펩타이드 유래의 방법은 식물의 유전자와 단백질 세포 간 및 Organellar 장벽을 수송하는

이 펩타이드 기반 방법의 전반적인 목표는 식물의 세포 및 세포소기관 장벽을 가로질러 유전자와 단백질을 운송하는 것입니다. 이 방법은 특정 유전자의 발현을 매개하기 위해 다양한 유전자와 단백질을 전달하는 합리적으로 설계된 펩타이드 접합체를 통해 식물을 변형함으로써 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 즉각적인 장점은 세포 및 세포소기관 경계를 통과할 수 있는 펩타이드를 기반으로 하여, 식물 잎에 간단한 주사기 보조 형질전환 절차를 적용한다는 점입니다.

기존의 방법들은 비용이 많이 들고, 일부 식물 종류에는 적용할 수 없으며, 세포 내 소기관을 표적으로 삼을 수 없기 때문에, 우리는 이 간단하고 효과적이며 새로운 식물 형질전환 방법을 개발했습니다. Jo-Ann Church가 제 실험실의 기술자인 Yoko Horii와 함께 해당 절차를 시연할 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 펩타이드 플라스마 DNA 제형을 준비하십시오.

펩타이드를 혈장 DNA에 첨가하면 용액이 흐려집니다. 텍스트 프로토콜에 명시된 최종 부피까지 초순수로 희석하면 혼합액이 투명해집니다. 희석된 용액 800 µL를 동적 광산란 분석을 위해 큐벳으로 옮깁니다.

ZetaSizer를 사용하여 형성된 복합체의 수력학적 직경과 다분산 지수를 측정합니다. 25 °C에서 633 nm 헬륨-네온 레이저와 173°의 후방 산란 검출 각도를 사용합니다. 크기 측정 후, 용액을 접이식 모세관 셀로 옮겨 25 °C 물의 유전 상수, 굴절률 및 점도 기본 설정값으로 제타 전위를 측정합니다.

원자 힘 현미경으로 복합체 용액을 관찰하려면, 마이카 시트의 갓 노출된 절단면 위에 10 µL를 도포하고 덮개가 있는 플라스틱 페트리 접시에서 하룻밤 동안 공기 건조시킵니다. 스프링 상수가 1.3 N/m인 실리콘 캔틸레버를 사용하여 태핑 모드에서 25 °C의 공기 중 복합체 이미지를 획득합니다. 22 °C에서 16시간 명기, 8시간 암기의 주기 조건으로 배양한 3주 된 Arabidopsis thaliana를 사용합니다.

유전자 발현 정량화를 위한 3반복 실험으로 사용할 잎을 최소 3장 선택합니다. 1mL 바늘 없는 플라스틱 주사기에 잎 한 장의 형질전환에 필요한 복합 용액 100 µL를 충전합니다. 그런 다음, 주사기 팁을 잎의 배축면에 위치시킵니다.

주사기 팁을 잎에 살짝 누른 상태에서, 라텍스 장갑을 낀 손의 검지로 반대편에서 반대 방향으로 압력을 가하면서 주사기 플런저를 천천히 누릅니다. 성공적으로 침투가 이루어지면 잎에 물에 젖은 듯한 영역이 퍼지는 것을 확인할 수 있습니다. 식별이 용이하도록 침투시킨 잎에 라벨을 붙입니다.

펩타이드 플라스미드 DNA가 형질전환된 식물을 성장 챔버에서 12시간 동안 배양합니다. 형질전환 효율을 평가하기 위해, 먼저 형질전환된 잎 전체를 절제합니다. Renilla Luciferase 리포터 벡터를 사용한 형질전환 실험의 경우, Renilla Luciferase 분석 키트를 사용하여 형질전환 효율을 정량적으로 측정합니다.

먼저, 절제한 각 잎을 1.5 millileter 마이크로원심분리관에 넣습니다. 튜브당 100 microliters의 1X Lysis Buffer를 첨가합니다. 동일한 방법으로, transfection 되지 않은 대조군 잎의 용해물을 3반복으로 준비합니다.

균질화 페스틀을 사용하여 잎을 갈고, 생성된 용해물을 25 °C에서 6~10시간 동안 배양합니다. 배양 후, 마이크로원심분리기를 사용하여 용해물을 12,470 ×g에서 1분 동안 원심분리합니다. 맑게 된 용해물 20 µL를 96-웰 마이크로플레이트의 웰로 옮깁니다.

남은 부피는 제조사의 프로토콜에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 농도를 정량하는 데 사용하십시오. 다음으로, 1x Renilla Luciferase 분석 기질 100 microliters를 웰에 넣고 천천히 피펫팅하여 혼합합니다. 마이크로플레이트를 멀티모드 마이크로플레이트 리더에 넣고 측정을 시작하십시오.

녹색 형광 단백질 리포터 벡터를 이용한 형질전환 실험의 경우, 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 형광을 관찰하십시오. 먼저, 공기층 제거를 돕기 위해 잎 전체의 가장자리를 자릅니다. 그 다음, 10 milileter 주사기에서 플런저를 제거하고 절단한 각 잎 또는 잎 조각을 주사기 안에 넣습니다.

플런저를 다시 끼우고 잎이 짓눌리지 않도록 주의하며 주사기 바닥까지 부드럽게 밀어 넣습니다. 주사기의 약 절반이 찰 때까지 물을 흡입합니다. 주사기를 위로 향하게 한 뒤 플런저를 밀어 팁을 통해 주사기 내부의 공기를 제거합니다.

그런 다음, 주사기 팁을 덮고 플런저를 천천히 아래로 당겨 잎에서 공기를 배출합니다. 잎이 반투명하게 보일 때까지 이 과정을 여러 번 반복합니다. 다음으로, 현미경 슬라이드 표면을 접착테이프로 덮습니다.

칼날을 사용하여 잎 시료를 충분히 수용할 수 있는 크기로 테이프에 정사각형 영역을 자르고, 핀셋으로 해당 정사각형 테이프 조각을 떼어내어 시료 챔버를 만듭니다. 테이프는 슬라이드와 커버글라스 사이의 간격 유지 장치(spacer) 역할을 하게 됩니다. 잎의 배축면이 위를 향하도록 챔버에 놓고, 챔버의 나머지 공간을 물로 채웁니다.

유리 커버슬립으로 챔버 내의 잎을 밀봉하고, 접착 테이프로 커버슬립의 가장자리를 고정합니다. 40배 대물렌즈 또는 63배 수침 대물렌즈를 사용하여 공초점 레이저 주사 현미경으로 잎 샘플을 관찰합니다. GFP 형광은 488 nanometers의 여기 파장에서 시각화할 수 있습니다.

펩타이드 대 DNA 비율이 0.5인 펩타이드 플라스미드 DNA 제형의 최적 조제물은 평균 직경이 약 290 nanometers여야 하며, 균일한 크기 분포를 나타내는 약 0.3의 낮은 다분산 지수를 가져야 합니다. 또한, 복합체는 약 30 millivolts의 제타 전위를 나타내어야 합니다. 펩타이드 플라스미드 DNA 복합체의 대표적인 원자 힘 현미경 이미지가 여기에 제시되어 있습니다.

균질한 구형 복합체가 관찰되었습니다. 펩타이드-플라스미드 DNA 제형을 사용하여 Arabidopsis thaliana에서 핵 표적 전달 및 플라스미드 DNA 발현을 달성할 수 있으며, 밀리그램당 추정 Renilla Luciferase 값은 약 100,000입니다. 유전자 발현을 평가하기 위해 GFP 리포터를 인코딩하는 플라스미드 DNA로 제조된 복합체를 처리한 잎을 대상으로 현미경 관찰을 수행하였습니다.

이미지 분석 결과, 비표적 펩타이드 플라스미드 DNA 복합체가 형질전환된 세포에서 GFP 발현에 해당하는 확산된 녹색 형광이 뚜렷하게 관찰되었으며, 이것이 세포질에 국소화되어 있음을 확인하였습니다. 이 기술의 개발 이후, 식물 생명공학 분야의 연구자들은 다양한 단백질 및 핵산 기반 화물을 살아있는 식물에 전달할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 비디오를 시청하고 텍스트 프로토콜을 읽고 나면, 플라스미드 DNA, 이중 가닥 DNA 또는 RNA, 그리고 단백질을 포함한 각 화물 유형에 대해 최적화된 다양한 제형을 준비, 특성 분석 및 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.