 표시등이 꺼지고 신호음이 들리면 핸들을 놓습니다.

그런 다음 설정을 완료하기 전에 면 플러그를 내부 씰에 대고 앞으로 밉니다. 샘플의 극저온 희석 및 배반포 로딩을 위해 인큐베이터에서 환자 배양 접시를 제거하고 2차 소스로 모든 검체 식별을 확인합니다. 실체현미경 하에서 vit tip이라고 하는 유리화 플렉시펫을 사용하여 배반포를 해당 cryo dish의 맨 윗줄에 있는 개별 보유 액적으로 이동합니다.

다음으로, 플렉시펫에 3마이크로리터의 V1 용액을 미리 채우고 내용물의 절반을 첫 번째 배아에 분배합니다. 배아를 흡인하고 첫 번째 V1 세척 액적으로 옮깁니다. 그런 다음 배아를 액적 둘레에 2-3회 피펫으로 주입하고 액적 외부에 남아 있는 피펫 내용물을 접시 표면으로 제거합니다.

그런 다음 배반포를 개별 V1 홀딩 드롭으로 옮기고 다음 V2 용액으로 vit tip을 미리 로드한 후 새로운 vit tip으로 추가 배아를 피펫팅합니다. 방금 시연한 바와 같이 V2 및 V3 액적의 모든 배반포를 세척한 후, V3 보유 액적 외부의 vit tip에서 잔류 용액과 기포를 제거하고 첫 번째 배아 주위의 깨끗한 V3 용액으로 팁을 완전히 채웁니다. 약 1 μl의 부피를 배출하고 배반포와 나머지 V3 용액을 vit tip으로 완전히 흡인합니다.

이제 피펫에서 팁을 제거하고 멸균 거즈 패드를 사용하여 vit 팁의 외부 표면에서 잔류 V3 용액을 건조시킵니다. 팁의 외부 표면을 건조하는 것은 매우 중요하며 배아 손실의 추가 위험을 초래하지 않습니다. 그런 다음 팁 끝을 미리 밀봉된 빨대의 열린 끝 부분에 먼저 삽입하고 빨대를 뒤집어 라벨 끝을 아래로 향하게 합니다.

내부 플러그의 팁을 관찰하십시오. 열린 끝에 1cm의 공역을 남겨 둔 다음 안전하게 용접 밀봉하여 닫습니다. 빨대가 모두 밀봉되면 스테인리스 스틸 듀어 플라스크에 담긴 액체 질소에 직접 담그고 빨대를 환자의 지팡이에 부착된 열린 잔에 보관하십시오.

극저온 용액 용출 및 희석을 위해 해당 6웰 희석 접시를 실체현미경 스테이지 중앙에 놓고 섭씨 37도의 자당 가온 수조가 들어 있는 60mm 페트리 접시를 현미경의 한쪽에 놓습니다. 다음으로, 데울 빨대를 분리하고 상부 빨대 씰을 액체 수준 위로 올려 샘플의 신원을 확인합니다. 마요네즈 가위를 사용하여 내부 플러그 아래에 빨대를 고정하여 비타민 팁이 액체 질소에 잠기지 않도록 합니다.

품질 관리 예방 조치로 가위를 듀어 플라스크에 가위를 여러 번 세게 두드려 내부 빨대 측벽에서 팁을 제거하고 빨대를 입체경 표면 옆 또는 아래에서 수평 방향으로 주변 공기로 들어 올립니다. 라벨이 없는 빨대의 끝을 잡고 내부 플러그에서 빨대를 자릅니다. 그런 다음 따뜻한 목욕 접시 위로 빨대를 들어 올리고 팁이 완전히 돌출될 때까지 비타민 팁을 60도 각도로 욕조에 붓습니다.

플렉시펫의 바닥은 접시 측벽 위에 있어야 합니다. 5-10초 후 피펫 베이스를 마이크로캡 피펫팅 장치로 옮깁니다. 5분 타이머를 시작합니다.

현미경을 보는 동안 검지 손가락을 사용하여 전구 구멍을 막고 전구를 부드럽게 짜서 vit 팁에서 유리화된 배반포를 T1 세척제로 방출합니다. 배반포의 방출을 확인한 후 잔류 V3 용액과 거품을 양압으로 제거하고 내용물을 사용하지 않는 폐기 웰의 중앙으로 배출합니다. vit 팁을 sterber 피펫으로 옮기고 나머지 4분 동안 배아를 오일 아래의 두 번째 T1 방울로 이동합니다.

배양하는 동안 flexipet에 다음 용액을 미리 주입한 다음 3분 간격으로 T2, 3, 4 방울에 배반포를 희석합니다. 마지막으로, T5 방울의 배반포를 섭씨 37도 표면에서 5분 동안 평형을 이룬 후 인큐베이터로 되돌립니다. Modified Gardner Blastocyst Grading System은 영양막 세포의 탈장이 10% 미만인 것으로 간주하는 반면, 최대 50%의 탈장이 있는 배반포는 확장된 것으로 분류합니다.

50% 이상의 탈장을 보이는 배반포는 부화하는 것으로 간주됩니다. 입증된 동결 보존 및 온난화 방법을 사용하여 이식 전 유전자 검사 유무에 관계없이 주기 시작당 높은 수준의 출생률이 일관되게 달성되었습니다. 이러한 성공은 미리 선택된 유배성 배반포를 사용하여 눈에 띄게 더 높습니다.

실제로, 냉동 보존 주기만으로도 양호한 예후 환자 집단을 평가한 결과, 이러한 동결 배아 이식 데이터는 착상 및 출생률 모두에 대해 전국 평균보다 30% 이상 더 나은 성공률을 보여줍니다.미국에서 가장 높은 착상률 및 출생률 중 하나인 주로 단일 유전자 검사를 거친 유배체 유리화 배반포를 이식함으로써, 연령에 관계없이 질병 통제 센터(Center for Disease Control)가 보고한 다른 두 개의 저명한 불임 클리닉에 대한 최근 국가 통계 및 보조 생식 기술 협회(Society for Assisted Reproductive Technologies)에서 발표한 데이터와 비교해 볼 때 연령에 관계없이 달성되었습니다. MicroSecure 유리화는 기술적 용이성, 신뢰성 및 극저온 보안을 염두에 두고 개발된 새로운 무균 절차입니다. 이 간단한 비상업적 유리화 시스템은 유리화 장치에 대한 매우 효과적이고 저렴한 대안을 제공합니다.

개발 이후 MicroSecure 방법은 99.9% 이상의 배아 회수와 95% 이상의 완전한 배반포 생존을 보장했습니다. 이를 통해 지난 3년 동안 임상 실습을 거의 모든 냉동 보존 배아 전달 주기로 전환할 수 있었습니다. 우리는 여전히 신뢰할 수 있는 용접 씰과 뛰어난 예열 후 결과를 생성하기 위해 ionomeric 정액 빨대의 면 플러그 앞에 내부 씰을 포함하도록 절차를 효과적으로 수정했습니다.

오늘날 보조 생식 기술 산업에서 사용되는 다양한 장치 시스템이 있지만, MicroSecure 유리화(vitrification)와 같이 사용자 변동을 근본적으로 제거하고 최적화된 안전성을 제공할 수 있는 단순성과 기술적 반복성을 제공하는 장치는 없습니다.