X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

이 절차의 전반적인 목표는 생물물리학 및 구조 분석에 사용하기에 충분한 품질의 용해성 recumbinate T-세포 수용체 및 펩타이드 HLA 단백질을 생성하는 것입니다. 이 방법은 T세포 면역학 분야의 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, T 세포는 왜 암에 강력하게 반응하지 않는가?

이 기술의 가장 큰 장점은 T-세포 수용체가 표적을 인식하여 T-세포 매개 면역 반응을 유도하는 방법을 설명하는 매우 높은 해상도의 기계론적 데이터를 얻을 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 T 세포가 대부분의 면역 반응에서 중추적인 역할을 하기 때문에 거의 모든 인간 질병의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 T 세포 면역 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 수용체 리간드 상호 작용에 의해 제어되는 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생물물리학 및 구조 실험을 위한 충분한 품질의 용해성 활성 단백질을 생성하는 것이 매우 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 10 milometer dithiothreitol이 포함된 6ml의 guanidine buffer로 펩타이드 HLA refolding 절차를 시작하려면 HLA-A2 봉입체 30mg, beta 2-M 봉입체 30mg 및 원하는 관심 펩타이드 4mg을 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.

그런 다음 혼합물을 1리터의 HLA 재접힘 완충액으로 희석하고 섭씨 4도로 예냉각한 후 해당 온도에서 3시간 동안 혼합물을 저어줍니다. 20리터의 10밀리몰 트리스, pH 8.1에 대해 각각 24시간 동안 혼합물을 두 번 투석합니다. TCR 재접힘 절차를 시작하려면 10밀리몰 디티오트레이톨이 함유된 6ml의 구아니딘 완충액에 TCR 알파 및 베타 사슬 IB를 각각 30mg씩 추가합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하고 혼합물을 미리 냉각된 TCR 재접힘 완충액 1리터에 희석합니다. 펩타이드 HLA 혼합물과 동일한 방식으로 희석된 TCR 재폴드 혼합물을 교반 및 투석합니다. 투석된 재접힘 혼합물을 0.45마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다.

다음으로, 여과된 재접힘 제제 중 하나를 20ml의 10밀리몰 트리스, pH 8.1로 사전 평형화된 7.9ml 50마이크로미터 음이온 교환 수지 컬럼에 로드합니다. 염 구배 완충 시스템으로 단백질을 분당 5ml로 용리합니다. 1밀리리터 분획을 수집하고 SDS-Page로 분획을 분석합니다.

refolded 단백질을 포함하는 분획을 결합합니다. 단백질 혼합물을 10 kilodalton 분자량 컷오프 원심 농축기에 넣습니다. 혼합물을 20분 동안 원심분리하거나 4000배 g에서 혼합물을 500마이크로리터로 농축하는 데 필요한 만큼 오래 원심분리합니다.

플로우 스루를 버립니다. 농축된 단백질 준비물을 2ml 주입 루프로 성형하고 적절한 elusion buffer로 사전 평형을 이룬 24ml 크기의 배제 크로마토그래피 컬럼에 단백질을 주입합니다. 1 컬럼 부피의 완충액으로 단백질을 분당 0.5 밀리리터로 용리시킵니다.

1 밀리리터 분획을 수집하고, SDS-Page로 분획을 분석하고, 관심 단백질을 포함하는 분획을 결합합니다. 특정 TCR 펩타이드 HLA 상호작용의 KD보다 10배 위에서부터 10배 아래까지의 농도 범위에서, TCR 용액의 10회 연속 희석액을 준비합니다(알고 있는 경우). 그렇지 않으면 200마이크로몰의 TCR 농도에서 시작하십시오.

다음으로, 100 밀리몰과 N-하이드록시숙신이미드 및 400 밀리몰 EDC의 일대일 혼합물을 섭씨 25도에서 10분 동안 분당 10마이크로리터의 유속으로 칩 위에 흘려 카르복시메틸화 덱스트란 코팅 센서 칩을 활성화합니다. 그런 다음 4개의 플로우 셀 모두에 밀리리터당 200마이크로그램의 스트렙타비딘 110마이크로리터와 pH 4.5 10밀리몰의 아세테이트를 로드하여 칩 표면을 기능화합니다. 100마이크로리터의 1몰 에탄올아미드 염산염으로 남아 있는 반응기를 비활성화합니다.

다음으로, 반응 단위 수가 500에서 600으로 증가할 때까지 칩 제조업체가 제공한 버퍼에 약 1마이크로몰 펩타이드 HLA 용액을 분당 10마이크로리터로 칩 표면 위로 흐릅니다. 칩 표면을 1밀리몰의 비오틴과 제조업체에서 제공한 완충액으로 60초 동안 포화시킵니다. 그런 다음 TCR 용액의 10 연속 희석액을 섭씨 25도에서 분당 30 마이크로 리터로 주입합니다.

평형 결합 상수를 계산하고 동역학 해석을 실행합니다. 이러한 방식으로 일련의 SPR 실험을 수행하되 TCR 희석액이 주입되는 온도만 변경합니다. 각 온도에 대한 평형 결합 상수를 결정하고 Gibbs 에너지 및 기타 열역학 매개변수를 계산합니다.

비선형 회귀 피팅을 사용하여 온도에 대해 Gibbs 에너지를 연결합니다. 펩티드 HLA 해결책을 0.2 millimolar와 결정화 완충액에 3, 000 시간 g에 원심분리에 의해, 10 kilodalton 분자량 커트오프 원심 집중 장치에 집중하십시오. 공복합 결정화를 위해 1:1 TCR과 펩타이드 HLA의 0.1 밀리몰 용액을 준비합니다.

결정화 로봇과 스크리닝 키트를 사용하여 96웰 플레이트에서 좌식 낙하 기법을 사용하여 결정화 시험을 준비합니다. 각 저장소에는 60 마이크로 리터의 결정화 완충액이 있으며 각 방울은 각각 200 나노 리터의 단백질 용액과 완충액으로 구성됩니다. 섭씨 18도에서 결정을 성장시킵니다.

24시간, 48시간, 72시간 후, 그리고 매주 현미경으로 결정에 대한 점수를 매깁니다. 충분한 품질의 단결정이 성장하면 극저온 호환 루프로 단결정을 수확하고 결정을 액체 질소에 저장합니다. 100켈빈의 질소 가스 흐름 아래에서 싱크로트론 X선 회절을 수행하고 데이터를 분석하고 적절한 소프트웨어로 구조를 해결합니다.

해석된 구조로부터의 접촉, 곡면 상보성 및 교차 각도를 계산합니다. 이러한 방법을 사용하여 TCR 및 펩타이드 HLA 분자를 발현하고 용해성 형태로 다시 접혔습니다. 펩타이드 HLA 분자 내의 펩타이드는 gp100 항원이었습니다.

SPR은 다양한 온도에서 항원에 대한 PMEL17 TCR의 결합 친화도를 측정하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 SPR과 등온 열량 적정을 모두 사용하여 단백질-단백질 상호 작용의 열역학적 매개변수를 측정했습니다. PMEL17 TCR A2-YLE-9V 복합체를 결정화하여 싱크로트론 X선 회절로 평가하였다.

TCR CDR 루프와 TCR 단백질이 접촉한 펩타이드 HLA 잔기를 모두 확인하고 접촉의 특성을 연구했습니다. 펩타이드의 돌연변이된 형태를 가진 펩타이드 HLA 분자도 이러한 방식으로 정제 및 결정화되었습니다. TCR과의 결합 상호 작용을 방해할 수 있는 구조적 차이를 조사합니다.

세 번째 또는 다섯 번째 잔기의 돌연변이는 프롤린 4의 위치를 크게 변화시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 TCR CDR-3 알파 루프와의 많은 접촉을 방해할 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 추가 분석을 위해 가장 순수한 단백질만 선택하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 진단 및 추가 분석을 위해 환자 혈액에서 항원 특이적 T 세포를 분리하기 위해 용해성 단백질을 사용하여 펩타이드 HLA 테트라머 염색과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 T세포 면역학 분야의 연구자들이 TCR 펩타이드 HLA 결합을 정교하게 연구할 수 있는 길을 열었으며 암 및 기타 인간 질병에 대한 신약을 개발할 수 있도록 했습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생물물리학적 및 구조 분석을 수행하기에 충분한 품질의 TCR 및 펩타이드 HLA 단백질을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.