Name: 쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 쥐 배아 중족골 배양을 통해 연골 골화의 생리학적 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 뼈 성장과 석회화 과정을 생체에 가까운 조건에서 분석할 수 있는 유용한 모델을 제공합니다.

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우리는 DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1)에 자금을 지원해 준 생명공학 및 생물 과학 연구 위원회(BBSRC)에 감사드립니다. 우리는 또한 KAS(20413)에 자금을 지원한 Arthritis Research UK에 감사드립니다. 자세한 실험에 도움을 주신 Elaine Seawright 양, 렌티바이러스 기술에 도움을 주신 Neil Mackenzie 박사, 동물 연구에 도움을 주신 Darren Smith와 Alex Robertson(Roslin Institute BRF)에게 감사드립니다.

동물 주제와 관련된 절차 공급 또는 과학적인 목적에 사용 사육 동물의 주거 및 관리에 대한 실천의 코드를 출판 영국 동물 (과학적 절차) 법 1986과 동물이 홈 오피스에 따라 유지 하였다 준수 실시 하였다. 주 : 야생형 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 수행 실험은 잘 확립하고 설명한다. 자신의 성장과 광물 가격은 여기에 설명 된 것과 다를 수 있지만 다른 마우스 변종에서 배아 중족골 마찬가지로, 체외에서 배양 할 수있다. 1. 해부 조건 및 악기의 제조 <ol><li> 미디어 및 배아 초보의 불임을 보장하기 위해 층류 후드에있는 모든 미디어 준비, 조직의 해부와 문화 작업을 수행합니다. </li><li> 문화와 해부 미디어를 사용하기 전에 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 적어도 1 시간 동안 평형을 허용합니다. </li><li> 해부를 소독가위, 뒤몽 # 5 뒤몽 # 고압 증기 멸균에 의한 극상 Vannas 마이크로 가위와 함께 4 핀셋 (8cm 직선, 3mm 블레이드). 오토 클레이브 후, 70 % 에탄올에 사용하기 전에 절개 장치 젖어. </li></ol> 해부 문화 미디어 2. 준비 <ol><li> 해부 매체를 준비 <ol><li> 인산 완충 식염수 (PBS) (1시 13분)에서 α-최소 필수 미디어 (뉴 클레오 시드없이 αMEM)을 희석하고, 필터는 0.22 μm의 33 mm 직경의 주사기를 통해 멸균 전에 2 밀리그램 / m의 L에 소 혈청 알부민 (BSA)을 재현 탁 필터. 주 : 해부 매체가 될 수 있고, 필터 멸균 무기한 -20 ℃에서 분취 량으로 저장. </li></ol></li><li> 문화 매체를 준비 <ol><li> (각 웰의 24 웰 배양 판) 배지 300 ㎕의 문화 배아 중족골. / V 승 BSA 0.2 %를 첨가하여 배지를 준비; / ㎖의 L-ASCO 5 μg의rbic 산 포스페이트; 1 mM의 β-글리세 (βGP, 옵션 - 결과 섹션 참조) 0.05 ㎎ / ㎖의 겐타 마이신 및 1.25 μg의 αMEM에 암포 테리 신 B 및 필터 0.22 μm의, 33mm 직경의 주사기 필터를 통해 살균. </li></ol></li></ol> 3. 쥐 배아 에릭손 해부와 문화 <ol><li> 영국에 본사 지침에 따라 자궁 전위에 의해, 15 일 된 배아를 품고, 임신 마우스를 추려 </li><li> 동물 부정사를 놓고 70 % 에탄올로 분사하여 피부를 소독. 사용 해부 가위는 피부와 복강을 노출 복막을 모두 관통, 중간 선에 큰 절개를합니다. </li><li> 체강의 등 지역에서 동물의 두 자궁 뿔을 찾습니다. 먼저 해부 가위로 조심 절개하여 mesometrium에서 각각의 자궁을 확보 한 다음 마지막으로 자신의 기지에서 무료로 자궁 뿔을 절단하여 자궁 뿔을 제거합니다. PLAC해부 매체로 전자 자궁 뿔. </li><li> 자궁 경적을 따라 주입 사이트간에 절단하여 각각의 배아를 분리하고 집게를 사용하여 자신의 개인 주머니에서 배아를 제거합니다. 영국에 본사 지침에 따라 잘린에 의해 도태 배아 </li><li> 70 % 에탄올로 분사하여 피부의 소독 후, 근위 대퇴골 주위를 절개하여 태아의 뒷다리를 제거하기 위해 Vannas에게 마이크로 가위를 사용합니다. 제거 가능한이 뒷다리만큼 보장한다. 에릭손 해부하기 전에 해부 매체에 잠긴 배양 접시에 두 다리를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경에서 곤란과 안정 뒷다리를 들고 # 4 핀셋을 사용하는 동안 # 5 핀셋을 사용하여 전원을 당겨, 배아 발을 둘러싸고있는 피부를 제거하기 시작합니다. 이것은 가장 효과적으로 경골의 주위에 피부를 잡고 지골 향해 당겨 행해진 다. 이 단계에서 위의 사용은 잘라매우 얇은 피부가 필요하지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 # 4 핀셋으로 배아 다리의 tarsals을 잡고 # 5 핀셋을 사용하여 버립니다 tarsals 근처에 떨어져 곤란하여 첫 번째와 다섯 번째 중족골를 제거합니다. </li><li> 같은 위치에서 개최 된 다리로, 나머지 세 지골과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하기 위해 # 5 핀셋을 사용합니다. 중족골에서 지골을 제거 할 지골과 중족골 사이의 관절에 # 5 핀셋의 끝을 삽입합니다. </li><li> 마지막으로, tarsals과 중족골 사이의 결합 조직을 방해하는 5 핀셋 #을 사용합니다. 다시 tarsals에서 tarsals 및 중족골 부드럽게 무료 중족골 사이의 공동 공간에 # 5 핀셋의 끝을 배치합니다. </li><li> 부드럽게 신선한 해부 매체에서 # 4 핀셋과 장소 지금 무료 중족골을 선택합니다. 참고 : 조심 해부 각 배아에서 6 중족골을 제공해야한다. </li><li> 필요한 모든 중족골이 해부되었을 때, carefu개별적으로 배양 배지 300 μl를 함유하는 미리 가온 된 24 웰 플레이트로 에서야 장소 중족골. 최대 14 일 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 문화 중족골. 참고 :이 자신의 광물 기능 (26)에 영향을 미치는으로 문화의 적어도 5 일까지 E15 문화의 미디어를 변경하지 마십시오. 이에 대한 이유는 불분명하지만, 선형 성장 매트릭스 광물은 중족골 해제 성장 인자에 의한 자극에 의존 할 수있다. </li></ol> 4. 분석 및 중족골 문화의 조작 <ol><li> 해부 (0 일)의 날 디지털 카메라 부착 및 이미지 분석 소프트웨어와 함께 현미경을 사용하여 초기 길이 측정을합니다. 그것은 문화의 몇 일 후에 나타날 때 중앙 광물 영역의 길이를 측정합니다. </li><li> 필요에 따라 주기적으로, 어떤 점 m에서 문화의 마지막 날까지 (보통 매일 2 회 일) 추가로 측정을etatarsal 뼈 (소개에서 설명)가 필요합니다 결과에 의존 처리됩니다. </li><li> 다양한 외생 적 요인 중족골 기관 배양의 보충 매체는 성장 인자, 호르몬과 문화 (22, 24)의 일 0에서 약리 에이전트를 예. 이러한 종류의 모든 연구에서 치료 중족골이 필요합니다 제어 할 수 있습니다. 참고 :이 제어 뼈가 반대쪽 다리에서 해당 퇴화 것을 권장하지만, 선형 성장 또는 배양 E15 2 차의 광물 잠재력에 어떤 차이가 없었다, 3 번째와 4 번째 중족골 (아래 참조, 그림 2) . </li></ol>

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쥐의 배아 중족골의 문화는 연골의 성장과 광물의 높은 생리 학적 모델을 제공합니다. 초기 연구는 E15 마우스 중족골이 골격의 성장과 분화의 정상적인 패턴을 겪는 것을 확인했다. 연골 (연골) 및 뼈 (조골 세포와 파골 세포) 세포 및 해당 콜라겐 매트릭스는 생체 내에서 관찰 된 것과 구별된다. 그러나,이 모델의 어떤 인식 된 제한이있다. 파골 세포 분화의 속도는 (그러나 연골 분화를 생략)이다 뼈 성장을 손상한다. 뼈 성장을 생체 내에서 관찰되는 것보다 약 50 % 느린와 로컬 요인 (예를 들어, IGF-1, BMP 형식 등) (31)의 생산에 영향을 미치는 요인으로 전신 결핍에 기인 할 수있다. 또한, 잘 뼈 기계적 환경에 민감한 것으로 인식되고, 이는 또한 C 응답 배양 중족골에 대한 경우이다기계적로드 (32, 33)에 hanges. 따라서, 언로드 상황으로서이 프로토콜 광물에 기재된 미네랄 흡수가 손상 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 중족골 모델 직접 관내 배양 시스템에서 2D와 3D로 불가능 선형 뼈의 성장을 측정하는 능력을 제공한다. 우리는 처음 참 E15 쥐 중족골과의 박리 및 배양에 관련된 프로토콜의 포괄적 인 설명을 제공하고, 실험 2 차, 3 차 및 4 차 중족골 풀링의 유효성을 확인한다. E17 / E18에서 중족골은 일반적으로 (문화 십사일 이상, 즉) 오랜 기간 동안 생체 성장을 자신의 특별한 잠재력으로 인해 뼈 성장의 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다. 이들은 배아 종 뼈 성장에 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 확립 된 모델이다.또한, 생후 중족골의 절개 및 배양 일반적으로는 산후 뼈의 성장 및 태아의 뼈 성장 21 다르게 조절되는 것을 알 수있는 바와 같이 산후 뼈 성장을 둘러싼 메커니즘을 묘사하는데 사용된다. 배양 출생 중족골에서 관찰 된 뼈의 성장은 장기간의 연구에서 자신의 잠재력을 제한하고이 출생 후의 단계에서 뼈의 성장에 더 체계적인 영향을 강조하지만 배아 초보 25,34에서 관찰 된 것보다 훨씬 작다. 실제로, 마우스 3 일된 생후 중족골는 일반적으로 측정 성장 34를 얻는데 사용될 수있는 최신 단계이다. 여기에서 우리는 E15에서 배아 중족골 뼈의 분리에 대한 우리의 프로토콜을 설명합니다. E15의 중족골에 hydroxyapaptite 미네랄의 부재는 또한 길이 비교할 뼈 성장을 둘러싸뿐만 메커니즘을 조사하는 모델이지만 개시를 제공하는 것을 의미골격 광물. 터미널 비대 연골 세포 영역의 광물 행렬은 이후 광물 인 뼈 특정 매트릭스 (유골)을 누워 골아 세포 침입을위한 발판을 제공하고, 이러한 초기 광물로 성공적이고 기능적인 골 형성 (35)에 매우 중요합니다. 실제로 E15의 중족골을 이용하여 최근 보고서 수는 광물 처리 28,36,37의 조사를 위해 자신의 독특한 능력을 확인했다. 또한, 연구진은 뼈 성장 / 광물 설정 외부 모델로서 배아 중족골의 전위를 강조 혈관 (38)의 모델로 E15의 중족골의 사용을 설명했다. 우리가 설명하는 프로토콜은 층류 후드, 절개를 수행하기위한 해부 현미경 및 적출 초보의 문화에 대한 CO 2 배양기를 포함한 만 표준 실험실 장비를 필요로한다. 또한, 아주 기본적인 막 다른매체 αMEM, BSA, 항생제, 항진균제 및 L- 아스 코르 빈산 함유 진짜야 (하이드 록시 프롤린 및 히드 록시 리신의 합성 공동 인자, 콜라겐 (39)의 생산을위한 두 가지 필수 아미노산) 등의 동물 혈청로서 정의 첨가제의 사용을 피 . 전통적으로, 연구자들은 문화 배아 중족골에 사용되는 미디어에 βGP을 추가 한하지만 우리의 결과에 계시, 추가로 인산 소스의 사용이 문화 시스템의 성공적인 광물 필요하지 않습니다. 이 ECM 광물을 뒷받침하는 메커니즘을 이해하는 우리의 추구에서 중요한 발견이다. 중족골 이전 긴 뼈 (40)의 발달 조절에 성장 인자 β를 변화시키는 역할을 탐색 된 Smad2의 우성 음성 형태를 포함하는 아데노 바이러스로 감염되었다. 여기에서 우리는 t을 나타내는 GFP 바이러스 입자 야생형 E15의 중족골 뼈의 성공적인 형질 공개모자 렌티 기술 용이 중족골 배양에서 유전자 발현을 조작하기 위해 채택 될 수있다. 마찬가지로, 중족골 기관 배양 물 시스템은 더 골 성장 과정에서 특정 유전자의 역할을 이해하기 위해 유전자 변형 마우스의 뼈의 성장을 비교하기에 우수한 모델이다. 이전의 연구는 연골 내 골 성장 사이토 카인 시그널링 억제 -2- (SOCS2)의 역할을 결정하기 위해 중족골 기관 배양 시스템을 사용하고있다. SOCS2의 결핍 마우스에서 중족골 뼈를 사용하여, 그 성장 호르몬은 성장 인자와 같은 인슐린 그들의 길이 성장 독립적를 시뮬레이션 할 수있다 나타났다 (IGF-1), 성장 호르몬 치료 (34)에 반응하지 않는 야생형 중족골 달리 41. 이것은 중족골 배양 상이한 유전자 및 / 또는 연골 내 골 성장 외인성 요인의 영향을 조사하기 위해 조작 될 수있는 정도를 강조한다. 요약하면, 우리는 detai이조작 할 수있다 배아 중족골 뼈의 성공적인 추출 및 배양하는 방법을지도하고 다양한 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 생체 모델은 따라서 단일 층 또는 3 차원 배양 세포보다 더 생리 학적 모델을 제공 할뿐만 아니라 연골의 다른 단계에서 연골 세포가 들어 있으므로, 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 에릭손 기관 배양 따라서 연골 골화을 담당하는 분자 메커니즘을 조사에 대해 고유 한 모델이며, 뼈 생리학 및 병태 생리 양에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 필수적이다

골격 이온 항상성에 걸쳐 운동에서 다양한 기능을 갖는 고도로 복잡 동적 복잡한 기관이다. 뼈와 연골의 구성, 골격은, 구조 생화학 적 및 기계적 무결성 1의 유지 운영 기능적으로 서로 다른 세포 집단으로 구성되어 있습니다. 골격의 주요 기능 중 하나는 발전 및 성장의 역할이다. 이러한 프로세스는 꽉 내분비 및 유전 적 제어를 통해 규제하는 여러 세포 인구의 오케스트레이션을 필요로한다. 평탄 뼈 예 견갑골, 두개골 및 흉골 제외한 포유류 골격 연골 내 골화으로 알려진 과정을 통해 형성된다. 조절 분자 둘 공간적이 프로세스는, 중배엽이 주로 유래 중간 엽 세포의 축합으로 시작한다. 전사 인자의 SOX9의 영향으로, 세포 일에응축의 전자 내부 표현 및 유형 II 콜라겐과 aggrecan과 같은 연골 특정 세포 외 기질 (ECM) 성분을 분비, 연골 세포로 분화. 응축의 마진에서 세포는 미래의 뼈 3 서술, I 콜라겐과 연골막을 형성 유형을 표현한다. 나중에, 연골막의 osteoprogenitors는 전사 인자, Runx2와 osterix 4의 발현 감독, 조골 세포로 분화. 이 조골 세포의 우위로 연결이 층은 뼈의 중간 부분 주변의 광물 뼈 고리를 형성하는 골막을 이름이 변경됩니다. 연골 지지체의 골막과 침략의 혈관 침투, 그것으로 데려 haematopoetically 연골 세포 잔해와 연골 매트릭스 (5)의 많은 부분을 재 흡수 뼈 재 흡수 세포, 파골 세포를 유도 발생합니다. 형성된 공간은 일차 골화에 야기한 osteoprogenitors 의해 채워진다점진적으로 골간의 핵심을 차지하고 골막와 합병 센터. 기타 세포는 골수 일으킨다. 출생 주변 혈관 osteoprogenitors 이차 골화 중심을 형성하는 현상 골간의 양측 (골단)에서 다양한 연골 매트릭스를 관통. 골단 성장판 - - 모든 긴 뼈 (6)의 선형 성장을 조정하는 책임이있는 긴 뼈의 양쪽 끝에서 골단과 골간 사이에 위치한 연골의 밴드이다. 성장판에서 연골 세포는 처음 증식 및 이후 전사 및 성장 인자의 연속 식으로 조정 형태 학적으로 서로 다른 영역을 통해 진행. 이러한 일련의 이벤트의 절정이 연골 전구체의 중심 연골 세포의 세포주기 및 비대에서 출구이다. 비대 연골 세포 강력 X 형 콜라겐 매트릭스 메탈로 표현-13 (MMP13)와 종 방향 성장의 방향으로 자신의 상당한 볼륨 확대는 포유 동물 7,8에서 뼈의 성장에 가장 큰 기여를 제공합니다. 또한, 비후성 연골 매트릭스 소체의 방출을 통해 주변 ECM을 무기화 멤브레인 경계 구조는 포스파타제의 포함 (조직 비특이적 알칼리 포스파타제 (TNAP) 및 PHOSPHO1) 칼슘 채널링 단백질 (annexins 통해 비정질 인산 칼슘의 제조에 전문 ) 9-11. 이 석회화 연골은 파골 세포의 모집 및 매트릭스 흡수의 결과로 기본 골수에서 혈관에 의해 침략된다. 이것은 그들이 빠르게 광물이다 유골의 층을 아래로 누워 석회화 연골 잔재의 표면에 조골 세포의 이동 및 정렬옵니다. 기본 spongiosa의 짠 뼈는 나중에 보조 spongiosa (12)의 층상 뼈 리모델링된다. 에 골단 융합 결과연골 골화 (13)의 중단. 교란 현상 및 / 또는 뼈의 성장 길이 14을 방지하도록 연골 내 골화 많은 호르몬 분비 호르몬 및 성장 인자에 의해 엄격한 규제 받고있다. 이러한 프로세스를 뒷받침 분자 및 세포 메커니즘의 이해는 인간의 이익으로 임상 발전의 추구에 따라서 필수적이다. 유사점과 다른 나이, 위치와 종의 성장 판 사이의 차이에 대한 이전의 연구는 크게 성장판 역학 (15, 16)을 둘러싼 생리 학적 메커니즘에 대한 우리의 이해를 향상되었습니다. 자신의 환경에서 연골 세포의 제거는 Col2a1 (17)와 같은 주요 마커의 발현 감소와 함께, 탈분화로 이어질 수 그러나 고립 된 연골 세포의 연구는 어렵다. 마우스 에릭손 기관 체외 이식편 문화, 파이네덜란드의 교수 엘리자베스 버거와 동료에 의해 oneered, 문화 생체 (18)에서 본 것을 모방 뼈의 성장 속도로 연골 골화와 뼈의 성장을 연구하기위한 고도의 생리적 생체 모델입니다. 유니 클리, 중족골 기관 배양 따라서 문화 19 ~ 21 세포에 비해 생체 내 상황에 가까운 조건을 제공 연골의 다른 단계에서 연골 세포의 시험을 허용하고 세포 - 세포 및 세포 - 기질 상호 작용을 유지합니다. 또한,이 모델은 기본 연골 세포 배양에서 수 없습니다 선형 뼈의 성장을 직접 검사 수 있습니다. 또한 따라서 성장판 로컬 효과의 구체적인 분석을 허용 조직 및 지방 요소의 분리를 허용한다. 중족골의 문화는 다양한 매개 변수의 조사를 할 수 있습니다. 전체 길이와의 광물 지역의 일일 측정초보 표준 위상차 현미경과 화상 해석 소프트웨어로 수행 될 수있다. 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 염색의 조직학은 용이 셀룰러 분자 실체, 기존의 세포 배양 방법에 비해 큰 장점의 공간 해상도를 허용 중족골 부에서 수행 될 수있다. 면역 조직 화학적 방법은 연골 세포 (22) 증식에 의한 탐지 및 5- 브로 모 -2&#39;- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 정량화를 포함한다. 또한 중족골 조직의 추가적인 처리는 mRNA 발현 (RT-qPCR에), 단백질 및 세포 내 신호 분석 (웨스턴 블롯) 또는 지질 조성물 (질량 분석법) 하류의 분석을 허용하도록하여 수행 될 수있다. 현재까지 대부분의 연구는 산후 동물에서 배양 된 배아 중족골이 아닌 중족골을 사용합니다. 그들은 빠르게 성장하고 EXPLO 수 있습니다 : 두 모델은 정보가 될 수하는 동안, 배아 뼈의 연구는 몇 가지 장점이 있습니다제한없는이 광물 처리 23-25의 개시 및 진행을 공부합니다. 이 프로토콜은 구체적으로 배아 일 15 (E15) 쥐의 배아의 뒷다리에서 배아 중족골의 복잡한 해부에 대해 설명합니다. 또한, 해부학 적으로 별개의 중족골의 성장과 광물이 표시됩니다.

<table><tbody><tr><td>해부 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>오토클레이브 사용 전 살균</td></tr><tr><td>Dumont #5 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>500342</td><td>오토클레이브 사용 전 살균</td></tr><tr><td>Dumont #4 핀셋</td><td>World Precision Instruments</td><td>500339</td><td>오토클레이브 사용 전 살균</td></tr><tr><td>SuperFine Vannas 가위</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td>501778</tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/17</td> 뉴클레오시드 없이 <td>dH<2/sub>O&alpha;-MEM에서 70% v/v로 희석</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22561021 소 혈청 알부민</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 (0.22 &mu; m) 직경 33 mm</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>포스 포콜린 클로라이드 칼슘 염 사수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P0378</td><td>실험 전에 미디어에 직접 추가</td></tr><tr><td>L-아스코르브 산 -2- 인산</td>염 <td>시그마 알드리치</td><td>A8960</td><td>5mg / ml 및 -20 °deg에서 분취를 구성합니다. C</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C5080</td><td>150mM에서 재고 soution을 구성하고 -20 &deg에서 부분 표본을 구성합니다. C</td></tr><tr><td>&beta;-글리세로인산염 디소듐 염 수화물</td><td>시그마 알드리치</td><td>G9422</td><td>1mM에서 스톡 soution을 구성하고 -20에서 분취를 합니다. C</td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>15710049</tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>써모 피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td></td><td></td>15290018</tr><tr><td>Nunc 세포 배양 처리된 24웰 플레이트</td><td>Thermo Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>폴리브레인</td><td>시그마 알드리치</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>써모 피셔 과학&nbsp;</td><td>D3571</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

내연골화의 근본적인 과정은 건강한 개인에게 엄격하게 조절되어 발달 장애 및/또는 종방향 뼈 성장을 방지합니다. 따라서 인간과 동물의 환자에게 혜택을 주는 방향으로 진전을 이루기 위해 이러한 장애와 관련된 기본 분자 메커니즘에 대한 이해를 심화하는 것이 필수적입니다. 마우스 중족골 장기 적출 배양은 배양에서 관찰된 뼈의 성장 속도가 생체 내에서 관찰된 것을 모방함에 따라 내연골 골화 및 뼈 성장을 연구하기 위한 매우 생리학적인 생체 외 모델입니다. 독특하게도, 중족골 장기 배양은 연골 형성의 여러 단계에서 연골 세포를 검사할 수 있고 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 유지하므로 단층 또는 3D 배양의 세포보다 생체 내 상황에 더 가까운 조건을 제공합니다. 이 프로토콜은 E15 쥐 배아의 뒷다리에서 배아 중족골의 복잡한 해부와 연골내 골화 및 종방향 뼈 성장을 조사하기 위해 수행할 수 있는 후속 분석을 자세히 설명합니다.

이 방법의 목적은 길이 방향의 뼈의 성장과 ECM 광물의 검사를 위해 배아 중족골과 문화를 분리하는 것이 었습니다. 광학 현미경에 의해 가시화로 본원에 기술 된 프로토콜을 사용하여 배아 중족골 성공적 해부 하였다. 그림 1에 나타낸 바와 같이 실시 중족골 뼈의 측정은, 자신의 ECM 세로 길이 성장하고 무기화 할 능력 나타났다 (그림 2, 3). 행렬의 광물 먼저 뼈 퇴화의 중간 골간에 언급되어 쉽게 광학 현미경으로 관찰된다. 칼 세인의 흡수가 새로 형성된 광물의 향상된 시각화를 제공 할 수 있지만, 어떤 염색이 필요하지 않습니다. 날짜 22,27,28에 배아 중족골을 이용한 연구가 해부 2 차를 풀링 한 3 번째와 4 번째 (CENTRAL 세) 중족골은 체외 성장과 광물에서 가정하는 것은 비교할 수 있습니다. 쥐 중족골의 생체 발달은, 그러나, 3 번째와 4 번째 자리가 이전에 다른 모든 중족골과 지골 (29)에 광물의 증거를 가지고 있음을 알 수있다. 개별적으로 분리 및 배양 E15 2 차의 성장과 광물 잠재력의 평가, 3 번째와 4 번째 중족골 문화 7 일 (그림 2) 후 광물의 모양이나 정도에 유의 한 차이를 보이지 않았다. 베이스 라인에서 백분율 증가의 차이는 배양 기간 동안 발견되지 않았다. 광물 전위의 차이가 관찰되지되었을 때 2 차 3 차 4 번째 중족골 풀링의 표준 프로토콜 미래 연구를위한 유효 나타납니다. 전통적으로, 연구자들은 미디어에 βGP 추가ECM 광물을 촉진하기 위해 문화 배아 중족골에 사용됩니다. 그러나, 세포 배양 실험에서, TNAP βGP 효소를 함유하는 골 형성 배지에 첨가하면, 히드 록시 아파타이트 이소성 무기물 증착에도 여전히 셀 (30)의 부재에서 발생하는 것으로 나타났다. 에릭손 광물 기능에 다양한 광물 기판 및 작용제의 효과를 조사하기 위해, 우리는 보충의 범위를 포함하는 배양 배지에서 E15의 중족골을 배양, 이미지 및 길이 측정은 매일 기록 하였다. 결과 E15 중족골 뼈가 계속 성장 βGP의 부재들은 ECM을 무기화 것으로 나타났다. 중족골이 βGP (그림 3)의 존재하에 배양로 아스 코르 빈산에서 배양 E15 중족골 뼈는 미디어 길이와 광물에 필적하는 증가를 보였다. 또한 렌티 바이러스를 배양 metata로 외래 DNA를 형질 사용될 수 있음을 보여 주었다rsals. 여기에서 우리는 성공적으로 중족골 당 2 × 10 6 녹색 형광 단백질 (GFP) 바이러스 입자와 문화 (해부의 예 일)의 일 0에 중족골 뼈를 형질 전환. 바이러스 전달을 사용하려면, 폴리 브렌 동시에 1 문화에 추가되었습니다 : 500. 문화는 공 초점 현미경 (사용 4로 배양되기 전에 발생하는 E15의 에릭손 광물에 필요한 5 분 동안 6 diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 얼룩, &#39;더 미디어 변화에 7 일 동안 방치 한 후 직접 시각화 하였다 그림 4). 개념 실험의 우리의 증거가 명확 효과적인 전달을 보여줍니다. 그러나 그들의 형질 효과적인 유전자 조작을 평가 중족골의 전체에 걸쳐 부분을 검사 신중하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig1.jpg" /> 그림 1 : 표준 방법론 t를 측정하는 데 사용그 길이와 배아 중족골의 무기화 영역. (A) 문화의 날 0에 E15의 중족골의 총 길이 측정 (해부의 날) 중족골의 중심을 촬영. 문화 칠일 후 중족골의 총 길이 방향의 길이 (B) 측정. 중족골에서 약간의 곡률을합니다. (C) 문화 7 일 후에 광물 영역 길이의 측정. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig2.jpg" /> E15 마우스의 뒷다리 w에서 성장과 해부학 고유 E15 중족골 이미징의 광물 용량 및 제 2의 측정, 3, 4 중족골 : 그림 2.수행으로. (A) 배양 기간 동안 2, 3, 4 중족골의 직렬 이미지. 문화의 매일의 일 0에서 길이 (B) 비율 증가. 배양 기간 동안 제 2, 3, 4 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로서 표시된다 (N = 6). (D) 문화의 매일의 C57BL / 6J 중족골의 길이. 데이터는 표시되는 평균 ± 표준 편차 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig3.jpg" /> 그림 3 : 야생 형 성장 광물 화 용량각종 골 형성 매질에서 E15 중족골 배양 하였다. (A) 만 아스코르브 산, 1mM의 βGP 3 밀리미터 포스 포 콜린, 1.5 mM의 염화칼슘 또는 매체를 포함하는 3 mM의 염화칼슘 배양 중족골의 일련의 이미지. 중족골의 일 0 길이 (B)의 백분율 증가는 다양한 보조제 배양 하였다. 다양한 매체에서 배양 중족골의 (C) 미네랄 길이 중족골 총 길이의 비율로 나타냈다. 데이터는 평균 ± 등을 평균의 표준 오차 (SEM)에 표시된다 (N = 6). 블랙 바 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54978/54978fig4.jpg" /> 그림 4 : GFP 바이러스 P와 E15 중족골의 형질기사. (A) E15 중족골 뼈는 개념의 증거에 대한 GFP 바이러스 입자로 형질 감염시켰다. (B) 뼈는 DNA의 시각화를위한 DAPI로 염색 하였다. (C) 이중 이미지는 중족골의 전체에 걸쳐 GFP 바이러스의 성공적인 형질 감염을 나타내었다. 화이트 바 = 0.5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54978/54978fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 배아 15일(E15) 쥐 중족골을 해부하고 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 고도의 생리학적 체외골화 모델은 단층 또는 3D 배양의 세포보다 체내 상황에 더 가까운 조건을 제공하며 뼈 성장 및 발달을 조사하는 데 필수적인 도구입니다.

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 배아 생쥐의 중족골을 분리 및 배양하여 연골내골화 성장과 광물화 연구를 위한 ex vivo 모델을 제공하는 것입니다. 이 방법은 긴 뼈가 성장하는 과정인 연골내골화에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특히, 골격 광물화 시작 기전을 조사하는 데 매우 적합합니다.이 기술의 주요 장점은 세포 간 및 세포-기질 간 상호작용을 유지함으로써, 2D 또는 3D 배양 세포와 비교하여 연골내 골화의 더 생리적인 모델을 제공한다는 것입니다. 먼저, alpha minimum essential media를 PBS로 1:13 비율로 희석하여 박리 배지를 준비하십시오. 다음으로, BSA를 2 mg/mL 농도로 재현탁한 후 시린지 필터로 멸균 여과하십시오.그 다음, 배양액을 준비하고 BSA에 사용했던 것과 동일한 유형의 시린지 필터를 사용하여 여과 멸균합니다. 배양액의 여과가 끝나면, 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 배양액 300 microliters를 분주합니다. 이어서, 배양액이 담긴 24웰 플레이트와 해부용 배지를 인큐베이터에 넣고 최소 1시간 동안 평형화시킵니다.그런 다음, 오토클레이브 멸균한 해부 도구를 70% ethanol에 담급니다. 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 E15 야생형 C57 black 6J 배아를 준비하여 해부 배지가 담긴 페트리 접시에 놓습니다. 머리를 제거한 후, 피부를 70% ethanol로 세척하고 Vannas 미세 가위를 사용하여 대퇴골 근위부 주변을 절개함으로써 배아로부터 뒷다리를 제거합니다.이렇게 하면 뒷다리의 최대한 많은 부분을 제거할 수 있습니다. 중족골 해부 전, 뒷다리를 페트리 접시에 넣고 해부 배지에 담급니다. 그 후, 해부 현미경 아래에 배치합니다.4번 핀셋을 사용하여 사지를 고정하고, 5번 핀셋으로 배아 발 주변의 피부를 제거합니다. 이 과정은 경골 수준의 피부를 잡고 지골 방향으로 당겨서 수행하는 것이 가장 효과적입니다. 다음으로, 4번 핀셋으로 배아 발의 족근골을 조심스럽게 잡고, 5번 핀셋을 사용하여 제1 및 제5 중족골을 제거하여 버립니다.발을 동일한 위치에 고정한 상태에서, 5번 핀셋을 사용하여 남은 세 개의 지절골과 중족골 사이의 결합 조직을 분리합니다. 그런 다음, 5번 핀셋의 끝을 지절골과 중족골 사이의 관절에 삽입하여 중족골에서 지절골을 제거합니다. 마지막으로, 5번 핀셋을 사용하여 타르살골(족근골)과 중족골 사이의 결합 조직을 분리합니다.다시 한번, 5번 핀셋의 끝을 tarsals와 metatarsals 사이의 관절 공간에 놓고 metatarsals를 tarsals로부터 조심스럽게 분리합니다. 그런 다음, 분리된 metatarsals를 4번 핀셋으로 조심스럽게 집어 올려 새로운 해부 배지에 넣습니다. 해부 및 취급 단계 동안 배아의 metatarsals가 손상되거나 건조해지지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다.중족골의 손상은 성장과 무기질화에 영향을 미칩니다. 남아있는 연조직은 배양 과정에서 중족골로부터 분리되므로, 해부 시 완전히 제거하는 것에 너무 신경 쓰지 않아도 됩니다. 필요한 모든 중족골을 해부한 후, 300 µL의 배양액이 들어있고 미리 가온된 24-well 플레이트에 중족골을 각각 조심스럽게 넣으십시오.다음으로, 디지털 카메라가 장착된 현미경과 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 초기 길이 측정을 수행합니다. 중족골을 최대 14일 동안 배양합니다. 단, E15 배양물의 경우 배양 5일째까지는 배지를 교체하지 마십시오. 이는 무기질화 능력에 영향을 미치기 때문입니다.배양 후 며칠이 지나 중앙 광화 구역이 나타나면 그 길이를 측정합니다. 배양 후 며칠이 지나면 뼈 원기의 중앙 골간에서 매트릭스의 광화가 일어나며, 이는 광학 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있습니다. 배아 연구 시에는 보통 두 번째, 세 번째, 네 번째 중족골을 한데 모아 분석합니다.7일간의 배양을 통해 두 번째, 세 번째 및 네 번째 중족골의 광물화 양상이나 범위에서 유의미한 차이가 나타나지 않았으며, 이는 이 실험 방법의 타당성을 입증합니다. 다양한 광물화 기질 및 작용제가 중족골의 광물화 능력에 미치는 영향을 조사하기 위해, 여기에 표시된 것과 같이 다양한 보충제가 포함된 배지에서 E15 중족골을 배양하였습니다. 이미지 촬영과 길이 측정은 매일 기록되었습니다.테스트한 모든 기질 중에서, ascorbic acid가 mineral 길이를 가장 많이 증가시켰으며 beta-glycerolphosphate의 효과와 가장 유사했습니다. E15 중족골에 GFP plasmid를 렌티바이러스로 형질전환한 결과, 중족골 전체에서 GFP가 발현되었습니다. 이는 배아 중족골을 성공적으로 형질전환하기 위한 렌티바이러스의 활용 가능성을 강조합니다.이 기술은 표적 유전자를 넉다운하거나 과발현시키는 데에도 사용될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, E15 중족골은 매우 취약하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 중족골의 무결성을 유지하는 것이 이후의 배양 성공에 있어 가장 중요합니다.E15 중족골의 박리 및 배양이 완료된 후, 다양한 하위 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, RT-qPCR과 Western blotting을 통해 각각 mRNA 및 단백질 발현을 평가할 수 있습니다. 또한, 면역조직화학 염색을 이용하여 중족골 내 단백질의 위치를 파악할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 배아 15일차 생쥐의 뒷다리에서 중족골을 성공적으로 해부하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 골 성장 연구에 더 유용한 배아 17일차 또는 18일차 중족골에도 적용할 수 있습니다.

culture-murine-embryonic-metatarsals-physiological-model-endochondral

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

동물 모델은 생물 의학 연구에서 심각한 뼈 손상을 모방하기 위해 자주 사용됩니다. 크기가 작기 때문에 생쥐에서 안정화된 뼈 병변을 확립하는 것은 대부분의 연구 그룹의 능력을 넘어섭니다. 여기에서는 마우스의 실험적 대퇴골 결함을 확인하고 분석하는 간단한 방법을 설명합니다.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

이 프로토콜 분석 endochondral 뼈 쥐에서 치유 하는 데 사용할 수 있습니다 대 퇴 골 골절의 표준화 된 안정화를 위한 intramedullary 나사를 사용 하 여 최소 침 습 osteosynthesis 기술을 설명 합니다.

Endochondral 골절 표준화 된 Biomechanical 조건 하에서 쥐에서 치유를 분석 하는 최소 침 습 모델

여기, 선물이 배아 치킨 장기 성장 프로토콜을 경작 하는 organotypic 생체 외에서. 이 메서드를 사용 하 여 미 발달 닭 조직 개발 수 수 공부, 문화 환경에 통제의 고차를 유지 하면서.

Organotypic 문화 메서드 배아 치킨 조직 개발 연구를

Murine 닫힌된 대 퇴 골절 모델 골절 치유를 공부 하는 강력한 플랫폼 이며 뼈 재생을 촉진 하는 새로운 치료 전략. 이 수술 프로토콜의 목표는 일방적인 폐쇄 대 퇴 골절 대 퇴 골을 안정화 하는 intramedullary 강철 막대를 사용 하 여 마우스에 생성.

마우스에 닫힌된 대 퇴 골절의 발생: 뼈 치유 연구 모델

여기서, 우리는 생체 내 과정을 다시 캡처하는 동안 제어 된 조건에서 뼈 및 연골 발달 및 항상성 분석에 적합 한 태아 및 신생 단계에서 긴 뮤 린 뼈의 생체 내 배양을 위한 방법을 제시 한다.

태아와 신생아 뮤 린 긴 뼈를 배양 하 고 측정

여기에서, 우리는 형광 성 면역 조직 화학 및 순차적인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 분석된 포유류 배반증 의 형성 및 intramembranous 골화를 조사하기 위하여 성숙한 마우스 말두 지골 절단의 프로토콜을 제시합니다.

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

이 프로토콜은 골절 치유 연구를 위해 골수 내 와이어로 안정화된 마우스의 대퇴골에 골절 골절을 확립하기 위한 수술 절차를 설명합니다.

마우스에서 Diaphyseal 대퇴골 골절 모델 확립

중간엽 줄기세포에서 생산된 인공 연골 조직을 이식하여 내연골 골화를 통한 뼈 치료는 기존 치료법의 단점을 우회할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 히알루론산 하이드로겔은 균일하게 분화된 연골 이식편을 확대하고 생체 내에서 융합된 이식편 사이에 혈관을 형성하여 통합된 뼈를 만드는 데 효과적입니다.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

이 프로토콜은 청소년 뼈 성장판 손상에 대한 개선된 마우스 모델을 설명합니다. 성장판의 3개의 서로 다른 하층과 관련된 주요 매트릭스인 콜라겐 유형 I, II 및 X에 대한 삼계 형광 리포터가 있는 형질전환 마우스를 사용하여 현미경 아래의 기본 형광에 의해 손상 배치를 안내합니다.

성장판 손상을 연구하기 위한 Tricolor Transgenic Murine 모델

쥐 골수 손상 모델은 막내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 단순화된 수술 프로토콜은 새로운 뼈 형성 및 손상 후 세포 반응의 다운스트림 평가를 위한 골수 절제 절차를 설명합니다.

쥐 골수 손상 모델에서 골수내 골화를 통한 출생 후 골형성을 연구하기 위한 개선된 방법론

배우세요 쥐 배아 중족골 배양을 통해 연골 골화의 생리학적 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 뼈 성장과 석회화 과정을 생체에 가까운 조건에서 분석할 수 있는 유용한 모델을 제공합니다.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

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