Name: 펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 학습하세요 펩타이드 기반 유전자 및 단백질 전달법으로 식물 세포벽과 세포소기관 장벽을 효율적으로 통과시키는 방법을. Arabidopsis thaliana를 이용한 주사기 보조 형질전환 기술로 식물 생명공학 연구에 혁신적인 도구를 제공합니다.

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저자는 일본 과학 기술 청 탐색 적 연구 고급 기술에 대한 (JST-ERATO), 신 에너지 · 산업 기술 종합 개발기구 (NEDO) 및 크로스 장관급 전략 혁신 촉진 프로그램 (SIP), 일본에서 자금을 인정하고 싶습니다 .

펩타이드 기반 정립 1. 준비 <ol><li> 다음 각 펩티드 원액을 준비한다 (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖ 또는 800 ㎚), Cytcox- (KH) (9) (1 ㎎ / ㎖), BP100 (1 ㎎ / ㎖) 및 (BP100) 2 K 8 (70 μM). 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 각각 펩티드의 요구량을 달아 펩티드를 용해 멸균 된 초순수를 추가한다. 맑은 용액이 얻어 질 때까지 반복 피펫 팅하여 잘 혼합한다. </li><li> 증폭 플라스미드 DNA (pDNA에), 이중 가닥 DNA (dsDNA) 및 표준 분자 방법에 따라 이중 가닥 RNA (dsRNA를)를 정화. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에서, 1 ㎎ / ㎖ (의 pDNA 및 dsDNA) 또는 400 nm의 (dsRNA를)의 농도 재고 솔루션을합니다. </li><li> 탄산나트륨 용액 (0.1 M, pH가 9) 1 ml의 단백질 (예., 알코올 탈수소 효소, ADH) 분말 1 mg을 용해시켜 7 μM의 농도로 단백질 원액을 준비한다. F와 단백질 라벨표준 프로토콜에 따라 같은 로다 민 B (RHB)와 같은 luorescent 프로브는 세포로 전달되는 단백질의 미세한 시각화를 가능하게합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 각각의 성분을 결합한다. <ol><li> 펩티드 제제의 pDNA가 세포질 타겟팅, pDNA를 (1 ㎎ / ㎖) 20 μL를 6.4 μL (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 773.6 μL를 추가한다. 핵 식 (P35S-RLuc-TNOS, 표 1)에 대한 설계의 pDNA 구문을 사용합니다. </li><li> 펩티드의 pDNA 제형은 미토콘드리아 타겟팅, pDNA를 (1 ㎎ / ㎖) 20 μL에 Cytcox- 6.6 μL (KH) (9) (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정하고 BP100 2.4 μL (1 ㎎ / ㎖)을 추가 할 수있다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정화되도록6 또 다른 15 분 동안 C. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 771 μL를 추가한다. 미토콘드리아 식 (: rluc, 표 1 pDONR-COX2)에 대한 설계의 pDNA 구문을 사용합니다. </li><li> 펩티드 dsDNA 제형, dsDNA (1 ㎎ / ㎖) 8 μL를 5.1 μL (KH) 9 -BP100 (1 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 피펫 팅하여 잘 혼합한다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 786.9 μL를 추가한다. </li><li> 펩타이드 dsRNA를 제제를 들어, dsRNA를 (400 ㎚)의 50 μL에 50 μL (KH) 9 -BP100 (800 nm의)를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 희석 용액의 RNA 분해 효소가없는 물을 700 μL를 추가한다. </li><li> 펩티드 단백질 제제를 들어, ADH의 16 μL (7 μM)에 (BP100)이 K 8 (70 μM)의 16 μl를 추가하고 혼합잘 피펫으로. 혼합물을 25 ℃에서 15 분 동안 안정 할 수있다. 800 μL의 최종 부피로 용액을 희석하여 멸균 초순수 768 μL를 추가한다. </li></ol></li><li> 제형은 25 ° C에서 15 분 동안 안정화 할 수 있습니다. </li></ol> 펩타이드 기반 정립 2. 특성 <ol><li> 동적 광산란 (DLS) 분석을위한 큐벳에 각 용액 (800 μL)를 옮긴다. 173 °의 산란 검출 각도 25 ° C에서 633 nm의 He-Ne 레이저를 사용하는 제타 nanosizer 형성된 복합체의 수력 학적 지름 및 다 분산도 지수를 결정한다. </li><li> 다음 크기 측정은 25 ° C에서 유전 상수, 굴절률과 물의 점도 디폴트 파라미터에서 제타 전위 측정 접힌 모세관 셀에 각각의 용액 (800 μL)를 옮긴다. </li><li> (AFM을 원자 힘 현미경으로 DLS 분석에 사용 착체 용액의 소량을 관찰). 운모 시트의 갓 노출 절단 표면에 예금 복잡한 용액 10 μl를하고 덮여 플라스틱 페트리 접시에 건조 하룻밤을 방송하기 위해 운모를 둡니다. </li><li> 모드 27,28 태핑에 1.3 N / m의 스프링 상수 실리콘 캔틸레버를 사용하여 25 ℃에서 공기 중에서 복합체의 화상을 취득. </li></ol> 식물 잎의 3. 침투 <ol><li> 삼주 된 토양에서 재배 한 식물 (애기 장대 (24), 담배 속의 benthamiana 24 포플러 26)를 사용합니다. 유전자 발현 또는 단백질 전달의 정량 세중의 역할을 최소한 3 잎을 형질. </li><li> 한 잎의 형질 복잡한 용액 100 μL와 함께 1 ml의 바늘 플라스틱 주사기를로드합니다. 잎의 배축 표면에 주사기의 끝을 놓습니다. </li><li> 약간 잎에 대한 주사기 팁을 누르고 난과 반대 압력을 행사하면서 천천히 주사기의 플런저를 우울반대편에서 라텍스 장갑을 낀 손의 ndex 손가락. 성공적인 침투는 잎에서 물에 젖은 영역의 확산을 관찰 할 수있다. 식별의 용이성에 대한 침투 잎 레이블. </li><li> 펩티드의 pDNA (12 시간), 펩티드 dsDNA (12 시간), 펩타이드 dsRNA를 가진 침투 다음과 같은 최적화 된 기간에 대한 형질 전환 잎을 품어 - 다음과 같은 조건에서 (구 48 시간)과 펩티드 단백질 (6 시간) 공식 : 16 시간 빛 / N.의 benthamiana 29 ° C에서 A. 장대와 포플러, 또는 24 시간 일정한 빛에 대한 22 ° C에서 8 시간의 어둠. </li></ol> 형질 전환 효율 4. 평가 <ol><li> 작은 식물의 전체 형질 전환 된 잎 (예., A. 장대) 또는 더 큰 식물에 대한 침투 영역의 1cm 2 절을 절제 (예., N. benthamiana). </li><li> 레 닐라 루시퍼 라제 (Rluc) 리포터 벡터를 이용하여 형질 전환 실험의 경우, transfectio를 결정N 효율 Rluc 정량적 분석 키트를 사용. <ol><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 각을 절제 잎 또는 잎 부분을 놓습니다. 튜브 당 1 × Rluc 분석 용해 버퍼 100 μl를 추가합니다. 동일한 방식으로, 비 - 형질 제어 잎 (삼중)의 용 해물을 준비한다. </li><li> 호모 유봉을 사용하여 리프 갈기 6, 25 ° C에서 얻어진 용 해물을 부화 - 10 시간. </li><li> 1 분에 대한의 microcentrifuge에서 12,470 × g에서 해물을 원심 분리기. 전송 (20)를 96 웰 마이크로 플레이트의 웰의 분해물의 μL 및 제조자의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도의 정량 남아있는 볼륨을 사용한다. </li><li> 우물에 1 × Rluc 분석 기판합니다 (Rluc 분석 버퍼를 사용하여 희석)의 100 μl를 추가하고 천천히 피펫으로 혼합한다. 멀티 모드 마이크로 플레이트 리더의 마이크로 플레이트를 놓고 측정을 시작합니다. </li><li> 배경 발광을 빼기 (무의 의미N-형질 각 실험 시료의 발광에서) 세중. 단백질의 양 (mg)을 포토 루미 네 선스의 비율 (상대 광 단위, RLU)을 계산한다. </li></ol></li><li> 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 벡터 또는 형광 표지 된 단백질을 이용하여 형질 전환 실험 (예., ADH-RHB)는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광을 관찰한다. <ol><li> 인 등의 단면 한 잎을 사용할 수 있지만, 전체 잎 (공기층의 제거를 돕기 위해)의 모서리를 잘라. 10 ML의 주사기에서 플런저를 제거하고 주사기의 각을 절제 잎 또는 잎 섹션을 배치합니다. </li><li> 플런저를 교체하고 잎을 분쇄하지 않고 주사기의 바닥에 부드럽게 밀어 넣습니다. 이 반 정도 채워질 때까지 주사기에 물을 그립니다. </li><li> 위쪽으로 주사기를 지정하고 팁을 통해 주사기에서 공기를 제거하기 위해 플런저에 밀어 넣습니다. 레아에서 공기를 추방 아래로 천천히 플런저를 주사기의 끝을 덮고 당겨에프. 잎이 반투명 나타날 때까지이 과정을 여러 번 반복합니다. </li><li> 접착 테이프 현미경 슬라이드의 표면을 커버한다. 블레이드를 사용하여 잎 샘플을 수용 할 수있을만큼 큰 테이프에 사각형 영역을 잘라하고, 시료 챔버를 만들 집게와 테이프의 사각형 조각을 벗겨. 테이프 슬라이드와 커버 슬립 사이에 스페이서 역할을합니다. </li><li> 위쪽으로 향하게 배축 표면과 챔버에 잎을 넣고 물을 나머지 챔버 영역을 채 웁니다. 유리 커버 슬립으로 챔버 내의 리프 밀봉 접착 테이프로 커버 슬립의 가장자리를 고정. </li><li> 40 배 목표에서 공 초점 레이저 주사 현미경 또는 63X 물 침지 목표를 사용하여 잎 샘플을 검사합니다. GFP 또는 RHB 형광이 각각 488 내지 555 나노 미터의 여기 파장에서 가시화 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

경험적으로 확인 된 프로토콜 내에서 중요한 단계를 설명합니다. 주사기 침투함으로써 펩티드 제제가 기공을 통해 식물 잎 내부의 공극 내로 도입된다. 식물에 충분한 물과 점등 기간 동안 제공 기공 개구 예.에 이바지하는 조건 하에서 때 용액의 최대 흡수를 보장하기 위해, 함침 공정이 수행되어야한다. (미토콘드리아 타겟 DNA 전달을위한) 두 개의 펩티드의 조합을 포함하는 제제에 대한 형질 전환 복합체의 제조에 관해서는,로, 각 성분의 첨가 순서는 중요하고 반전 할 수 없습니다. 절차 많은 그럴듯한 수정이 있습니다. 식물 세포의 침윤을위한 또 다른 옵션을 포함한 전체 식물 및 / 또는 부분적인 조직으로 복잡한 솔루션을 도입 할 수있는 진공 함침의 사용이며혀끝의 분열 조직. 이러한 대안적인 절차는 모종 형질 감염 용액에 침지하고, 진공에 의해 생성 된 압력에 기초하여, 펩티드화물 착물은 기공을 통해 식물 세포 (Yoshizumi, T., 미발표 데이타)로 강제된다. 동물 세포를 이용한 연구 결과에 기초하여 일시적인 유전자 발현이 높은 DNA 농도 29-31에 따라 증가하는 것으로 나타났다. DNA에 펩티드의 비율이 단지의 생물 리 학적 특성 (크기, 표면 전하)에 영향을주의하는 형질 전환 효율에 영향을 미친다 (그림 4), 중요하다 따라서, 최적의 비율도 증가 DNA 농도가 유지되어야한다. 유전자 / 단백질 전달체로서 펩타이드를 사용의 주요 이점 중 하나는 시퀀스는 원하는 기능을 수행하기 위해 튜닝 의무가 있다는 것이다. 예를 들어, 담체 펩티드 미토콘드리아 타겟팅 도메인이 스터드에 기재된Y는 이들 소기관에 현지화 엽록체 또는 퍼 옥시 타겟팅 시퀀스로 대체 될 수있다. 엽록체 형질 전환은 바이오리 스틱스 (biolistics) 32 ~ 34를 사용하여 여러 식물에서 가능하지만, 아그로 박테 리움이나 유전자 총 방법도는 핵 (표 2) 외에 미토콘드리아 등 세포 소기관으로 유전자를 도입 할 수있다. 아그로 박테 리움 기반 방법 (표 2)와 달리 펩타이드 기반 형질에 대한 엄격한 호스트 범위 제한은 없습니다. 지금까지, A. 장대, N. benthamiana의 포플러와의 형질 전환을위한 제형 (표 1)에 최적화되어 있지만, 상기 방법은 또한 된 담배에 적용 할 수있다 토마토 품종 마이크로 톰, 쌀 (예비 실험 기준) 및 기타 모노과 쌍떡잎 식물. 펩타이드가 사용되는 경우 아직 같이, 트랜스 규모 알려진 제한은 없다(S)의 형질 전환 벡터. 반대로, 대규모 DNA 분자는 아그로 박테 리움 - 매개 방법 (35, 36)의 변환 효율 및 37-39를보고되었다 약 200킬로바이트의 유전자에 대한 크기 상한을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 바이오리 스틱스 (biolistics)를 사용하여, 다른 한편으로는, 큰 DNA 단편은 식물 (38) 제조시 전단 또는 전달 될 수있다. 상한은 원경과 유전자 형질 전환에 결정되어 있지 않지만, 물리적 제약이 훨씬 미만 150킬로바이트 (40)에 전송할 수있는 DNA의 크기를 제한하는 것으로 밝혀졌다. 상술 아그로 또는 충격 microprojectile를 이용하는 기존의 방법에 비해 유전자 전달 용 펩타이드 기반 시스템을 사용하는 주요 장점은 표 2에 요약되어있다. 그것은 약자로 몇 가지 제한 사항이 방법을 위해 존재한다. 우선, 예컨대 금속 절연체 전이 특정 소기관으로의 pDNA 전달 타겟팅효율이 낮은하지만 ochondria, DNA 결합, 세포 침투 및 세포 소기관 - 교통 시퀀스의 단순한 조합에 의해 가능 입증되었습니다. 유전자 발현은 단지 세포 내 미토콘드리아의 작은 집단에서, 공 초점 현미경에 의해 탐지 될 수있다. 셀 / organellar 막을 가로 질러 더 착체의 전위 향상, 및 (ii) 식의 대상 소기관으로 해리 캐리어 펩티드로부터의 pDNA의 전달을 개선한다 : (i) 따라서, 상기 변형에 필요하다. 둘째,이 DNA 전달 시스템을 사용하여, 외인성 리포터 유전자의 일시적 발현을 성공적 세포의 세포질과 미토콘드리아 구획에서 달성되었다. 식물 핵 / organellar 게놈에 도입 된 유전자의 안정된 통합 표현 인해 적합한 선택 전략의 부재로, 그러나 아직 확립되지 않았다. 인정하면서도 개선 또는 추가 개발을위한 영역이 있음evelopment는 여기에 설명 된 펩타이드 유래 전략은 다양한 식물 종류에 다양한화물의 배달을 위해 도로를 포장 한 간단하고 다양한 기술 남아있다.

식물 유전 공학은 일반적으로 유익한 형질을 식물에 전달하는 데 사용됩니다. 최근 몇 년 동안 이 기술은 약학적으로 중요하고 상업적으로 가치 있는 단백질을 생산하기 위해 식물을 바이오 공장으로 전환하는 데 적용되었으며, 그 중 다수는 화학적으로 합성할 수 없고 동물 또는 미생물 시스템을 사용하여 생산하는 데 매우 비용이 많이 듭니다1. 새로운 유전자의 도입으로 식물 자체의 신진대사는 항체, 대사 효소, 호르몬, 항원 또는 백신과 같은 다양한 바이오 의약품의 생산을 위해 조작될 수 있습니다2.
식물에 대한 확립된 유전자 전달 기술은 Agrobacterium-mediated delivery3, DNA로 코팅된 미세발사체(biolistics)4 폭격, protoplasts의 electroporation5 또는 폴리에틸렌 글리콜6 처리입니다. 원형질체(protoplast)가 필요한 기법은 시간이 많이 걸리고 번거로우며 일관성 없는 결과를 얻기 때문에 일반적으로 피한다7. 그 결과, 현재 거의 모든 식물 변형 작업은 유전자 전달을 위해 아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 미세발사체(microprojectiles)를 활용합니다. Agrobacterium 방법은 더 광범위하게 사용되지만 경제적으로 중요한 많은 식물 종에는 적용되지 않습니다. 한편, 미세발사체 폭격은 취약한 식물이 광범위하기 때문에 더 다재다능하지만 특수 장비가 필요하고 종종 심각한 조직 손상을 유발합니다. 또한, 이러한 방법은 무작위(biolistics) 또는 복합체(Agrobacterium) 전달 메커니즘을 포함하며 다양한 형질전환 속도를 갖습니다8. 따라서 간단하면서도 효과적이며 다양한 식물 유형에 적용할 수 있는 새로운 식물 변형 기술이 필요합니다.
현재 식물은 표적 단백질의 직접 전달보다는 원하는 형질을 암호화하는 외인성 DNA의 전달에 의해 주로 유전자 변형을 받습니다. 단백질에 비해 DNA의 안정성이 더 높다는 것은 주요 이점입니다. 그럼에도 불구하고, DNA 전달과 관련된 잠재적인 문제로는 외인성 DNA가 식물 게놈에 무작위로 삽입되는 것과 항생제 내성 유전자가 수평적 유전자 전달을 통해 병원성 박테리아로 의도하지 않게 전달되는 것9 등이 있다. 게놈 편집 목적의 경우, 세포에 외래 DNA를 도입하지 않고 식물 게놈을 편집할 수 있는 능력은 유전자 변형 식물과 관련된 규제 문제를 피할 수 있습니다. 따라서 단백질의 직접 전달에 의한 식물 변형을 위한 대안적인 DNA 무함유 전략은 이러한 요구를 충족시킬 수 있을 것입니다.
여기에서는 원래 인간 유전자 치료10-14를 위해 개발된 펩타이드 기반 시스템을 소개하여 온전한 식물에서 외인성 유전자 또는 단백질을 표적화합니다. 펩타이드는 뉴클레아제 분해로부터 DNA를 보호할 수 있으며 세포와 소기관막을 가로지르는 유전자 전달을 매개할 수 있습니다15-17. 그들은 또한 비 세포 독성18-20 외에도 다양하고 조정 가능한 특성을 가지고 있습니다. 더 중요한 것은 펩타이드를 사용하여 유전자를 미토콘드리아21 또는 플라스티드(엽록체)22와 같은 세포 내 소기관으로 정확하게 표적으로 삼아 발현할 수 있다는 것인데, 이는 생물학적 또는 아그로박테리움 매개 형질전환으로는 달성할 수 없는 작업입니다. 화물 유형에 따라, 이 새로운 식물 변형 기술은 단백질23 및 식물 내부, 세포질 공간24-26 또는 특정 소기관 구획21 내에서 발현(플라스미드21,24 또는 이중 가닥 DNA25) 또는 하향 조절(이중 가닥 RNA26) 특정 유전자를 전달하기 위해 활용될 수 있습니다. 설계된 캐리어 펩타이드는 세포 침투(BP100 펩타이드) 또는 미토콘드리아 통과(Cytcox 펩타이드) 서열에 접합되는 음전하를 띤 화물의 결합 및/또는 응축을 위한 폴리리신(K8) 또는 폴리리신-코-히스티딘(KH)9 형태의 양이온 도메인으로 구성됩니다.

<table><tbody><tr><td>(KH)9-BP100 펩타이드</td><td>RIKEN Brain Science Institute에 의한 맞춤 합성</td><td>N/A</td><td>서열: KHKHKHKHKHKHKHKH- KHKKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>(BP100)2-K8 펩티드</td><td>RIKEN Brain Science Institute에 의한 맞춤 합성</td><td>N/A</td><td>서열: KKLFKKILKYLKKLFKKIL- KYLKKKKKKKK</td></tr><tr><td>BP100 펩타이드</td><td>RIKEN Brain Science Institute에 의한 맞춤형 합성</td><td>N/A</td><td>서열: KKLFKKILKYL</td></tr><tr><td>Cytcox-(KH)9 펩타이드</td><td>RIKEN Brain Science Institute에 의한 맞춤형 합성</td><td>N/A</td><td>서열: MLSLRQSIRFFKKHKHKH- KHKHKHKHKHKH</td></tr><tr><td>P35S-GFP(S65T)-TNOS 및 P35S-RLuc-TNOS</td><td>N/A</td><td>해당 없음</td><td>CaMV 35S 구성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질 및 Renilla luciferase 유전자를 각각 인코딩합니다(참조: Lakshmanan et al. Biomacromolecules 2013, 14, 10)</td></tr><tr><td>pDONR-cox2:gfp 및 pDONR-cox2:rluc</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>cox2 미토콘드리아 특이적 프로모터의 제어 하에 각각 녹색 형광 단백질 및 Renilla luciferase 유전자를 인코딩합니다(참조: Chuah et al. Sci Rep 2015, 5, 7751)</td></tr><tr><td>dsDNA (pBI221-P35S-Rluc-TNOS에서 PCR 증폭)</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>CaMV 35S 구성 프로모터의 제어 하에 녹색 형광 단백질과 Renilla luciferase 유전자를 각각 인코딩합니다(참조: Lakshmanan et al. Plant Biotechnol 2015, 32, 39)</td></tr><tr><td>GFP5 siRNA</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>녹색 형광 단백질의 RNA 간섭 매개 침묵의 경우(참조: Numata et al. Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>CHS siRNA</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>칼콘 합성효소의 RNA 간섭 매개 침묵화(참조: Numata et al Plant Biotechnol J 2014, 12, 1027)</td></tr><tr><td>1 ml 및 10 ml 플라스틱 주사기</td><td>TERUMO Corporation</td><td>SS-01T, SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>AS ONE Corporation</td><td>151212</td><td></td></tr><tr><td>96웰 평면 바닥판</td><td>Asahi Glass Co., Ltd.</td><td>3860-096</td><td></td></tr><tr><td>점착 테이프</td><td>세키스이 화학(주)</td><td>번호 835</td><td></td></tr><tr><td>알코올 탈수소 효소</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>A-7011</td><td></td></tr><tr><td>원자력 현미경</td><td>세이코 인스트루먼트</td><td>SPI3800, SPA 300HV</td><td></td></tr><tr><td>원자력 현미경</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>AFM5300E</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>캔틸레버</td><td>Hitachi High-Tech Science Corporation</td><td>K-A102001593</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>코르크 보어</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>Z165220</td><td>직경 1cm 디스크의 잎 절제용</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>C02261</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Sarstedt</td><td>759116</td><td></td></tr><tr><td>접힌 모세관 세포</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td></td><td></td>DTS1070</tr><tr><td>겸자</td><td>시미즈 아키라 Inc.</td><td>스테인리스 pincet 150</td><td></td></tr><tr><td>균질화 유봉</td><td>Ieda 무역 공사</td><td>9993</td><td></td></tr><tr><td>운모</td><td>닛신 EM 주식회사</td><td>LC23Z</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>BKA46472</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular Devices Corporation</td><td>Spectra MAX M3</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td></td><td></td>S011120</tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf Research&reg; plus</td><td>3120000909</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>AS ONE Corporation</td><td>2-5138-01, 2-5138-02, 2-5138-03</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 페트리 접시</td><td>AS ONE Corporation</td><td>1-7484-01</td><td></td></tr><tr><td>Renilla Luciferase Assay Kit</td><td>Promega corporation</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B Isothiocyanate</td><td>시그마-알드리치 주식회사</td><td></td><td></td>283924</tr><tr><td>RNase-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>탄산나트륨</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-01585</td><td></td></tr><tr><td>수술용 칼날 및 손잡이</td><td>FEATHER Safety Razor Co., Ltd.</td><td>스테인레스 스틸 No. 14 (칼날), No. 3L (핸들)</td><td></td></tr><tr><td>주사기 팁 캡</td><td>Musashi Engineering Inc.</td><td>NC-3E</td><td></td></tr><tr><td>계량 저울</td><td>Sartorius</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>Zeta 전위차계</td><td>Malvern Instruments, Ltd.</td><td>제타사이저 나노-ZS</td><td></td></tr></tbody></table>

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 organellar 장벽을 수송하는

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

외인성 단백질을 도입하고 식물에서 특정 유전자를 발현(또는 하향 조절)할 수 있는 능력은 식물 생명 공학 분야의 새로운 응용뿐만 아니라 기초 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다. 현재 식물 세포로의 단백질 또는 유전자 전달을 위해 존재하는 실행 가능한 방법, 즉 아그로박테리움(Agrobacterium) 및 마이크로발사체 폭격(microprojectile bombardment)은 낮은 형질전환 빈도, 제한된 숙주 범위 또는 높은 장비 및 마이크로캐리어 비용이라는 단점이 있습니다. 다음 프로토콜은 합리적으로 설계된 펩타이드를 다양한 핵산 및 단백질 기반 화물을 식물로 운반하기 위한 전달제로 사용하는 간단하고 다재다능한 방법을 간략하게 설명합니다. 펩타이드는 생분해성, 크기 감소, 다양하고 조정 가능한 특성, 세포 내/세포 기관 접근을 얻을 수 있는 능력으로 인해 시스템 개발을 위한 도구로 선택됩니다. 광범위한 배송 화물(플라스미드 DNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA 및 단백질)의 각 유형에 대해 최적화된 제형의 준비, 특성화 및 적용에 대해 설명합니다. 프로토콜 내의 중요한 단계, 가능한 수정 사항 및 방법의 기존 제한 사항도 논의됩니다.

핵산과 단백질화물의 배열이 성공적으로 전달 벡터로 디자인 된 펩티드를 사용하여 다양한 식물에 도입되었다. 양이온 성 펩티드 및 음전하화물 사이의 정전 기적 상호 작용을 직접 무 바늘 주사기 (도 1)를 사용하여 잎 식물에 침투 할 수 형질 복합체의 형성의 결과. 식물 세포의 형질 전환을위한 (경험적으로 이러한 연구 21,23-26 결정)에 최적화 된 제형은 배달화물 (의 pDNA, dsDNA, dsRNA를 단백질)의 넓은 범위에있는 각 유형이 표시됩니다 표 1에 나열되어 있습니다. 300 나노 미터 - 모든 펩티드 제제의 평균 직경 (150)의 대략적인 범위에 있었다. DLS 분석에 기초하여, 모든 제제는 형성된 펩티드화물 골재가 균일 한 크기 분포를 가지고 있음을 나타내는, 상대적으로 낮은 크기의 분산도를 표시. 의 형태학펩타이드와의 pDNA (그림 2A) 또는 단백질 (그림 2B) 사이의 복합체는, 운모에, AFM에 의해 촬영되었다. 균일 한 구형 복합체 DLS 측정의 데이터와 일치, 두 펩타이드의 pDNA 및 펩티드 단백질 조합 관찰되었다. dsRNA를 계 복합체가 거의 중성 표면 전하를 가지는 동안 복합체 (표 1)의 제타 전위의 관점에서 pDNA- 및 dsDNA 유래 착물은 순 음극 표면 전하를 가지고 있었다. 펩티드 - 단백질 복합체는 반면에, 양으로 대전 하였다. 펩티드의 pDNA 모델 식물 시스템 등 A. 장대 또는 N.의 benthamiana의 형질을 매개 펩티드 dsDNA 제형의 효율이 질적으로뿐만 아니라 양적으로 평가 하였다. RLuc 유전자 발현 분석이 실험의 pDNA를 들어, 따라서, 유전자 발현 수준을 정량 (표 1)에 이용 된 또는RLuc 유전자를 코딩 dsDNA는 각각의 캐리어 펩타이드 복합체에 사용되어야한다. 약 1 × 105의 추정 RLU / mg의 값으로, 12 시간의 배양 기간에 이어 (KH) 9 -BP100 / pDNA를 배합 핵 타겟의 pDNA 전달 및 발현이 달성 될 수있는 사용. pDNA를 펩티드의 조합 미토콘드리아 타겟팅 전달 및 발현을 위해, Cytcox- (KH) 9 BP100은 복합체 형성이 필요. 12 시간의 최적화 동일한 잠복기로, 그러나, 형질 전환 (약 1 × 103 RLU / mg)의 더 낮은 수준을 달성 하였다. 한편, 유사한 잠복 기간 (12 시간) 유전자 발현 수준 (약 1 × 103 RLU / mg)를도 9 -BP100 펩티드를 (KH)를 사용하여 제제화 dsDNA 계 복합체에 대하여 / 요구되었다. 유전자 발현의 질적 평가는 단지를 위해 준비 할 처리 한 잎의 직접 현미경 관찰에 의해 수행되었다에드의 pDNA를 사용하거나 dsDNA는 GFP 리포터 유전자를 코딩. 비 표적 펩타이드의 pDNA 단지로 형질 세포에서 GFP 발현이 명확하게 관찰 세포질 (그림 3A)에서 지역화 발견에 대응하는 녹색 형광을 확산. GFP의 형광의 현지화 패턴에 뚜렷한 차이가 미토콘드리아 표적 펩타이드의 pDNA 단지와 침투 세포에서 분명했다. 여기서, 미토콘드리아 얼룩 colocalize 점상 녹색 형광 세포의 미토콘드리아 구획 (도 3b)에 독점적으로 유전자 발현의 특이성을 확인 가시적이었다. 펩티드 - 단백질 조성물의 경우, 형광 물질 (RHB)로 단백질화물 (ADH)의 접합은 세포 내 구획에서 전달 단백질의 시각화를 가능하게 할 것이다. 6 시간의 짧은 잠복기 내 ADH-RHB 단백질 (청색)에 걸쳐 분산되는 것으로 밝혀졌다세포질 및 침투 세포의 액포 (그림 3C). 한편, 유전자 발현의 신속하고 효율적인 하향 조절은 펩타이드의 dsRNA 제제를 사용하여 다양한 식물에서 달성 될 수있다. 첫 번째 실험에서는, A. 장대 잎이 펩티드 dsRNA를 침투시켰다 가뭄 조건 안토시아닌 (적색 안료) 생합성에 대한 책임이있는 칼콘 합성 효소 유전자 (CHS)를 침묵 복합체. A. 장대의 외관의 차이는 (b는 그림 3D) 최적화 된 펩타이드 dsRNA를 제제를 사용하여 침묵 CHS을 평가하는 쉬운 방법을 제공 가뭄 일반의 (a 그림 3D) (화살표 (1)가 침투 영역을 나타냄) 아래 나뭇잎. 두 번째 실험에서, 펩티드의 dsRNA 착물 옐로우 형광 단백질 (YFP)을 발현하는 트랜스 제닉 A. 장대의 잎에 침투 하였다. YFP 식 겉보기 감소 표피 세포 9 시간 p를 볼 수 있었다이스트 형질 (그림 3E, F). 다른 식물 시스템 (포플러, 12 시간 후 형질)의 하향 조절 유전자 발현의 제제의 효과는 (그림 3G, H) 확인되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig1.jpg" /> 그림 1 : 살아있는 식물로 핵산과 단백질화물의 배달을위한 펩타이드 기반 제제. 설계된 캐리어 펩타이드는 세포 침투 또는 organellar 교통 서열에 결합 폴리 양이온으로 구성되어 있습니다. 폴리 양이온이 세포로 내재화 다음 엔도 좀 구획에서 및 / 또는 부정적으로 충전 된화물의 응축과 탈출을 결합 할 수 있습니다. 특정 소기관으로 세포로화물 배달, 이후 각각 세포 침투 시퀀스 및 organellar 교통 시퀀스에 의해 매개된다. successfu 될 수 있습니다 다양한화물에서야 플랜트 내로 전달은 혈청 알부민 (BSA), 알콜 탈수소 효소 (ADH)와 황 (황색 형광 단백질의 변형)과 같은 핵산 등의 pDNA, dsDNA 및 dsRNA를 같은 산뿐만 아니라 모델 단백질을 포함한다. 생체 활성 분자는 주사기 침윤 잎 식물에 도입 정전 기적 상호 작용을 통해 펩티드 접합체와 형질 복합체를 형성 할 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig2.jpg" /> 그림 2 : 펩타이드 기반 제제의 형태학. (KH) N / P 0.5에서 9 -BP100 /의 pDNA 제형의 (A) AFM 진폭 이미지입니다. (B) (BP100) 몰 rati에서 2 K 8 / ADH 제형의 AFM 이미지 높이오 10. 게시 된 소스 (23, 24)에서 허가를 재현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig3.jpg" /> 그림 3 : 최적화 된 펩타이드 기반 제제를 사용하여 형질 효율성의 현미경 평가. , A. 장대 스폰지 엽육 세포에서 관찰되었다 (A) 엽록소 형광도 (레드)에서 명확하게 구별 세포질 GFP 발현 (녹색)는 (KH) 9 -BP100 / pDNA를 제제 (N 침투 나뭇잎 / P 0.5 ~ 12 시간 ). (B) GFP 발현 (녹색)의 각 peptid 대한 Cytcox- (KH)로 침투 A. 장대 잎 9 / BP100 / pDNA를 제제 (N / P 0.5의 표피 세포의 미토콘드리아 (레드)에서 검출 된이자형; 12 시간). GFP 식 미토콘드리아의 확대 이미지는 맨 오른쪽 패널에 표시됩니다. A. 장대의 스폰지 엽육 세포로 ADH-RHB (파란색)의 (C) 배송은 10의 펩타이드 / 단백질의 몰 비율 (BP100) 2 K (8)에 의해 매개 6 시간 포스트 침투를 시각화 나뭇잎. 전 (D) A. 장대 잎 (a) 및 (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제제 (몰비 2; 48 시간)와 (b) 치료 후, 안토시아닌 생합성 경로의 억제 결과. GFP5 된 dsRNA를 함유하는 유사 제제는 대조군 (C)과 같은 판에 함침시켰다. 화살표 (2) 및 (4)는 판 내의 비 침투 영역을 표시하는 동안 화살표 (1)과 (3)는 침투 영역을 나타낸다. (E) A. thaliana의 황색 형광 단백질 (YFP) 및 (F)로 침윤 다음 감소 YFP 형광을 발현 잎<html> (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제제 (몰비이 9 시간). (G) 노란색 형광 단백질 (YFP) 및 (H) (KH) 9 -BP100 / dsRNA를 제형으로 감소 YFP 형광 다음 침투 발현하는 형질 전환 포플러 잎 (몰비이 12 시간을). 공개 소스 21,23,24,26에서 허가를 재현. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54972/54972fig4.jpg" /> 그림 4 :에-DNA 펩타이드 (N / P) 비율과 단지의 생물 물리학 특성에 미치는 영향에 변화. DNA 비율 펩티드가 증가함에 따라, 펩티드 제제는 제타 전위의 값으로 천이하는 동안 음극에서 양극으로 크기가 감소한다./files/ftp_upload/54972/54972fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54972/54972table1.jpg" /> 표 1 특성화 및 다양한 펩티드 제제의 평가. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/54972/54972table2.jpg" /> 표 2 : 본래 식물에 대한 펩타이드 기반 및 다른 기존의 DNA 전달 기술의 비교. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54972/54972table2large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

식물 수정을 위한 기존 방법은 적용 가능성이 제한적입니다. 여기에서 제안된 새로운 펩타이드 유래 기술은 온전한 식물의 원하는 세포 내 구획에 외인성 단백질 또는 유전자를 도입하는 데 있어 단순성과 효율성을 모두 약속합니다.

펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

이 펩타이드 기반 방법의 전반적인 목표는 식물의 세포 및 세포소기관 장벽을 가로질러 유전자와 단백질을 운송하는 것입니다. 이 방법은 특정 유전자의 발현을 매개하기 위해 다양한 유전자와 단백질을 전달하는 합리적으로 설계된 펩타이드 접합체를 통해 식물을 변형함으로써 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 즉각적인 장점은 세포 및 세포소기관 경계를 통과할 수 있는 펩타이드를 기반으로 하여, 식물 잎에 간단한 주사기 보조 형질전환 절차를 적용한다는 점입니다.기존의 방법들은 비용이 많이 들고, 일부 식물 종류에는 적용할 수 없으며, 세포 내 소기관을 표적으로 삼을 수 없기 때문에, 우리는 이 간단하고 효과적이며 새로운 식물 형질전환 방법을 개발했습니다. Jo-Ann Church가 제 실험실의 기술자인 Yoko Horii와 함께 해당 절차를 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 펩타이드 플라스마 DNA 제형을 준비하십시오.펩타이드를 혈장 DNA에 첨가하면 용액이 흐려집니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 최종 부피까지 초순수로 희석하면 혼합액이 투명해집니다. 희석된 용액 800 µL를 동적 광산란 분석을 위해 큐벳으로 옮깁니다.ZetaSizer를 사용하여 형성된 복합체의 수력학적 직경과 다분산 지수를 측정합니다. 25 °C에서 633 nm 헬륨-네온 레이저와 173°의 후방 산란 검출 각도를 사용합니다. 크기 측정 후, 용액을 접이식 모세관 셀로 옮겨 25 °C 물의 유전 상수, 굴절률 및 점도 기본 설정값으로 제타 전위를 측정합니다.원자 힘 현미경으로 복합체 용액을 관찰하려면, 마이카 시트의 갓 노출된 절단면 위에 10 µL를 도포하고 덮개가 있는 플라스틱 페트리 접시에서 하룻밤 동안 공기 건조시킵니다. 스프링 상수가 1.3 N/m인 실리콘 캔틸레버를 사용하여 태핑 모드에서 25 °C의 공기 중 복합체 이미지를 획득합니다. 22 °C에서 16시간 명기, 8시간 암기의 주기 조건으로 배양한 3주 된 Arabidopsis thaliana를 사용합니다.유전자 발현 정량화를 위한 3반복 실험으로 사용할 잎을 최소 3장 선택합니다. 1mL 바늘 없는 플라스틱 주사기에 잎 한 장의 형질전환에 필요한 복합 용액 100 µL를 충전합니다. 그런 다음, 주사기 팁을 잎의 배축면에 위치시킵니다.주사기 팁을 잎에 살짝 누른 상태에서, 라텍스 장갑을 낀 손의 검지로 반대편에서 반대 방향으로 압력을 가하면서 주사기 플런저를 천천히 누릅니다. 성공적으로 침투가 이루어지면 잎에 물에 젖은 듯한 영역이 퍼지는 것을 확인할 수 있습니다. 식별이 용이하도록 침투시킨 잎에 라벨을 붙입니다.펩타이드 플라스미드 DNA가 형질전환된 식물을 성장 챔버에서 12시간 동안 배양합니다. 형질전환 효율을 평가하기 위해, 먼저 형질전환된 잎 전체를 절제합니다. Renilla Luciferase 리포터 벡터를 사용한 형질전환 실험의 경우, Renilla Luciferase 분석 키트를 사용하여 형질전환 효율을 정량적으로 측정합니다.먼저, 절제한 각 잎을 1.5 millileter 마이크로원심분리관에 넣습니다. 튜브당 100 microliters의 1X Lysis Buffer를 첨가합니다. 동일한 방법으로, transfection 되지 않은 대조군 잎의 용해물을 3반복으로 준비합니다.균질화 페스틀을 사용하여 잎을 갈고, 생성된 용해물을 25 °C에서 6~10시간 동안 배양합니다. 배양 후, 마이크로원심분리기를 사용하여 용해물을 12,470 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 맑게 된 용해물 20 µL를 96-웰 마이크로플레이트의 웰로 옮깁니다.남은 부피는 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 정량하는 데 사용하십시오. 다음으로, 1x Renilla Luciferase 분석 기질 100 microliters를 웰에 넣고 천천히 피펫팅하여 혼합합니다. 마이크로플레이트를 멀티모드 마이크로플레이트 리더에 넣고 측정을 시작하십시오.녹색 형광 단백질 리포터 벡터를 이용한 형질전환 실험의 경우, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광을 관찰하십시오. 먼저, 공기층 제거를 돕기 위해 잎 전체의 가장자리를 자릅니다. 그 다음, 10 milileter 주사기에서 플런저를 제거하고 절단한 각 잎 또는 잎 조각을 주사기 안에 넣습니다.플런저를 다시 끼우고 잎이 짓눌리지 않도록 주의하며 주사기 바닥까지 부드럽게 밀어 넣습니다. 주사기의 약 절반이 찰 때까지 물을 흡입합니다. 주사기를 위로 향하게 한 뒤 플런저를 밀어 팁을 통해 주사기 내부의 공기를 제거합니다.그런 다음, 주사기 팁을 덮고 플런저를 천천히 아래로 당겨 잎에서 공기를 배출합니다. 잎이 반투명하게 보일 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다. 다음으로, 현미경 슬라이드 표면을 접착테이프로 덮습니다.칼날을 사용하여 잎 시료를 충분히 수용할 수 있는 크기로 테이프에 정사각형 영역을 자르고, 핀셋으로 해당 정사각형 테이프 조각을 떼어내어 시료 챔버를 만듭니다. 테이프는 슬라이드와 커버글라스 사이의 간격 유지 장치(spacer) 역할을 하게 됩니다. 잎의 배축면이 위를 향하도록 챔버에 놓고, 챔버의 나머지 공간을 물로 채웁니다.유리 커버슬립으로 챔버 내의 잎을 밀봉하고, 접착 테이프로 커버슬립의 가장자리를 고정합니다. 40배 대물렌즈 또는 63배 수침 대물렌즈를 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 잎 샘플을 관찰합니다. GFP 형광은 488 nanometers의 여기 파장에서 시각화할 수 있습니다.펩타이드 대 DNA 비율이 0.5인 펩타이드 플라스미드 DNA 제형의 최적 조제물은 평균 직경이 약 290 nanometers여야 하며, 균일한 크기 분포를 나타내는 약 0.3의 낮은 다분산 지수를 가져야 합니다. 또한, 복합체는 약 30 millivolts의 제타 전위를 나타내어야 합니다. 펩타이드 플라스미드 DNA 복합체의 대표적인 원자 힘 현미경 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.균질한 구형 복합체가 관찰되었습니다. 펩타이드-플라스미드 DNA 제형을 사용하여 Arabidopsis thaliana에서 핵 표적 전달 및 플라스미드 DNA 발현을 달성할 수 있으며, 밀리그램당 추정 Renilla Luciferase 값은 약 100,000입니다. 유전자 발현을 평가하기 위해 GFP 리포터를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 제조된 복합체를 처리한 잎을 대상으로 현미경 관찰을 수행하였습니다.이미지 분석 결과, 비표적 펩타이드 플라스미드 DNA 복합체가 형질전환된 세포에서 GFP 발현에 해당하는 확산된 녹색 형광이 뚜렷하게 관찰되었으며, 이것이 세포질에 국소화되어 있음을 확인하였습니다. 이 기술의 개발 이후, 식물 생명공학 분야의 연구자들은 다양한 단백질 및 핵산 기반 화물을 살아있는 식물에 전달할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 비디오를 시청하고 텍스트 프로토콜을 읽고 나면, 플라스미드 DNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 그리고 단백질을 포함한 각 화물 유형에 대해 최적화된 다양한 제형을 준비, 특성 분석 및 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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