Name: 마우스의 조직 변위에 근거한 척수 손상 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 학습하세요 조직 변위 기반 척수 손상 모델을 사용하여 성체 마우스에서 일관된 타박상 손상을 유도하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 재현 가능한 결과를 제공하며 치료 전략 개발에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 부분적으로 NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; 미 육군 참전 용사 부 (Department of Veterans Affairs)의 우수 리뷰 상 I01 BX002356; Craig H Neilsen Foundation 296749; 인디애나 척수 및 뇌 손상 연구 재단 및 Mari Hulman George 기증 기금 (XMX); 노턴 헬스 케어, 루이스 빌, 켄터키 주 (YPZ); 인디애나 주 ISDH 13679 (XW); 및 NeuroCures 재단.

모든 수술 및 동물 취급 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 안내서 (National Research Council) 및 Indiana University School of Institutional Animal Care and Use Committee의 지침에 따라 승인 된대로 수행되었습니다. 1. 동물 준비 및 T10 척추 절제술 시행 <ol><li> 외과 용기구와 금속 등뼈 안정제를 고압 증기 멸균기에서 소독하십시오. 수술 용 수술대를 청소하십시오. 가열 패드를 37 ° C로 따뜻하게합니다. 발열 패드를 수술대 위에 놓고 무균 수술 용 커튼으로 덮습니다. 수술 중 멸균 기술을 사용하십시오. </li><li> 이 연구를 위해 10 주 된 여성 젊은 성인 C57 / 6J 마우스를 사용하십시오. 케타민 (87.7 MG / kg)과 xylazine (12.3 mg / kg) 혼합물의 복강 내 (ip) 주사로 각 동물을 마취. paw pinch-induced nociception stimulation에 아무런 반응이 없으면 완전한 마취를 확인하십시오. </stro<html> ng&gt; <ol><li> 진통제 인 buprenorphine (0.01-0.05 mg / kg)과 비 스테로이드 성 항염증제 인 carprofen (5 mg / kg)을 피하 투여합니다. </li></ol></li><li> 전기 깎기를 사용하여 흉 요추 척추 위로 머리카락을 면도하십시오. 베타 인 용액과 70 % 알콜 와이프로 피부를 문질러주십시오. </li><li> 수술 중 눈이 건조 해지지 않도록 각막에 안과 용 연고를 바르십시오. </li><li> 메스를 사용하여 동물의 뒷면에 1.5cm의 정중선 피부 절개를 만들어 9 번째 에서 11 번째 흉추 척추를 노출시킵니다. 피하 지방 조직을 가식적으로 밉니다. 각 측면의 측면면쪽으로 관절면 근육을 가시 돌기와 박판에서 해부합니다. </li><li> 마우스를 안정제의 U 형 홈에 위치시킵니다 ( 그림 2A 및 2B ). T10 척추골의 노출 된면 아래에 스테인레스 스틸 암을 양측으로 클램핑합니다 (g &quot;&gt; 그림 4A) 팔에 부착 된 손잡이 나사를 사용하여 조입니다 ( 그림 2A ). </li><li> 척수를 덮고있는 경막을 노출시키는 마이크로 - 근관을 사용하여 T10의 척추의 과정과 박판 (박판 절제술)을 제거하십시오 ( 그림 4B ). </li></ol> 2. LISA 임팩터를 사용하여 T10 뇌염 상해 수행 <ol><li> 질소 탱크에서 압력 조절기의 노브를 돌려 압축 질소를 20 PSI 또는 138 kPa로 설정하십시오 ( 그림 1A ). 참고 : 압력은 10-120 PSI에서 조절할 수 있습니다. 압력이 높을수록 속도가 더 빨라집니다. 직경 1.2mm의 SCI 장치 팁은 쥐를 위해 설계되었으며, 직경 2.2mm의 팁은 쥐를 위해 설계되었습니다. 생쥐에서 쥐로 바꿀 때 금속 팁 (id 1.2 mm / od 2.2 mm)에 링을 추가하여 더 큰 직경의 팁을 만들 수 있습니다. 이 마우스 SCI에서 1.2 mm 팁을 사용했습니다.tudy. 사용하기 전에 SCI 팁을 소독하십시오. </li><li> 컴퓨터를 켜서 소프트웨어를 시작하십시오. 임팩터 팁을 완전히 펼친 위치로 활성화하려면 버튼 1 ( 그림 1B )을 누릅니다 ( 그림 3A -1 ). 참고 : 버튼 1의 기능은 공압 실린더를 수동으로 활성화 또는 비활성화하는 것입니다. </li><li> 무대에 마우스가있는 U 자형 컨테이너를 놓습니다 ( 그림 2B ). 마운트의 엄지 나사를 조여서 스테이지를 고정시킵니다 ( 그림 2B ). </li><li> &quot;SET ZERO LEVEL&quot;구역 (녹색)에서 &quot;START READING&quot;버튼 ( 그림 3A )을 클릭하여 완전히 확장 된 플런저 팁까지의 거리를 측정하는 레이저 센서로 제로 레벨을 설정하십시오. 거리는이 구역의 &quot;범위&quot;매개 변수에 표시됩니다 ( 그림 3A ). &quot;SET ZERO&quot;버튼을 클릭하십시오 ( <stron그림 3A), &quot;0&quot;매개 변수 상자에 mm 단위의 숫자가 표시됩니다 ( 예 : 8.951mm, 그림 3A 참조 ). </li><li> 버튼 1 ( 그림 1B )을 눌러 임팩터 팁 ( 그림 3B -1 , 위쪽 화살표로 표시)을 빼고 나사 1 ( 그림 2B )의 잠금을 풉니 다. 나사를 오른쪽 위치로 잡아 당겨 ( 그림 3B -1 , 옆 화살표로 표시) 팁을 레이저 광선 경로에서 멀리 이동시키고 나사를 90 ° 시계 방향으로 돌려 나사를 잠급니다. </li><li> 정면 및 측면 마이크로 드라이버 ( 그림 1C )를 조정하여 무대를 움직여 레이저 광선을 노출 된 척수 척추의 중심으로 향하게합니다. 부상 위치를 목표로 한 후, &quot;부상을 입습니다.&quot;아래의 &quot;START READING&quot;버튼을 클릭하여 조직 거리를 측정하십시오EVEL &quot;영역 (파란색) ( 그림 3B 및 3B-1 ). </li><li> &quot;SET INJURY LEVEL&quot;영역에서 수직 마이크로 드라이버 ( 그림 1C )를 통해 센서와 척수 사이의 거리를 천천히 조정하여 원하는 변위 매개 변수 ( 예 : 0.500 mm, &quot;상해&quot;매개 변수 상자 참조)에 도달하십시오 (파란색) ( 그림 3B ). <ol><li> 원하는 상해 변위에 도달하면 조직 거리를 기록하십시오 ( 예 : &quot;Range&quot;매개 변수 상자에 표시된 8.451 mm) ( 그림 3B ). 원하는 변위 (상해) = 선단 거리 (영) - 조직 거리 (범위) ( 그림 3B )를 정의하십시오. 원하는 부상 ( 예 : 0.500 mm 조직 변위)에 도달하면 ( 그림 3B ) &quot;부상 수준 설정&quot;영역 아래의 &quot;부상 설정&quot;버튼을 클릭하여부상을 입히십시오. </li></ol></li><li> 스크류 1을 반 시계 방향으로 90 ° 돌려 스크류를 풀고 충격 팁을 레이저 빔 궤적 ( 그림 3C -1 , 화살표 방향)으로 다시 밀고 나사 1을 시계 방향으로 90 ° 돌려서 잠급니다. </li><li> 빨간색 &quot;RUN EXPERIMENT&quot;영역 ( 그림 3C ) 아래에서 실행 버튼을 클릭하여 영향을 실행하십시오. 이 구역 아래의 매개 변수 상자에는 부상 시간, 힘 (mV), 속도 (m / s) 및 부상 변위 (mm)가 표시됩니다 ( 그림 3C ). </li><li> 부상 데이터가 모두 기록되고 저장되면 무대에서 마우스로 U 자형 트로프를 제거합니다. 수술 현미경으로 척수 손상을 육안으로 확인하십시오 ( 그림 4C ). </li><li> 3-0 실크 (Henry Schein, 776-SK)를 이용한 연속 봉합을 사용하여 척추 근, 표재 근막 및 피부를 봉합합니다. </li><li> 주사하다동물을 0.9 % 식염수 1 mL와 함께 피하 수화시키고 완전한 의식이 회복 될 때까지 온도 조절 패드 위에 놓습니다. 접근 가능한 음식과 물이 들어있는 새장에 마우스를 놓습니다. </li><li> 수술 후 치료를 위해 방광 배뇨가 자연 재해 할 때까지 수동으로 방광을 표현하십시오. 진통제는 2 일 동안 하루에 8-12 시간 Buprenorphine (0.05-2.0 mg / kg, SQ)을 주입하십시오. 방광염이 발생하면 7-10 일 동안 Baytril (SQ, 0.1 mL에 5-10 mg / kg, 1 일 1 회)을 투여하십시오. 지역 / 전신 감염이 발생하면 4 일 동안 겐타 마이신 (SQ, 5-8 mg / kg, 멸균 생리 식염수 1 mL에 8-12 시간마다 희석)을 주입하십시오. </li><li> SCI 후 14 일에 봉합사를 제거하십시오. </li><li> 부상 후 42 일째에, 마우스는 재관류에 의해 희생 될 것이다. 1.2로 적절한 마취 후, 그들은 0.01 M PBS에서 30 ML (0.01M) 인산염 완충 식염수 (PBS)와 30 ML 4 % paraformaldehyde로 관류됩니다. 병변 서사를 포함한 척수 1 센티미터enter는 수집되고 절편화 및 조직 학적 분석을 위해 처리됩니다. </li></ol>

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</ol>

Christopher B. Shields, MD는 Louisville Impactor System, LLC가 제작 한 LISA (Louisville Injury System Apparatus)의 소유권을 가지고 있습니다.

1911 년 Allen은 고정 체중을 사용하여 첫 번째 체중 감소 모델을 설명하여 개들의 노출 된 척수에 부상을 유도했습니다. NYU / MASCIS 임팩터 3 , 6 , 13 , 14 를 포함한 Allen 모델을 기반으로 비슷한 체중 감소 모델이 개발되었습니다. 체중 감소 모델 외에도 다른 SCI 장치가 생성되었습니다. OSU / ESCID 5 , 7 모델은 조직 변위 메커니즘을 사용하여 상해의 심각성을 제어하고 IH 모델 4 , 8 은 힘을 사용하여 경사각 SCI를 만듭니다. 이러한 시스템에서, 척추 안정화는 주둥이와 장골 부위를 부상 부위에 고정시킴으로써 이루어진다. 이 장치는 낮은 상해 속도, 특히 0.33 - 0.9 m / s (NYU / MASCIS), 0.148 m / s (OSU / ESCID),및 0.13 m / s (1H). 주둥이와 꼬리의 가시 돌기를 안정시키는 것은 충격 중에 척추의 유연성과 척추 움직임을 유발할 수 있으며 이는 부상의 정확성에 영향을 줄 수 있습니다. LISA 방법은 기존 모델의 단점, 특히 척추의 불안정성과 낮은 부상 속도를 극복하려고 시도합니다. 이 방법은 양측면 안정화를 사용하고 부상과 관련된 움직임 인공물을 피합니다. 이 장치는 0.5-2m / s 11 , 15 사이에서 설정할 수있는 높은 충격 속도를 사용합니다. 레이저 센서는 ESCID 모델에 사용 된 링 진동기보다 더 진보되었으며 조직 접촉을 필요로하지 않고 척수 표면으로부터의 거리를 정확하게 측정합니다. 모델은 원래 쥐 SCI를 생산하기 위해 개발되었으며, 수정 된 상태로 마우스 및 비인간 영장류에서 SCI를 생산하기 위해 개발되었습니다. 척추abilization은 모든 실험 SCI 방법, 특히 조직 변위 모델의 가변성을 줄입니다. 레이저 거리 센서는 호흡 운동 중에 척수의 조직 변위의 정도를 결정합니다. 레이저가 초점을 맞춘 척수의 지점은 임팩터가 부딪힌 동일한 지점이어야합니다. 이 단계는 임팩터 팁과 레이저 빔이 정렬 된 교정 단계 ( 그림 3 ) 중에 수행됩니다. 이 모델의 잠재적 약점은 조직 변위의 크기가 경막 표면에서 측정된다는 것입니다. 경막의 두께가 동물 사이에 무시할만한 차이를 만들어 내지 만 뇌척수액 (CSF)으로 채워진 지주막 하 공간에 상당한 변화가있을 수 있습니다. 작은 조직 변위를 사용하여 매우 약한 타박상을 일으킬 때 상해 결과의 다양성이 발생할 수 있습니다. 전체적으로, 상해의 일관성은 주로 의존적입니다조직 변위의 정확성 및 플런저의 속도 및 조직 접촉 시간에 영향을 미친다. 조직 변위의 범위는 넓습니다 (정확도 : 0-10 ± 0.005 mm). 설치류 및 비인간 영장류에 대한 이전의 시험 데이터 및 발표 된 정보를 토대로, SC의 전후 직경의 20 %의 변위는 경도의 SCI를 초래하고, 30-40 %의 변위는 적당한 SCI를 생성하고,&gt; 50 %의 변위 1 m / s 속도에서 심각한 SCI를 생성합니다. 동물 종에 따라 약간의 차이가있을 것입니다. 드웰 시간은 시간 릴레이를 사용하여 0에서 5 초까지 조정할 수 있습니다. 우리의 연구에서, 체류 시간은 300 ms로 설정되었다. 이것은 NYU 및 IH 모델을 포함한 다른 SCI 장치의 휴지 시간을 복제하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 요약하면, 우리는 어른 생쥐에서 contiveive SCI의 변위 기반 모델을 개발했습니다. 이 모델은 코드를 피하면서 양측 척추면을 안정화시키기 위해 U 형 안정기를 사용합니다코드 표면의 레이저 유도 측정과 관련된 동작 인공물. 이 모델은 0.5-2m / s에서 고속 코드 손상을 일으킬 수 있습니다. 레이저 센서는 충격 표면까지의 속도와 거리를 결정하는 기존의 방법보다 정확합니다. 이 모델은 경미한 수준에서 심각한 수준까지 모든 수준에서 척수 손상을 일으킬 수 있습니다. 변형 된 경우,이 장치는 또한 쥐 및 비인간 영장류와 같은 대형 동물에서 상해를 유발할 수 있습니다.

인간에서 발생하는 가장 흔한 척수 손상 (SCI)은 까다로운 SCI 1 입니다. SCI를 따르는 손상 및 다양한 치료 전략의 메커니즘을 조사하기 위해 설치류에서 정확하고 일관되며 재현성있는 타박상 SCI 모델이 필요하다. 다양한 상해 유발 메커니즘을 가진 많은 척수 외상 손상 모델이 실험적 SCI 연구 2 , 3 , 4 , 5 , 6 에서 사용되어왔다. 오하이오 주립 대학교 (OSU) 임팩터 / 전자기 SCI 장치 (ESCID) 5 , 3 , 6 , 뉴욕 대학 (NYU) / 다기관 동물 척수 손상 연구 (MASCIS) 도 7 에서,무한 수평선 (Infinite Horizon, IH) 임팩터 4 , 8 은 SCI 연구 분야에서 널리 받아 들여지고있다. NYU / MASCIS 임팩터 또는 이와 동등한 척도는 다른 높이에서 고정 된 무게를 목표 척수로 떨어 뜨려 다발성 중증도 3 , 6 을 만들어 상해를 유발합니다. OSU / ESCID는 조직 변위를 유도하여 상해를 유발합니다 5 , 7 . IH 임팩터는 척수 4 , 8 에 다른 힘을가함으로써 손상을 일으 킵니다. 각 충격 장치는 다른 속도를 사용하는데 이는 부상 결과에 영향을 미치는 중요한 매개 변수입니다. NYU / MASCIS 장치는 0.33-0.9 m / s 범위의 속도를 생성합니다. IH 장치의 최대 속도는 0.13m / s입니다. OSU / ESCID 임팩터는 0.148m / s의 고정 된 속도를 가진다. 특히,se 모델은 일반적으로 1.0 m / s를 초과하는 임상 속도에서 관찰 된 모델보다 낮습니다. 여기에서는 충격 속도가 높은 마우스에서 SCI를 생산하기 위해 Louisville Injury System Apparatus (LISA)라고 불리는 새로운 변위 기반 SCI 장치를 소개합니다. 이 시스템은 손상 부위에서 척추골을 단단히 안정화시켜 일정하고 재현성있는 SCI를 생성 할 수있는 척추 안정제를 포함합니다. 장치의 레이저 센서는 조직 변위의 정확한 결정과 결과적으로 SCI의 심각성을 보장합니다. 척수와의 접촉점에서 플런저의 속도는 0.5에서 2m / s로 조정할 수 있습니다. 이러한 상해 매개 변수는 임상 적으로 보인 외상성 SCI를 복제합니다.

<table><tbody><tr><td>케타민 (7.2 mg / mL) / 자일라진 (0.475 mg / mL) / 아세프로마진</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947</td><td>마취제</td></tr><tr><td>Buprenorphine(0.03 mg/mL)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-9756</td><td>진통제</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-844-7425</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Purdue Products Betadine Surgerical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>피부 살균용</td></tr><tr><td>Dukal Gauze Sponges</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>피부 살균용</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>피부 살균용</td></tr><tr><td>1 mL NORM-JECT</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>D-78532</td><td>마취/통증 완화/항생제 주입용</td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>TERUMO</td><td>REF SS-10L</td><td>식염수 주사</td></tr><tr><td>인공 눈물 눈 연고</td><td>웹스터 수의학</td><td>07-870-5261</td><td>프로방트 눈 건조</td></tr><tr><td>항생제 연고</td><td>웹스터 수의학</td><td>07-877-0876</td><td>프로방트 수술 감염에서 잘라낸</td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>1006015</td><td>출혈 중지</td></tr><tr><td>기구 살균기</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>18000-50</td><td>소독 수술 도구</td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>조직 파악</td></tr><tr><td>메스</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>스킨 컷</td></tr><tr><td>메스 블레이드 # 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>10015-00</td><td>스킨 컷</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td>출혈 중지</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomy</td></tr><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td>수술 보기 열어 두</td></tr>기 <tr><td>Fine Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14040-10</td><td>척추에서 분리된 근육</td></tr><tr><td>멸균 봉합사</td><td>Fine Science Tools</td><td>12051-10</td><td>피부 폐쇄</td></tr><tr><td>마우스 척추 안정제</td><td>루이빌 임팩터 시스템</td><td>N/A</td><td>척추 안정화 및 노출</td></tr><tr><td>LISA</td><td>Louisville Impactor System</td><td>N/A</td><td>마우스에서 척수의 실험적 타박상 손상 생성</td></tr></tbody></table>

마우스의 조직 변위에 근거한 척수 손상 모델

A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice

일관되고 재현성있는 contusive 척수 손상 (SCI)을 생성하는 것은 실험 동물 간의 행동 및 조직 변화를 최소화하는 데 중요합니다. 서로 다른 메커니즘을 사용하여 상해를 유발하는 여러 contiveive SCI 모델이 개발되었습니다. SCI의 심각도는 주어진 체중이 떨어지는 높이, 부상당하는 힘 또는 척수의 변위에 근거합니다. 본 연구에서는 높은 상해 속도와 정확도를 갖는 변위 기반 SCI를 생성 할 수있는 새로운 마우스 타박상 SCI 장치 인 LISA (Louisville Injury System Apparatus)를 소개합니다. 이 시스템은 고급 소프트웨어와 결합 된 레이저 거리 센서를 사용하여 등급이 매겨지고 재현성이 높은 상해를 일으 킵니다. 우리는 마우스의 10 번째 흉추 (T10) 수준에서 까다로운 SCI를 수행하여 단계별 절차를 시연했습니다. 이 모델은 자궁 경부 및 척추 수준에도 적용 할 수 있습니다.

이 장치는 (1) 임팩터 팁이있는 몸체 ( 그림 1C ), (2) 소프트웨어가있는 컴퓨터 ( 그림 1B ), (3) 전기 제어 상자 ( 그림 1B ), (4) 척추 안정기 ( 그림 2A ), 및 (5) 압축 공기 (공압 제어 시스템 용) ( 그림 1A ). 정확한 조직 변위를 유도하기 위해 시스템은 완전히 확장 된 플런저 팁과 표적 척수 배면 사이의 거리를 측정하기 위해 레이저 센서를 사용합니다. 이 소프트웨어는 레이저 빔이 임팩터의 반사 표면에만 도달하기 때문에 팁의 4mm 두께를 고려합니다 ( 그림 2B 및 그림 3A -1 ). 플런저 팁을 배치 할 수있는 위치는 두 가지입니다. (1) in 레이저 광선 ( 그림 3A -1 ) 또는 (2)의 레이저 광선으로부터 먼 위치에서의 경로 ( 그림 3B -1 ). 플런저가 레이저 빔 경로 ( 그림 3A -1 )에있을 때, 이는 임팩터 팁으로부터의 거리를 측정하고, 신축과 후퇴 사이의 모션 동안 임팩터 팁의 속도를 모니터링합니다. 플런저가 레이저 빔 경로 ( 그림 3B -1 )에서 멀리 떨어진 측면 위치에있을 때 레이저와 척수 사이의 거리가 측정됩니다. 척추 안정제를 사용하는 T10 척추의 안정화는 절차의 필수 요소입니다 ( 그림 2A ) 10 , 11 . 레이저 센서를 사용하여 신뢰할 수있는 거리 측정은목표가 움직일 가능성이 있다면 왜곡 될 수 있습니다. 이 시스템의 정확성과 일관성을 결정하기 위해 8 마리의 마우스에게 0.5mm 변위 상해를 가했다. 이 동물들은 ± 0.001 mm (± SD)의 변위 변동성을 나타내어 시스템이 매우 정확하고 재현성이 있음을 나타냅니다. 그림 4 는 수술 현미경으로 안정화 장치 ( 그림 4A )와 노출 된 T10 척수 ( 그림 4B )와 후 ( 그림 4C )의 척추 고정 된 대상 척추를 보여줍니다. 압축 공기의 압력은 부상 순간의 충격 장치의 속도를 제어합니다. 우리의 데이터는 충격 속도가 138 kPa의 압력에서 0.81 ± 0.0345 m / s (평균 ± 표준 편차)임을 입증합니다. 전기 박스 컨트롤의 손잡이 ( 그림 1B )부상 후 팁 - 코드 접촉 시간 (dwell time)은 0에서 5,000ms 사이에서 조정할 수 있습니다. 대부분의 실험에서 팁 - 코드 체류 시간은 0.32 ± 0.0147 초 (평균 ± 표준 편차)로 설정됩니다 ( 그림 5 ). 이 장치를 사용하여 성인 마우스에서 0 mm (가짜 제어), 0.2 mm (경미한 부상), 0.5 mm (보통의 부상) 및 0.8 mm (심한 부상)의 조직 변위로 심각도에 따라 다량의 상해를 입을 수 있습니다 ( 그림 6 ). <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig1.jpg"> 그림 1 : 루이빌 상해 시스템 장치 (LISA). ( A ) 시스템은 임팩터, 제어 시스템 및 압축 공기 공급원으로 구성됩니다. ( B ) 제어 시스템은 제어 박스와 랩탑 컴퓨터를 포함한다. 컨트롤 박스의 소프트웨어 및 컨트롤 버튼으로 사용자는lish 상해 매개 변수. ( C ) 레이저 센서는 장치의 주요 구성 요소이며 부상 대상의 위치, 척수에서 센서까지의 거리 및 부상 속도를 측정합니다. 충돌 팁의 신속한 상하 이동은 압축 공기로 이루어집니다. 부상 위치와 조직 변위의 정도는 3 차원 운동을 제어하는 ​​마이크로 드라이버에 의해 조정됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig2.jpg"> 그림 2 : 안정기와 마우스 홀더. ( A ) 등뼈 안정 장치는 U 형 트로프와 마우스 척추를 고정하는 두 개의 금속 팔로 구성됩니다. ( B ) 그런 다음 스태빌라이저가 충격 장치에 장착됩니다. 티그는 빨간색 선이 레이저 빔 경로를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig3.jpg"> 그림 3 : Contive SCI를 생성하는 방법. ( A - C ) 3 가지 부상 파라미터 / 영역이있는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 소프트웨어가 표시됩니다. ( A , A-1 ) 녹색 영역 (SET ZERO LEVEL)은 플런저 끝의 거리를 보정합니다. 빨간색 선은 레이저 빔 경로를 나타냅니다. ( B , B-1 ) 청색 영역은 부상 수준을 설정하는 데 사용됩니다 (부상 수준 설정). 임팩터는 들어 올려지고 레이저 광선이 척수의 등쪽 표면에 도달하여 제로 수준을 설정하도록 오른쪽으로 측면으로 이동합니다. 빨간색 선은 레이저 b를 나타냅니다. 경로. ( C , C-1 ) 충격 전에 팁을 레이저 빔 경로로 다시 이동시켜 부상 (RUN)을 실행합니다. 부상 매개 변수는 빨간색 영역 (RUN EXPERIMENT) 아래에 있습니다. 빨간색 선은 레이저 빔 경로를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig4.jpg"> 그림 4 : 상해 노출 및 평가. ( A ) 등뼈 안정 장치의 금속 팔은 T10 척추를 안정시킵니다. ( B ) 척수를 노출시키기위한 T10 절제술. ( C ) 척수의 등쪽 표면에 충격으로 인한 타박상 (화살표)이 상해를 확인합니다. 눈금 막대 = 2mm.g4large.jpg "target ="_ blank "&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig5.jpg"> 그림 5 : 상해 파라미터. 일관된 상해 매개 변수에는 조직 변위 (mm), 상해 속도 (m / s) 및 팁 체류 시간이 포함됩니다. N = 8, 평균 ± 표준 편차. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54988/54988fig6.jpg"> 그림 6 : 조직 학적 평가. Cresyl Violet과 Eosin으로 염색 된 척수의 대표적인 단면은 ( A ) 가짜 (0 mm), ( B ) 가벼운 (0.2 mm), ( C) D ) 심한 (0.8 mm) 까악 돌기가있는 SCI를 측정 하였다. 이미지는 부상 진원지에서 촬영되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54988/54988fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 성인 생쥐에서 일관된 contusive 척수 손상을 일으킬 수있는 조직 변위 기반 논란 척수 손상 모델을 소개합니다.

Producing a consistent and reproducible contusive spinal cord injury (SCI) is critical to minimizing behavioral and histological variabilities between ...

이 비디오의 전반적인 목표는 성체 마우스에서 일관된 타박성 척수 손상을 일으킬 수 있는 새로운 조직 변위 기반 타박성 척수 손상 모델을 소개하는 것입니다. 이 타박상 모델은 실험용 척수 손상 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 매우 일관된 척수 손상을 일으킨다는 것입니다.이 기술의 의미는 척수 손상 치료로 확장되었는데, 그 이유는 이 모델이 손상 메커니즘과 실험적 치료의 효과를 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 도구를 제공하기 때문입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 새로운 임팩터에 익숙하지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 수동 및 소프트웨어 작업으로 인해 여러 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.오토클레이브 수술 기구와 금속 척추 안정제를 깨끗한 수술 테이블로 가져오는 것으로 시작합니다. 가열 패드를 섭씨 37도까지 예열합니다. 그런 다음 발열 패드를 수술대에 놓고 멸균 수술용 드레이프로 덮습니다.이 연구에는 10주 된 암컷, C57BL6J 마리의 마우스가 사용되었습니다. 케타민과 자일라진을 복강내 주사로 투여한 후, 발 꼬집음으로 인한 통각 자극에 대한 반응이 없어 적절한 수준의 마취가 이루어지는지 확인합니다. 진통제인 부프레노르핀(buprenorphine)과 비스테로이드성 항염증제인 카프로펜(carprofen)을 피하로 투여합니다.전기 가위를 사용하여 흉요추 위의 털을 면도합니다. 베타딘 용액과 70% 알코올 물티슈로 피부를 문지릅니다. 눈이 건조해지지 않도록 각막에 안과 연고를 바르십시오.9번째부터 11번째 흉추 층판에 걸쳐 동물의 등에 1.5cm의 정중선 피부를 절개한 후 피하 지방 조직을 옆으로 밀어 넣습니다. 가는 가위, 가는 집게 및 아그리콜라 견인기를 사용하여 척추 주위 근육을 가시돌기에서 벗어나 양쪽의 측면 근막을 향해 층을 절개합니다. 안정 장치의 U자형 용기에 마우스를 놓고 clampt10 척추의 노출된 면 아래에 있는 스테인리스 스틸 암을 양측으로 연결하고 나비 나사가 부착된 암으로 암을 조입니다.마이크로 롱거(micro rongeur)를 사용하여 척수 위에 있는 경막 모델을 노출시키는 T10 척추돌기와 층판을 제거합니다. 마우스가 있는 U자형 용기를 s에 놓습니다.tage 임팩터의 및 s를 고정합니다.tage 마운트의 나비 나사를 조여 제자리에 놓습니다. 임팩터를 설정하려면 먼저 질소 탱크에 있는 압력 조절기의 손잡이를 돌려 압축을 한 질소를 제곱인치당 20파운드 또는 연구를 위해 138킬로파스칼로 설정합니다.1.2ml 임팩트 팁을 70% 알코올로 살균합니다. 그런 다음 컴퓨터에서 소프트웨어 패키지를 엽니다. 컨트롤 박스 중 하나의 버튼을 눌러 임팩터 팁을 완전히 확장된 위치로 활성화합니다.컴퓨터 화면의 Set zero level(제로 레벨 설정)에서 읽기 시작(start reading)을 클릭하여 완전히 확장된 플런저 팁까지의 거리를 측정합니다. 거리는 이 영역에서 범위 매개변수로 표시됩니다. 그런 다음 0 설정을 클릭하면 0 매개 변수 상자에 밀리리터 단위의 숫자가 표시됩니다.다음으로, 컨트롤 박스의 버튼 1을 눌러 임팩터 팁을 빼냅니다. 그런 다음 고정 나사를 풀고 나사를 당겨 팁을 레이저 빔 경로에서 멀리 이동한 다음 나사를 시계 방향으로 90도 돌려 잠급니다. 이제 레이저 빔을 노출된 등쪽 척수의 중앙에 조준하도록 전면 및 측면 마이크로 드라이버를 조정하여 마운트 스테이지를 이동합니다.부상 부위를 목표로 한 후 부상 수준 설정 아래에 있는 판독 시작 버튼을 클릭하여 조직 거리를 측정합니다. 수직 마이크로 드라이버를 사용하여 원하는 변위 매개변수에 도달할 때까지 센서와 척수 사이의 거리를 천천히 조정합니다. 이것은 부상 매개변수 상자에 설정된 부상 수준 미만입니다.원하는 부상 변위에 도달하면 범위 매개변수 상자에 표시된 조직 거리를 기록한 다음 0의 팁 거리에서 조직 거리 또는 범위를 빼서 원하는 변위 또는 부상을 정의합니다. 그런 다음 set injury level(부상 수준 설정)에서 set injury(부상 설정)를 클릭합니다. 그런 다음 나사를 시계 반대 방향으로 90도 돌려 잠금을 해제합니다.임팩트 팁을 레이저 빔 궤적으로 다시 밀어 넣고 시계 방향으로 90도 돌려 나사를 잠근 다음 실행 실험에서 실행 버튼을 클릭하여 임팩트를 실행합니다. 매개변수 상자는 부상 시간(초), 힘(마이크로볼트), 속도(초당 미터) 및 부상 변위(mm)를 표시합니다. 모든 부상 데이터를 기록하고 저장한 후 스테이지에서 마우스로 U자형 홈통을 제거합니다.그런 다음 수술용 현미경으로 척수 손상을 육안으로 확인합니다. 절개 부위를 여러 겹으로 봉합한 후, 수분을 공급하기 위해 1mm의 0.9% 식염수를 피하 주사하고 의식이 회복될 때까지 온도 조절 패드에 올려 놓습니다. 그런 다음 쉽게 접근할 수 있는 물과 음식이 있는 깨끗한 케이지에 마우스를 수용합니다.이러한 데이터는 일관되지 않은 부상 매개변수를 보여주며, 충격기가 신뢰할 수 있고 재현 가능한 부상을 생성할 수 있음을 보여줍니다. 크레실 바이올렛-에오신 (cresyl violet-eosin)으로 염색 된이 대표적인 단면은 0mm 변위로 가짜 손상 후 척수의 t10 영역을 보여줍니다. 이 이미지는 0.2mm 변위의 장치를 사용하여 t10에서 가벼운 타박상성 척수 손상의 진원지를 보여줍니다.이 중등도의 부상은 0.5mm 변위를 사용하여 달성되었습니다. 마지막으로, 이 심각한 부상은 0.8mm 변위의 결과입니다. 이 이미지는 이 새로운 충격체가 등급이 매겨진 타박상 부상을 일으킬 수 있음을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 30분 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 척수 표적의 임팩터 팁에 대해 0을 설정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 척수 손상 분야의 연구자들이 생쥐, 쥐 및 인간이 아닌 영장류에서 메커니즘과 치료법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 이 충격기를 사용하여 타박성 척수 손상을 일으키는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

무한 호라이즌 임팩터를 사용하여 자궁 경부 일방적 척수 부상을 생산하기위한 안정적이고 반복 가능한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 사용자 정의 설계된 프레임을 활용하고 척추를 고정 클램프. 표준화된 절차와 충분하고 지속적인 부상의 biomechanical 부상 매개 변수 결과.

무한 호라이즌 임팩터을 사용하여 일방적 경부 척수의 부상의 Contusive 모델

출처: Elzat, E. Y. Y., et al., 최소 침습 기법을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 구축. J. Vis. 특급 (2022). 이 비디오는 척수 손상 동축 플랫폼을 사용하여 마우스 모델에서 T9 수준의 척수에 타박상 부상을 유발하는 방법을 보여줍니다. T9 수준의 척수에 체중이 가해져 타박상이 발생하여 즉시 조직이 변색되고 부어오릅니다.

척수 손상 동축 플랫폼을 이용한 마우스 모델에서 척수 타박상 유도

출처: Kumar, S., et. al. 척수 손상 후 욕창의 마우스 모델. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 마우스의 척수 손상에 대한 자세한 유도를 보여줍니다. 마취된 쥐를 절개하여 T9-T10 척추뼈를 노출시키고 가시돌기를 제거합니다. 그런 다음 노출된 척수를 절제하여 부상을 입힙니다. 그런 다음 수술 부위를 닫고 마우스가 회복할 수 있도록 합니다.

척수 손상이 있는 마우스 모델 생성

마우스의 제어 자궁 경부 열상 상해

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

척수 손상 모델은 재현성이 높아야 합니다. 우리는 척수 손상의 보정된 겸자 압박 모델이 쥐의 척수에 재현 가능한 손상을 생성하기 위해 사용하기 쉬운 수술 방법임을 보여줍니다.

척수 압축 부상의 보정 집게 모델

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

이 프로토콜은 척수 손상 연구에 대한 최소한의 부수적 손상과 함께 마우스 모델에서 안정적인 횡부 형 척수 손상을 유도하기위한 정확한 라미네절절제술을 만드는 방법을 설명합니다.

마우스에서 완전한 Transection 형 척수 손상의 유도

최소 침습 기술과 간단한 실험실 장치는 실험 동물에 대한 수술 손상을 줄이고 해부학적 형태 유지를 허용하여 척수 손상 모델의 재현성을 향상시킵니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 결과와 재현 가능한 절차가 질병 배상 메커니즘의 조사를 용이하게하기 때문에 가치가 있습니다.

최소 침습 기술을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 설정

마우스에서 중심 탯줄 증후군(CCS)을 시뮬레이션하는 본 프로토콜은 반복성을 개선하고 실험 동물에 대한 수술 손상을 최소화하여 해부학적 구조가 과도하게 파괴되는 것을 방지했습니다. 이 연구의 전략은 일관된 결과를 도출하여 부상 메커니즘에 대한 연구를 가능하게 하기 때문에 유리합니다.

C57BL/6J 마우스의 중심삭증후군 모델 확립

여기에 제시된 것은 다양한 정도의 척수 손상 타박상 모델을 정확하게 생성할 수 있는 마우스용 새로운 자동 척수 손상 타박상 장치입니다.

마우스의 Contusive Spinal Cord Injury Model을 위한 자동 임팩터

학습하세요 조직 변위 기반 척수 손상 모델을 사용하여 성체 마우스에서 일관된 타박상 손상을 유도하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구에서 재현 가능한 결과를 제공하며 치료 전략 개발에 필수적인 도구입니다.

마우스의 조직 변위에 근거한 척수 손상 모델

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