Name: 종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 환자 유래 이종 이식(PDX)에 기자 유전자를 안정적으로 도입하여 종양 성장과 전이를 실시간 추적하는 방법입니다. 이 기술은 생체 내 영상을 통해 암 연구의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

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저자는이 연구에서 사용 된 높은 역가의 렌티 바이러스 생산을위한 파지 - EF1aL-을 DsRed-UBC-GFP-W 벡터 및 프로토콜을 제공하기 위해 보스턴 대학에서 박사 대럴 Kotton 감사합니다. 이 작품은 .NCI P30CA046934 센터 보조금은 생체 내 이미징에서 지원 DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG 번호 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC)와 R01 CA140985 (CAS)에 의해 투자되었다 조직 문화는 콜로라도 AMC의 대학에서 코어.

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<li>Lawson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+a+stem-cell+program+in+human+metastatic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells.</a> Nature. 526 (7571), 131-135 (2015).</li>
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프로토콜 내에서 중요한 단계 : 시험 관내 형질 도입 동안 매체 조성물의 신중한 제어를 허용 높은 역가 렌티 바이러스 입자의 사용은 (&gt; 10 8 TU / ㎖),이 프로토콜의 성공에있어 중요한 단계이다. 고 역가 바이러스 입자의 제조를위한 다양한 방법이도 18, 19를 설명 하였지만; 이 프로토콜에서 상세히 설명한 바와 같이 제조 된 렌티 바이러스 입자를 사용 <a href="http://www.kottonlab.com">www.kottonlab.com를</a> . 암 세포의 종양의 소화와 분해를위한 부드러운 방법은 성공적인 라벨과 라벨이 종양의 성장을 위해 중요하다. 삼시간 넘어 소화 시간을 연장 또는 37 ° C의 분해 온도를 증가시키는 것은 해리 세포의 수를 증가하지만, 대부분의 종양 세포 생존 및 라벨의 성공을 감소시킨다. <s...

외과 적 절제 종양 샘플은 직접 면역 감염된 마우스에 접목되어 환자 유래의 종양 이종 이식 (PDXs)의 개발, 표준 셀 라인 이종 이식 모델에 비해 여러 가지 장점을 제공하며, 암 연구 1,2-에서 큰 진보를 나타낸다. PDXs 유지하고 제 1 통로에서 성장한 종양의 유전 적 및 생물학적 특성에 최소한의 변경으로 연속적인 통로로 확장 될 수있다; 보다 정확하게 인간 암세포 유래의 이종 3-8보다 종양 이질성을 반영한다. 이 모델은 현재 광범위하게 신약 개발 6,11의 전임상 플랫폼으로 암 생물학 4,12 연구를위한 실험 도구로, 암 치료제 9,10 개인화을위한 플랫폼으로 사용된다. 대부분의 PDXs는 이식 및 실행 가능하게 캘리퍼스를 사용하여 시간이 지남에 따라 종양의 성장을 측정 할 수있는 피하 전파됩니다. 하나전이성 질환은 PDXs를 사용하여 모델링하는 것이 더 어렵다. 특히 유방암, 다른 장기로 전이 용량 이종는 3,5,13 설명되었지만, 전이성 사이트 자발 보급의 빈도는 매우 낮다. 보고 된 경우, 전이성 부담의 식별 및 정량은 사후 표적 기관의 힘든 조직 학적 검사에 의존하고있다. 생물 발광 (루시퍼 라제, 배낭) 또는 형광을 발현하는 암세포는 (녹색 형광 단백질 GFP) 유전자 리포터는 일반적으로 뇌, 폐, 뼈, 간 심내 후 꼬리 정맥 intrafemoral 비장 주입 유방암 전이 실험 모델에서 사용 14-16. 이 모델은 기본 종양에서 보급을 우회하는 동안, 그들은 장기 친 화성 및 전이성 식민지의 메커니즘을 연구 할 가치가있다. 그러나, 기본 환자 종양 및 PDXs에서 파생 된 세포는 낮은 형질 전환 또는 전달 속도 날기를 가질 수있다g 표준 절차. 하나의 대안은 종래의 조직 배양 프로토콜을 사용하여 표시 할 수 체외 (17)에 PDX 유래 세포주를 확립하는 것이다. 이 방법은 그러나, 세포주 유도가 어렵고, 세포의 표현형을 변경할 수있는 가장 PDXs를 라벨에 적합하지 않다. 여기에서 우리는 생체 내 이미징에 적합한 렌티 바이러스 벡터와 PDX-해리 종양 세포의 전달을위한 프로토콜을 제시한다. 또, 면역 쥐에서 해리 루크-GFP 표지 PDX 세포의 심장 내 주사를 사용하여 실험 전이를 설명한다. 리포터 유전자를 발현하는 렌티 바이러스 PDX-해리 organoids의 전달을위한 기본 프로토콜은 이전에 18을 설명 하였다. 현재의 프로토콜에서는 인간 종양 세포에 대한 농축 및 100 % 전달 효율 근처 얻을뿐만 아니라 실험 유방암 검출 용 표지 PDXs 사용하기위한 추가의 방법을 설명전이. 이 프로토콜은 여러 암 다양한 발광 및 형광 마커 PDXs의 종류뿐만 아니라 유전자 발현 (관심의 유전자 즉, shRNA를 최저)의 변조를 라벨에 대해 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Hyclone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco/Thermo Fisher</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>항진균 항생제</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AM-105-500</td><td>소화 버퍼</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 레드 Ca2+/Mg2+ 무료</td><td>Hyclone</td><td>SH30031.02</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex</td><td>Cultrex</td><td>3433-005-01</td><td>지하 매트릭스 추출물 (BME)</td></tr><tr><td>30 &#176; C 쉐이커</td><td>NewBrunswick Scientific CO. INC</td><td>시리즈 25 인큐베이터 쉐이커</td><td></td></tr><tr><td>70 &#956; m 필터</td><td>Falcon</td><td>7352350</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Fisher</td><td>22079690</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidine 소독제</td><td>Durvet&nbsp;</td><td>NDC# 30798-624-35</td><td></td></tr><tr><td>레드 블러드&nbsp; 세포 용해 시약</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Neuraminidase</td><td>Sigma</td><td>N7885-1UN</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (CD326+) 마이크로비즈*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-061-101</td><td></td></tr><tr><td>리니지 세포 고갈 키트, 마우스*</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 분리기&nbsp;</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>Mini MACS 마그네틱 스탠드</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MS 컬럼</td><td>Miltenyil Biotec</td><td>130-042-201</td><td>MS 또는 LS 컬럼을 사용할 수 있으며, 셀의 수에 맞게 조정할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Illumatool 튜너블 라이트 시스템</td><td>Lightools 연구</td><td>다양한</td><td>생체 내 형광 이미징</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS200 이미징 장치</td><td>Xenogen</td><td>다양한</td><td>생체 내 발광 이미징</td></tr><tr><td>Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody</td><td>DAKO</td><td>M0821</td><td>Pan-cytokeratin&nbsp;</td></tr><tr><td>표피 성장 인자 수용체 항체</td><td>세포 신호</td><td>4267S</td><td>EGFR</td></tr></tbody></table>

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

종양 생물학 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위해 전임상 모델을 사용하는 것은 암 연구의 핵심입니다. 오랫동안 확립된 인간 세포주와 많은 형질전환 마우스 모델은 종종 인간 악성 종양의 주요 측면을 요약하지 못합니다. 따라서 환자의 종양과 전이의 이질성을 더 잘 나타내는 대체 모델이 개발되고 있습니다. 외과적으로 절제된 종양 샘플을 면역이 저하된 마우스에 이식하는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델은 여러 세대에 걸쳐 이식할 수 있고 인간 암 세포주에서 유래한 이종이식편보다 종양 이질성을 더 효율적으로 반영하기 때문에 매력적인 대안이 되었습니다. PDX 사용의 한계는 추적 가능한 리포터를 도입하거나 유전자 발현을 조작하기 위해 transfection하거나 transduction하기 어렵다는 것입니다. 현재 프로토콜은 높은 형질도입 효율로 PDX에서 해리된 종양 세포를 형질도입하는 방법과 유방암 전이의 실험적 모델에 표지된 PDX를 사용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 전이성 연쇄 반응의 장기 집락화 과정을 연구하기 위해 실험적 전이 모델에서 표지된 PDX를 사용하는 것을 보여줍니다. 다른 장기로의 전이는 살아있는 동물의 생물 발광 이미징 또는 절제 및 절제 장기에서 절제 중 GFP 발현을 사용하여 쉽게 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이러한 방법은 여러 유형의 PDX의 사용을 전이 연구로 확장할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

이 방법은 높은 역가 렌티 바이러스 벡터 pSIH1-H1-copGFP-T2A-순수하지 않아 및 파지 - EF1aL - 루시 페라 - UBC-GFP-W를 사용하여 PDX-해리 유방암 세포의 전달에 대해 설명합니다. 이 벡터는, 감염 (그림 1a) 후 빠르면 24 시간을 시험관 내에서 전달의 효율성을 추정 허용 형광 마커를 표현한다. 가장 PDXs 들어, GFP 발현 세포 응집체의 형성은 일반적으로 관찰되는이 시점에서, 감염 (도 1b) 후 72 시간까지 지연 될 것이다. 형질 도입은 또는 조에서 PDX-분해 셀 (린 + 세포 고갈,도 1a를 이용하여, IE) 인간 암세포 농축 후에 얻어 질 수있다 (도 1B). 종양의 상피 세포의 보충은 매우 혈관이 종양 마우스 혈액 세포는 생존 세포의 수의 상당한 비율을 나타낸다이었다...

우리는 녹색 형광 단백질과 루시 페라 제 기자를 발현하는 렌티 바이러스 입자 환자 유래의 이종 이식 (PDXs)의 안정적인 표시하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 주 사이트 PDXs의 성장을 추적뿐만 아니라, 생체 내 이미징 시스템에서 사용 자발 실험 전이 검출을 허용한다.

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

본 형질전환 프로토콜의 전반적인 목표는 환자 유래 이식편(patient-derived xenografts, PDX)에 리포터 유전자를 안정적으로 도입하여, 실험적 및 자연 발생적 전이 모델에서의 활용을 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 환자 유래 이식편으로부터의 장외 전이 범위와 같은 암 연구의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표지된 PDX를 생체 내 이미징(in vivo imaging)을 통해 추적할 수 있어, 사후의 광범위한 조직학적 분석 없이도 체계적이고 특이적인 전이 평가가 가능하다는 점입니다.이 프로토콜의 시연은 유방암 환자 유래 이종이식편(xenograft)의 표지에 이 프로토콜을 정기적으로 적용하는 박사후 연구원 Jessica Finlay-Schultz가 진행합니다. 무균 조작법을 사용하여, 먼저 메스로 종양 주변의 피부를 절개합니다. 그런 다음 핀셋으로 피부를 당기고 깨끗한 메스를 사용하여 피부와 종양을 분리합니다.종양이 완전히 노출되면, 깨끗한 포셉과 메스를 사용하여 조직을 얼음 위에 놓인 5 milliliters의 세척 배지로 옮깁니다. 다음으로, 배지를 버리고 HEPES가 첨가된 10 milliliters의 HBSS로 종양을 2회 세척합니다. 세척된 종양을 멸균 처리되어 미리 무게를 잰 60 centimeter 조직 배양 플레이트에 넣고, 플레이트의 무게를 측정하여 종양의 질량을 추정합니다.메스를 사용하여 종양을 절반으로 자릅니다. 그런 다음 절반 중 하나에서 3 mm 크기의 디스크를 잘라내어 10% formalin에 24시간 동안 담급니다. 나머지 종양 조직에 HEPES가 포함된 HBSS 200 µL를 추가하고, 핀셋과 깨끗한 메스를 사용하여 조직을 가능한 한 가장 작은 조각으로 잘게 다집니다.조각들을 멸균된 50 milliliter 원심 분리 튜브로 옮기고, 종양 100 milligrams당 항진균제와 항생제가 첨가된 소화 완충액을 최소 1 milliliter 추가합니다. 30 °C에서 분당 125~200회 회전하며 3시간 동안 반응시킨 후, 소화 과정을 중단시키기 위해 세척 배지 35 milliliters를 추가하고, 결과물인 조직 슬러리를 70 micron 나일론 메쉬를 통해 새로운 50 milliliter 원심 분리 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 원심 분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 1 milliliter의 적혈구 용

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연구

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미만성 형광 tomography는 잠복기로 높은 걸쳐 상대적으로 저렴한 비용과 잠재적인 접근 방식을...

암 생체 현지화위한 작은 동물의 계산된 Tomography 주 도형 시간 도메인 미만성 형광 Tomography

다음 비디오는 녹색 형광 단백질을 발현하는 렌티바이러스와 루시페라제 리포터를 in vitro에 종양 세포에 도입하는 데 사용되는 PDX 종양 세포 라벨링(환자 유래 이종 이식편)으로의 형질도입 기술을 설명합니다.

PDX 종양 세포 표지를 위한 형질도입: In vitro에서 종양 세포에 형광 마커를 발현하는 렌티바이러스 도입

이 원고는 순환 종양 세포(CTC)에서 전립선암 환자 유래 이종이식편(PDX)을 생성하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. CTC에서 PDX 모델을 생성하면 전립선암을 연구하기 위한 대체 실험 모델을 제공합니다. 가장 흔하게 진단되는 종양이며 남성의 암으로 인한 사망 원인이 빈번합니다.

전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

난소암 전이는 수많은 미만성 복강 내 병변을 특징으로 하기 때문에 종양 부담을 시각적으로 정확하게 정량화하는 것이 어렵습니다.  여기에서는 적색 형광 단백질(RFP) 표지 종양 세포 및 광학 이미징을 사용하여 전이성 종양 부담의 현장 및 생체 외 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

복강 내 난소 암 전이의 정량

여기에서는 암 전이에서 폐포 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델과 접근 방식을 설명합니다. 전이에서 이러한 세포의 역할을 입증하기 위해 클로드로네이트 리포좀을 사용한 폐포 대식세포의 고갈과 함께 유방암의 syngeneic(4T1) 모델을 사용했습니다.

유방암 전이에 폐포 대 식세포의 역할을 공부

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

여기, 우리는 암에 대 한 신뢰할 수 있는 전 임상 모델을 만드는 생물학 관련 사이트에서 초음파 유도 신경 (NB) 및 Ewing의 육 (ES) 세포의 주입을 활용 (설립 세포 및 종양 환자에서 파생 된 셀) 프로토콜 제시 연구입니다.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

이 작업은 녹색 형광 단백질 및 생물 발광 신호의 검출뿐만 아니라 정량적 분자 검출 기술의 통합에 의해 종양 하중을 정확하게 평가하기 위한 고급 프로토콜을 미리 설정합니다.

정형외 유방암 모델을 사용하여 삼중 음성 유방암 을 연구

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

이 프로토콜은 마우스에서 유방암 환자 유래 이종이식편의 정소성 이식을 위한 효율적인 비수술적 방법을 설명합니다. 이 기술은 효소 종양 해리 후 유방 지방 패드에 직접 주입하여 고처리량 이식을 가능하게 합니다. 포괄적인 검증은 모델 충실도를 보장하여 다양한 유방암 하위 유형에 대한 엄격한 연구를 촉진합니다.

High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-derived Xenografts(유방암 환자 유래 이종이식편의 High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of breast Cancer Patient-derived Xenografts)

배우세요 환자 유래 이종 이식(PDX)에 기자 유전자를 안정적으로 도입하여 종양 성장과 전이를 실시간 추적하는 방법입니다. 이 기술은 생체 내 영상을 통해 암 연구의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

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