2.13: 1D 박막 크로마토그래피 수행

1. TLC 플레이트

1. TLC의 일반적인 흡착제는 실리카겔, 알루미나 및 셀룰로오스입니다. TLC 플레이트는 다양한 특성으로 상업적으로 이용 가능합니다. TLC 플레이트를 선택하고 적절한 크기로 자릅니다(대부분의 응용 프로그램에는 약 5cm x 5cm로 충분). 유리로 된 TLC 플레이트의 경우 자와 유리 커터를 사용하여 유리에 점수를 낸 다음 선을 따라 조심스럽게 부수십시오.

2. 스포팅

1. 샘플을 적절한 용매에 용해시켜 약 1%의 용액을 만듭니다. 가능하면 용매는 무극성이어야 합니다. 컬럼 크로마토그래피 분획 및 기타 희석 용액은 용질이 0.2%에서 2.0% 사이의 농도로 존재하는 경우 희석 없이 사용할 수 있습니다.
2. 접시 바닥에서 약 1.0cm 떨어진 곳에 연필로 기준선을 표시합니다. 접시 가장자리에서 최소 1.0cm 떨어진 곳에 반점을 배치하고 적절하게 레이블을 지정합니다.
3. 반점은 유리 모세관을 사용하여 적용할 수 있습니다. TLC 플레이트를 찾으려면 모세관을 용액에 담그고 소량의 액체를 끌어들입니다. 팁을 TLC 플레이트의 원하는 위치에 부드럽게 터치하고 즉시 제거하십시오.
4. 또는 마이크로리터 주사기로 각 응용 분야에 대해 약 1μL의 용액을 전달하여 스팟을 도포할 수 있습니다.
5. 스팟은 각 위치에 연속적으로 적용될 수 있으며, 스포터로 흡착제 표면을 방해하지 않도록 주의합니다. 응용 프로그램 사이에 용매가 건조되도록 합니다.

3. 현상 용매 선택

1. 양호한 분리를 위해 가능한 최소 극성 용매를 사용하는 것이 바람직합니다. TLC의 일반적인 용매에는 헥산, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄 및 메탄올이 포함됩니다(표 1).
2. 적절한 이동상을 찾는 편리한 방법은 샘플로 TLC 플레이트를 찾는 것입니다. 직경 1-2cm의 용매 원을 형성하기 위해 충분한 용매를 해당 지점에 직접 도포합니다. 원의 둘레를 표시합니다. 시각화 시 적절한 용매는 잘 분리된 고리를 표시하며, 가장 바깥쪽 고리는 중심에서 용매 선단까지의 거리의 약 50%에 있습니다.
3. 두 개의 혼화성 용매를 선택하고 다양한 비율로 테스트하여 이동상의 극성을 조정해야 할 수도 있습니다. 일반적인 혼합물의 예로는 에틸 아세테이트와 헥산, 메탄올과 디클로로 메탄이 있습니다.

4. 개발

1. 더럽혀진 TLC 플레이트를 적절한 현상 용매가 포함된 현상 챔버에 놓습니다. 용매 라인은 TLC 플레이트에 표시된 기준선 아래에 있어야 합니다.
2. 현상 챔버는 뚜껑이 있는 병 또는 알루미늄 호일 또는 플라스틱 필름으로 덮인 비커일 수 있습니다. TLC 플레이트를 수용할 수 있는 가장 작은 용기를 사용하십시오.
3. 솔벤트가 플레이트의 상단 가장자리에 닿지 않도록 하십시오. 용매 선단(흡착제의 젖은 부분이 끝나는 경계)이 플레이트 상단에서 5-10mm 떨어져 있을 때 현상 챔버에서 TLC 플레이트를 제거하고 용매가 건조되기 전에 연필로 용매 전면을 표시합니다.

5. 시각화

1. 색깔이 있는 반점은 즉시 시각화하고 연필로 표시할 수 있습니다. 종종 반점은 보이지 않으므로 다른 방법으로 시각화해야 합니다.
2. 종종 TLC 흡착제에는 형광 지시자가 포함되어 있습니다. 반점은 휴대용 자외선(UV) 램프를 사용하여 시각화할 수 있습니다. 형광을 끄는 화합물은 플레이트에 단파(254nm) UV 광선을 조사할 때 어두운 반점으로 나타납니다. 형광 화합물은 적절한 파장의 자외선을 조사할 때 밝은 점을 생성합니다. 연필로 각 지점의 중심을 표시하십시오.
3. TLC 플레이트에 시각화 시약 또는 염색을 적용하여 반점을 시각화할 수도 있습니다. 시각화 시약은 플레이트를 시약에 담그거나 비부식성 시약으로 적신 면봉으로 플레이트를 닦아서 적용할 수 있습니다.
4. 에탄올에 함유된 포스포몰리브딕산 20% 용액은 대부분의 유기 화합물을 시각화하는 데 유용합니다. 반점은 히트 건으로 접시를 가열하거나 오븐에서 가열할 때 나타납니다.
5. 다른 시약은 특정 종류의 화합물을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 닌히드린 시약은 아미노산 시각화에 사용되며 2,4-디니트로페닐히드라진은 알데히드 및 케톤에 사용됩니다.

6. 분석

1. 지연 계수(R_f)는 화합물이 TLC 플레이트 위로 이동하는 거리와 용매가 이동하는 거리의 비율입니다. 이는 기준선에서 스폿 중심까지의 거리를 측정하고 값을 기준선에서 용매 선방까지의 거리로 나누어 결정할 수 있습니다.
   위치
2. 화합물의 R_f는 물리적 특성의 특징이며 온도, 샘플 크기, 흡착제의 두께 및 활성, 온도 및 샘플 크기와 같은 요인에 따라 달라집니다.
3. 미지 물질이 알려진 화합물과 동일한지 확인하려면 동일한 TLC 플레이트에 표준물질을 발견해야 합니다. 동일한 물질은 R_f와 동일한 특성을 갖습니다.

박층 크로마토그래피(TLC)는 유기 화학에서 일반적으로 사용되는 비휘발성 화합물의 혼합물을 분리하는 데 사용되는 크로마토그래피 방법입니다.

TLC는 유리 또는 플라스틱 뒷면 플레이트에서 수행됩니다. 기준선은 레이블과 함께 플레이트에 표시됩니다. 검사 중인 혼합물과 참조 화합물을 적절한 용매에 용해시키고 TLC 플레이트의 하단 가장자리 근처에 작은 반점으로 도포합니다. 플레이트는 항아리에 넣고 용제? (이동상)은 각 구성 요소의 물리적 특성에 따라 혼합물을 분리합니다.

더 많은 기기가 많은 분리 기술이 TLC보다 더 많은 분해능을 갖는다는 사실에도 불구하고, TLC를 즉석 정성 분석을 위한 매력적인 기술로 만드는 것은 속도와 저렴한 비용입니다. 이 동영상은 박층 크로마토그래피의 준비, 작동 및 분석을 보여줍니다.

크로마토그래피 기술에는 고정상과 이동상이 포함됩니다. TLC에서 고정상은 플레이트에 고정된 얇은 재료 층으로 구성됩니다. 물질은 실리카겔과 같은 극성 물질입니다. 이동상은 모세관 작용에 의해 흡착층을 위로 이동하는 비극성 액체입니다. 이동상이 플레이트 위로 이동함에 따라 각 스폿의 구성 요소를 따라 끌고 나중에 극성에 따라 분리됩니다.

극성이 적은 화합물은 플레이트를 끌어올릴 때 이동상에서 더 많은 시간을 소비합니다. 극성이 더 높은 화합물은 고정상에 더 끌리므로 플레이트를 멀리 이동하지 않습니다.

분리는 현상 용기에서 이루어집니다. 뚜껑이 있는 항아리 또는 알루미늄 호일로 덮인 비커일 수 있습니다. 분리 속도를 높이려면 TLC 플레이트를 수용할 수 있는 가장 작은 용기를 사용하십시오.

이동상 또는 현상 용매는 양호한 분리를 위해 가능한 한 무극성이어야 합니다. 여기에 표시된 것은 실리카겔에 대한 용리막 시리즈이며, 추출력을 증가시키기 위한 일반적인 이동상 목록입니다.

여러 이동상을 동시에 테스트할 수 있습니다. 깨끗한 플레이트에서 용해된 샘플을 최소 2cm 간격으로 여러 번 찾습니다. 각 지점에 충분한 이동상을 적용하여 직경 1-2cm의 원을 형성합니다.

이동상이 이동하는 거리를 표시합니다. 이동상이 충분히 극성이 아닌 경우 샘플은 초기 지점에 가깝게 유지됩니다. 이동상이 너무 극성이 있으면 모든 샘플이 용매 전면과 함께 이동합니다. 적절한 이동상은 잘 분리된 고리를 보여주며, 가장 바깥쪽 고리는 용매 선단까지의 거리의 약 50%를 차지합니다.

필요한 경우, 원하는 특성을 얻기 위해 두 개의 혼화성 이동상을 다양한 비율로 혼합할 수 있습니다. 여기서, 에틸 아세테이트와 헥산의 1:1 혼합물은 극성이 너무 높았지만, 1:20 혼합물은 적절히 분리하였다.

이동상을 선택하면 플레이트 개발을 시작할 준비가 된 것입니다.

절차를 시작하려면 시중에서 판매되는 TLC 플레이트를 원하는 크기로 자릅니다. 접시에 유리 뒷면이 있으면 유리 커터로 점수를 매기고 선을 따라 조심스럽게 부수십시오.

연필로 접시 바닥에서 약 1cm 떨어진 곳에 기준선을 표시합니다. 라인을 따라 샘플이 발견될 위치를 표시하십시오. 반점이 가장자리에서 최소 1cm, 3mm 떨어져 있는지 확인하십시오. 적절하게 레이블을 지정하십시오.

고체 시료는 적절한 용매에 용해시켜야 합니다. 일반적인 용제에는 헥산, 에틸 아세테이트 또는 디클로로 메탄이 포함됩니다. 시료를 용해시킬 수 있는 극성이 가장 낮은 용매를 사용하십시오.

유리 모세관으로 샘플/용매 혼합물을 그립니다. 팁을 TLC 플레이트의 원하는 위치에 부드럽게 터치하고 즉시 제거하십시오. 정지 위상을 방해하지 않는 것이 중요합니다.

더 나은 분리로 이어지므로 가능한 한 작은 자리를 유지하십시오. 더 많은 샘플이 필요한 경우 각 위치에 스팟을 연속적으로 적용할 수 있습니다. 응용 프로그램 사이에 용매가 건조되도록 합니다. 공기 흐름을 사용하여 휘발성이 적은 용매를 건조할 수 있습니다.

이제 TLC 플레이트를 개발할 준비가 되었습니다. 증기압을 높이기 위해 항아리 바닥에 여과지 조각을 놓습니다. 기준선에 도달하지 않는 깊이에 이동상을 추가합니다. 사용하지 않을 때는 용기 뚜껑을 씌워 용매 증기가 빠져나가지 않도록 하십시오.

더럽혀진 TLC 플레이트를 현상 용기에 조심스럽게 놓습니다. 모바일 위상이 기준선 미만인지 확인합니다. 솔벤트 프론트의 진행 상황을 지켜보십니까? 모바일 위상의 최첨단? 접시 위로 빠르게 이동할 것이기 때문입니다.

이동상이 플레이트의 상단 가장자리에 도달하지 않도록 하십시오.ample bands는 확산을 통해 확장되기 시작합니다. 용매 선단이 상단에 가까워지면 현상 챔버에서 플레이트를 제거하고 용매가 건조되기 전에 연필로 용매 전면을 표시합니다.

화합물에 착색이 되어 있지 않으면 UV 램프를 사용하여 반점을 시각화할 수 있습니다. 화합물은 플레이트의 배경 형광을 차단합니다. l을 설정amp 단파 설정으로 설정하고 건조판을 비춥니다. 연필을 사용하여 램프 아래에 보이는 모든 점의 윤곽을 그립니다. 연필을 사용하여 램프 아래에 보이는 모든 점의 윤곽을 그립니다.

또 다른 가능한 시각화 기술은 산화제인 과망간산칼륨을 사용하는 것입니다. 핀셋을 사용하여 플레이트를 과망간산염 얼룩에 담그십시오.

종이 타월로 여분의 용액을 제거하고 두드리십시오. 흄 후드에서 히트 건으로 플레이트를 조심스럽게 가열하여 반점을 시각화하십시오. 연필을 사용하여 나타나는 점을 표시하십시오.

스폿이 시각화되면 여기에 표시된 것처럼 관심 물질을 표준과 비교할 수 있습니다. 이 예에서 미지의 것은 유기 합성의 빌딩 블록인 1,3-diphenylpropynone입니다. 밴드를 알려진 표준물질 및 출발 물질 중 하나인 염화벤조일과 비교함으로써 생성물을 식별할 수 있습니다.

지연 계수 또는 Rf는 알려지지 않은 화합물을 식별하는 데 사용됩니다. Rf는 화합물이 TLC 플레이트 위로 이동하는 거리와 이동상이 이동하는 거리의 비율입니다. 계수는 기준선에서 스폿까지의 거리를 측정하고 기준선에서 용매 선단까지의 거리로 나누어 측정합니다.

주어진 화합물의 Rf는 용매 선택, 흡착제의 두께 및 활성, 온도 및 샘플 크기를 포함하여 실험에 사용된 조건에 따라 달라집니다. 실험 간에 이러한 요인을 일관되게 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다.

박층 크로마토그래피에는 여러 가지 응용 분야가 있습니다.

이 예에서는 박쥐 피지선의 트리아실글리세라이드 함량을 연구했습니다. 지질 표면 분획은 먼저 TLC 플레이트의 극성에 의해 분리되었습니다. 그런 다음 트리아실글리세라이드 밴드를 주걱으로 플레이트에서 제거했습니다. 실리카 분말을 용매가 있는 마이크로 원심분리 튜브로 옮겼습니다. 원심분리 후, 고정상은 튜브 바닥에 남아 있고 화합물은 용매에 용해된 상태로 남아 있었습니다. 그런 다음 트리아실글리세리드를 다른 물리적 특성에 의해 더 분리했습니다. 이 경우, 분리의 두 번째 차원은 분자 크기였습니다.

TLC는 화학 반응의 진행을 모니터링하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 예에서는 반응의 출발 물질이 표준으로 사용되었으며 TLC 플레이트에서 반응 용액과 함께 실행되었습니다. 이 과정은 반응 과정 동안 특정 간격으로 반복되었습니다. 반응이 진행됨에 따라 출발 물질 띠가 감소하고 생성물 띠가 커졌습니다. 밴드에 변화가 없거나 출발 물질이 모두 소모되었을 때 반응이 완료되었습니다. ?

마지막으로, TLC 플레이트는 생물 검정에 사용할 수 있습니다. 이 예에서는 TLC를 사용하여 레드 클로버에서 화합물을 분리했습니다. 그런 다음 각 밴드를 한천 플레이트에서 자라는 박테리아에 배치했습니다. 박테리아 성장이 억제된 분자는 항균 특성에 대해 추가로 분석되었습니다.

당신은 방금 JoVE의 박층 크로마토그래피에 대한 소개를 시청했습니다. 이제 분리의 기본 이론, 실험에 적합한 이동상을 선택하는 방법, TLC 플레이트를 설정하고 작동하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!