를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석 체외 시스템

이 실험의 전반적인 목표는 주변 공기에서 추출한 미립자 물질에 세포의 노출로 인해 유발되는 염색체 손상을 감지하는 것입니다. 이 방법은 미립자 물질 분야에서 한 가지 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 즉, 미립자 물질 노출이 염색체 손상을 유발합니까? 이 기술의 가장 큰 장점은 유전 물질에 유도된 손상을 직접 시각화할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 입자를 수집 및 분석한 후 배양 시작 최소 30분 전에 섭씨 37도의 수조에서 완전 성장 배지, 0.25% 트립신 및 PBS를 가온하여 입자 노출을 수행합니다. 원료 264.7 세포를 세척 한 후 접시에 따뜻한 트립신 용액 1ml를 넣고 긁어서 조직 배양 용기 바닥에서 세포를 제거합니다. 그런 다음 세포를 수집하고 반복적인 피펫팅을 통해 단일 세포 현탁액을 만듭니다.

트리판 블루를 사용하여 세포 수를 세고 예열된 완전한 배지를 사용하여 100mm 조직 배양 접시에 제곱센티미터당 8000의 밀도로 플레이트를 만듭니다. 다음 50의 마지막 농도를 위한 10 밀리리터에, 밀리리터 당 000의 세포를 조정하기 위하여 완전한 매체를 이용하십시오. 세포를 섭씨 37도에서 배양하고 24시간 동안 5%CO2에서 세포를 배양하여 부착할 수 있도록 합니다.

생물 안전 캐비닛에서 멸균 PBS를 사용하여 여과된 입자를 밀리리터당 0.5mg의 농도로 희석하여 밀리리터당 5마이크로그램 처리 용량의 경우 및 밀리리터당 50마이크로그램의 처리 용량에 대해 희석합니다. 미립자 물질이 있는 세포를 처리하려면 배양된 세포를 10배 배율로 현미경으로 검사하여 세포 성장, 세포 형태, 배양 상태 및 오염 여부를 확인합니다. 이 단계에서 세포는 최소 30% 이상 융합되어야 합니다.

멸균 피펫을 사용하여 배지를 무균 흡입하고 섭씨 37도 PBS 2밀리리터를 사용하여 배양 용기를 두 번 세척합니다. 미리 결정된 용량의 미립자 물질을 새로운 배지로 추가하고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 배양물을 배양하여 동시 유전독성 및 후성유전독성 분석에 사용되는 노출과 병행합니다. 중기(metaphase)에서 세포를 정지시키기 위해, 세포를 세척한 후 2밀리리터의 예열된 배지와 1밀리리터당 5마이크로리터의 콜세미드 용액을 배양액에 첨가하고 섭씨 37도, 5%CO2에서 2시간 동안 배양합니다.

배양 후 배지를 완전히 제거하고 따뜻한 PBS를 사용하여 세포를 두 번 씻습니다. 그런 다음 트립신 용액을 넣고 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리하고 PBS 10ml를 첨가하여 트립신을 비활성화합니다.

그런 다음 세포를 최소 10회 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 만들고 세포를 15ml 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 스윙 아웃 원심분리기에 넣고 세포 현탁액을 400배 g과 실온에서 5분 동안 회전시킵니다. 저장성 치료를 수행하려면 세포 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 상등액을 제거하고 약 0.5ml의 PBS를 남겨둡니다.

세포 펠릿을 부드럽게 부수고 P200 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 그런 다음 예열 된 염화칼륨 용액 4 ml를 넣고 부드럽게 흔들어 떨어 뜨립니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다.

저장성 치료 후 튜브에 동일한 양의 고정액을 첨가하여 세포를 고정하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 실온에서 400배의 g으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 이 단계에서 세포 펠릿은 크기가 커지고 색이 희끄무레해지고 더 잘 보입니다.

상층액을 제거합니다. 4ml의 새 정착제를 넣고 튜브를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음 4ml의 고정제를 사용하여 세포를 두 번 더 세척합니다.

유리 슬라이드를 10% 액체 세제에 30분 동안 완전히 담그십시오. 그런 다음 흐르는 차가운 수돗물로 슬라이드를 30분 동안 철저히 헹굽니다. 증류수를 사용하여 슬라이드를 세 번 헹구어 세제를 완전히 제거합니다.

그런 다음 증류수에 담그고 슬라이드를 냉장고에 밤새 보관하십시오. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 냉장 습식 슬라이드에 떨어뜨리고 실온에서 밤새 건조시킵니다. 샘플을 염색하고 장착하려면 giemsa 염색 용액의 한 부분과 PBS의 한 부분을 혼합하여 50밀리미터의 giemsa 염색 용액을 준비하고 코플린 항아리에 붓습니다.

슬라이드를 염색 용액에 20분 동안 담근 다음 슬라이드를 증류수로 헹구어 과도한 얼룩을 제거하고 즉시 헤어 드라이어를 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다. 슬라이드를 실온에서 밤새 그대로 두십시오. 다음 날 아침, 슬라이드에 장착 매체 한 방울을 떨어뜨립니다.

커버 슬립을 위에 부드럽게 놓고 장착 매체가 슬라이드 위로 천천히 퍼지도록 합니다. 그런 다음 종이 타월을 사용하여 여분의 매체를 제거합니다. 마지막으로, 100x 배율의 명시야 현미경을 사용하여 중기 확산의 구조적 염색체 이상을 검사합니다.

이 이미지는 정상적인 마우스 중기 확산이 40개의 비중심 염색체를 갖는다는 것을 보여줍니다. 미립자 물질로 처리하면 염색체 절단, 편심성 단편, 고리 염색체, 이심성 염색체, 이중 분, 로버트슨 전좌 및 내복제와 같은 다양한 염색체 이상이 유발됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 증식하는 세포만 사용해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 M-FISH 및 SKY와 같은 다른 방법을 사용하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 염색체 간, 안정적인 수차가 존재하는지 여부와 같습니다. 주의사항과 발암 물질, 그리고 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 하는 장갑 착용과 같은 예방 조치를 잊지 마십시오.