종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

이 transduction protocol의 전반적인 목표는 환자 유래 이종이식(PDX)에 리포터 유전자를 안정적으로 도입하여 실험 및 자연 전이 모델에서 리포터 유전자를 쉽게 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 환자 유래 이종 이식편으로 인한 경피적 전이 정도와 같은 암 연구의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 이미징을 사용하여 라벨링된 PDX를 추적할 수 있어 광범위한 사후 조직학적 분석 없이 조직화된 특정 전이의 평가를 용이하게 할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜을 시연하는 것은 박사 후 연구원인 Jessica Finlay-Schultz로, 그는 유방암 환자 유래 이종이식편의 라벨에 이 프로토콜을 일상적으로 적용합니다. 무균 기술을 사용하여 메스를 사용하여 종양 주위의 피부를 자르는 것으로 시작합니다. 그런 다음 집게로 피부를 당기고 깨끗한 메스를 사용하여 피부와 종양을 분리한다.

종양이 완전히 노출되면 깨끗한 집게와 메스를 사용하여 조직을 얼음 위의 5ml의 세척 매체로 옮깁니다. 다음으로, 배지를 버리고 HEPES가 보충된 10ml의 HBSS로 종양을 두 번 세척합니다. 헹궈낸 종양을 미리 계량된 멸균된 60cm 조직 배양 플레이트에 넣고 플레이트의 무게를 측정하여 종양 질량을 추정합니다.

메스를 사용하여 종양을 반으로 자릅니다. 그런 다음 반쪽 중 하나에서 3mm 디스크를 자르고 디스크를 10% 포르말린에 24시간 동안 넣습니다. HEPES가 함유된 HBSS 200마이크로리터를 종양의 나머지 부분에 첨가하고 집게와 깨끗한 메스를 사용하여 조직을 가능한 가장 작은 조각으로 다집니다.

단편을 멸균된 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 종양 100mg당 항진균제 및 항생제가 보충된 최소 1ml의 소화 완충액을 추가합니다. 섭씨 30도에서 3시간 동안 분당 125-200회 회전한 후 35ml의 세척 매체를 첨가하여 소화를 중지하고 생성된 조직 슬러리를 70미크론 나일론 메쉬를 통해 새로운 50ml 원추형 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 실온에서 5분 동안 1ml의 적혈구 용해 완충액에 다시 현탁시킵니다.

용해가 끝나면 10ml의 세척 버퍼로 긴장도를 복원하고 40미크론 필터를 통해 세포를 변형시켜 덩어리를 제거합니다. 세포를 다시 원심분리하고 펠릿을 얼음 위의 세척 완충액 5ml에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 trypan blue exclusion으로 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.

계통과 Mel 세포 고갈을 사용하여 인간 상피 암 세포를 농축하려면 7번째 세포의 10배까지 새로운 5밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 옮기고 2밀리리터의 상피 농축 완충액을 세포에 추가합니다. 원심분리로 세포를 채취하고 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거합니다. 다음으로, 펠릿을 40마이크로리터의 얼음처럼 차가운 상피 농축 완충액에 다시 현탁시키고 7번째 세포에 10 곱하기 10당 10마이크로리터의 비오틴 항체 칵테일을 추가합니다.

부드러운 피펫팅으로 혼합하고 세포 용액을 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포를 1 곱하기 10에서 7번째 세포당 30마이크로리터의 상피 농축 완충액과 혼합합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 항생제 마이크로비즈를 부드럽게 혼합하여 첨가합니다.

섭씨 4도에서 15분 후, 3ml의 차가운 상피 농축 완충액으로 세포를 세척하고 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 펠릿을 얼음 위의 500마이크로리터의 상피 농축 완충액에 다시 현탁시키고 자기 분리기에 컬럼을 놓습니다. 0.5ml의 상피 농축 완충액으로 컬럼을 헹굽니다.

그리고 컬럼 아래에 새 폴리프로필렌 수집 튜브를 놓습니다. 그런 다음 레이블이 지정된 셀을 열 위에 천천히 추가합니다. 농축, 라벨링되지 않은, 계통 음성, 종양 세포 분획이 풍부한 것을 수집한 다음 500마이크로리터의 신선한 상피 농축 완충액으로 3개의 컬럼 헹굼

종양 세포를 형질도입하기 위해 분리된 세포를 원심분리하여 2ml의 유방권 배지에서 재현탁합니다. 계수 후, 세포를 다시 원심 분리하고 20 마이크로 리터의 폴리 브레렌을 보충 한 2 밀리리터의 유방 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 초저 접착력 6웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 5번째 생존 가능한 종양 세포를 10배 2회 플레이트화하고 10의 감염 다중도에서 세포에 렌티바이러스 입자를 첨가합니다.

플레이트를 소용돌이쳐 바이러스와 세포를 혼합합니다. 그리고 최대 96시간 동안 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 공동 배양을 배양합니다. 처음 24시간 후에 500마이크로리터의 신선한 유방권 배지를 추가합니다.

세포의 10% 이상이 GFP 양성인 경우, 적어도 하나의 웰에서 형질전환 세포를 얼음 위의 15ml 원추형 튜브로 옮기고 1ml의 유방권 배지로 웰을 세척합니다. 세척액을 세포와 함께 풀링하고 종양 세포를 10ml의 HBSS와 HEPES로 원심분리합니다. 마지막으로, 얼음 위에 50마이크로리터의 기저 매트릭스 추출물에 세포를 다시 현탁시킵니다.

그리고 재이식을 위해 내장된 세포를 0.5ml 인슐린 주사기에 넣습니다. 일부 high titer 바이알 벡터는 감염 후 24시간 이내에 in vitro에서 transduction efficiency를 추정할 수 있는 형광 마커를 발현합니다. 대부분의 PDX에서 GFP 발현은 감염 후 최대 72시간까지 지연됩니다.

이 시점에서 세포 응집체의 형성이 일반적으로 관찰됩니다. 세포외 기질 현탁액 및 재이식 후, 표지된 종양 세포는 생물 발광 또는 형광을 사용하여 추적할 수 있는 종양을 재생합니다. 성공적으로 라벨링된 PDX는 형질도입 후 1세대에서 거의 100% GFP 양성이 되며 후속 계대에서도 그대로 유지됩니다.

그러나 일부 PDX는 GFP 양성 세포의 고르지 못한 분포를 나타내며 이는 차선의 in vitro transduction을 나타냅니다. 면역조직화학성 종양 조직 염색은 표피 성장 인자 수용체 및 범 사이토케라틴과 같은 중요 마커의 발현이 여러 번의 계대 및 재이식 후에도 보존됨을 보여줍니다. 전이의 실험적 모델은 전이성 연쇄 반응에서 장기 영양성 및 장기 집락화 단계를 연구하는 것에 대한 대안을 제공합니다.

실제로, 마우스 한 마리당 5번째 세포에 2.5배의 10으로 주입된 형질주입 PDX는 in vivo에서 루시퍼라제 이미징으로 쉽게 식별되는 간에 전이를 형성합니다. 그리고 폐에서는 생체 외 형광 현미경으로 시각화할 수 있습니다. 마스터하면 PDX의 해리 및 라벨링에 약 4시간이 걸립니다.

종양의 실제 확장은 종양과 사용하는 시스템에 따라 8주에서 12주가 소요될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 생체 내에서 transfection 효율성과 종양 성장을 모두 모니터링할 수 있도록 reporter 유전자가 있는 high titer 바이러스를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 생체 내 전이 연구와 같은 다른 방법을 수행하여 종양 진행, 전이 및 치료에 대한 반응에 대한 다른 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술은 유방암 연구자들이 종양 이질성을 더 잘 나타내는 새로운 PDX 모델을 사용하여 종양 진행의 여러 측면을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 해리된 종양 세포를 고역가 렌티바이러스 입자로 라벨링하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이를 통해 생체 내에서 종양 세포를 추적할 수 있을 뿐만 아니라 잠재적으로 관심 유전자의 발현을 조작할 수 있습니다.

렌티바이러스 입자를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 항상 적절한 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.