Name: 293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 293T 세포를 이용한 복제-결함 레트로바이러스 제조 방법입니다. 인간 온코진을 마우스 모델에 도입하여 골수증식성 질환을 연구하는 효율적인 기술을 익혀보세요.

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<ol><li> 3 - 5x10 6 셀 / 6cm 조직 cultureplate에서 변형, 플레이트 293T 세포 전에하세요. 참고 : 우리는 transfection하고 efficacyas 바이러스 생산 세포들의 편의를 위해 293T 세포를 사용합니다. 플라스미드 도우미가 도입되지 않는 한 이러한 세포가 바이러스를 포장에 부족한 수 있습니다. </li><li> 첫 번째 아침 부드럽게 매체를 제거하고 4 ML 293T 세포 의대 25 MM의 Chloroquine을 포함로 바꿉니다. 1 시간을위한 인큐베이터에 넣어. 참고 : 접시 약 80 % 합류해야합니다. </li><li> 한편, 5 ML 튜브에서 한 번에 두 접시를위한 바이러스 제작 혼합 준비 : <ol><li> 2 X 10 MG retroviral 플라스미드 구축 </li><li> 2 X 5 MG 포장 건설 (EcoPak) </li><li> 2 X 62 ML CaCl </li><li> 무균 ddH 2 O 1 ML 완료 참고 : retroviral 플라스미드 관심과 마커의 oncogene을 인코딩하는 동안 EcoPak는 개그 - POL - 환경을 인코딩합니다. 함께 293T 세포로, 그들은 ecotropic 마우스 세포에 대한 구체적인 레트로 바이러스 (RV),하지만 인간의 세포에 대한 infective를 생산합니다. Chloroquine과 CaCl 2 모두는 transfection 효율을 높이는 표시되었습니다. </li></ol></li><li> 2X sterileHBS의 1ml 부드럽게 튜브를 vortexing하면서 혼합물 드롭 현명한을 추가합니다. </li><li> 즉시 부드럽게 두 접시, 1 ML 각에이 솔루션을 추가 드롭하여 놓습니다. </li><li> 7-11 시간을위한 인큐베이터에 넣어. </li><li> 저녁 (7-11 시간. 이상)에서 부드럽게 매체를 제거하고 매우 부드럽게 5 ML 신선한 293T 매체로 바꿉니다. 정오, 다음날까지 인큐베이터에 넣어. 참고 :이 단계는 당신이 세포에서 chloroquine를 벗을 필요로 중요합니다. 오랜 기간 동안 보관하는 경우, chloroquine은 독성이다. 접시에있는 해결 방법은 transfection 혼합물의 아주 좋은, 먼지와 같은 강수로 인해 희미 보인다. 참고 : 세포 chloroquine에 의해 sensitized되어 있고, 쉽게 플레이트에서 분리 수있는, 극도의 온유와 모든 매체 변경을 수행하는 것이 중요합니다. </li><li> 그 다음날은 18 세 24 시간. 바이러스 (정오 정도) 검색하기 전에, 부드럽게 중간 제거하고 매우 부드럽게 3 ML 신선한 293T 매체로 바꿉니다. 보육 O / N.으로 바꾸기 </li><li> 세번째 아침 (18-24 시간. 나중에)는 부드럽게 18 G 바늘 장착되어 10 ML의 주사기와 매체 양식 접시를 빨아. 이 뜨는은 레트로 바이러스가 포함되어 있습니다. </li><li> , 45mm의 필터 주사기에 바늘을 변경 잘 솔루션을 혼합하기 위해 주사기를 여러 번 반전, 필터를 통해 뜨는 통과하고, cryotubes에서 나누어지는 참고 : 또는, 당신이 5 0 ML 원뿔 관에 바이러스, 수영장 같은 바이러스의 모든 supernatants을 3 + 번호판을 만드하는 경우. 필터링하여 cryotubes에 레트로 바이러스를 포함하는 나누어지는의 supernatants 다음 잘 섞는다. </li><li> 바이러스 전체 supernatants을 포함하고있는 튜브가 사용하기 전까지 -80 ° C에 보관됩니다. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

네 중요한 포인트는 좋은 바이러스 주식의 성공을 보장합니다 <ol><li> 293T 생산 세포들은 밀도에 도달 있도록, 그들은 매우 정기적인 일정에 따라 분할되었습니다 의미 매우 건강해야 자란 없었다면, 그리고 6cm 조직 문화 플레이트 당 3.5-5000000의 최적화된 밀도에 비쳐지게 만들려합니다 transfection의 아침에 접시의 80 %. </li><li> 셀 lysozomes을 안정화하고 핵에 도달 DNA의 분율을 증가하여 5 배 이상에 - chloroquine의 또한 약 3 transfection 효율 이후 바이러스 titer를 향상시킵니다. 나트륨 butyrate는 (다른 lysosome 안정제)도이 목적에 사용되고 있습니다. Chloroquine은 매체 7-11 시간을 변경하는 경우에는 생략할 수 있습니다. 이 시점에서 이후의 transfection이 필요하지 않습니다. </li><li> DNA의 품질은 매우 중요합니다. 벡터 및 포장 플라스미드 DNAs 모두의 정화의 선호하는 방법은 두 번 CsCl - e...

transfection에 사용된 모든 시약은 멸균 - 필터링 (CaCl 2, 2X HBS, miliQ H 2 O)와 멸균 보관해야합니다.

293t 세포의 과도 transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

BCR - ABL 또는 성장 인자 수용체 - 파생 oncogenes (ZNF198 - FGFR1, BCR - PDGFRα 등) 같은 oncogenes에 의해 유도된 우리 연구실 연구 인간 myeloproliferative 질병. 우리는 이전에 관심 oncogene을 표현하는 레트로 바이러스에 감염된 골수 세포를 이식함으로써, 우리의 마우스 모델에서 인간과 같은 질병을 모델 공부하실 수 있습니다. 복제 - 결함이있는 레트로 바이러스 인간 oncogene을 인코딩 및 마커 (GFP, RFP, 항생제 저항 유전자 등) 293T 세포, 아데노 바이러스 E1A 유전자 제품에 의해 변형 인간 신장 상피 세포주를 사용하여 과도 transfection 프로토콜에 의해 만들어진 것입니다. 최대 쉽게 달성 50-80%의 transfection 효율을 가진 293 세포는 인산 칼슘 (카포 4)에 의해 높은 transfectable되는 독특한 속성을 가집니다. 여기, 우리는 관심의 oncogene과 같은 포장이 경우 켓 또는 PCL을 구성 단일 게놈 EcoPak 플라스미드로 재갈 - POL - 환경을 포장 기능을 표현하는 플라스미드을 표현 retroviral 벡터와 함께 293 세포를 transfect에게 공동. 초기 transfection은 더욱 chloroquine의 사용에 의해 향상됩니다. ecotropic 바이러스의 주식, 문화 뜨는 48 시간으로 수집. 포스트 transfection은, C는 ° -80에 저장된 그런 다음 마우스 모델에서 이식에 사용할 수있는 변화의보기에 체외 연구에서 세포 - 선, 또는 마우스 골수 세포와 같은 기본 세포의 감염 사용할 수 있습니다 .

이 기술은 인간의 oncogene을 인코딩 복제 - 결함 retroviral 주식을 준비하는 효율적인 방법을 보여줍니다, 그리고 이후 마우스 모델에 myeloproliferative 질병의 유도에 사용.

293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

우리 연구실은 Bcr-Abl과 같은 온코진(oncogenes)이나 성장 인자 수용체 유래 온코진(ZNF198-FGFR1, ... 등)에 의해 유도되는 인간 골수증식성 질환을 연구합니다.

저희는 현재 Tufts New England Medical Center의 분자종양학 연구소에 나와 있습니다. 제 이름은 Christina Lesco이며, Dr. Rick Van 연구실의 박사후 연구원입니다. 저희 연구실은 인간 면역유전자 백혈병, CML 및 CML 유사 질환을 연구하고 있습니다.우리는 이 인간 질병을 생쥐 모델로 구현하고 있으며, 레트로바이러스 벡터를 통해 인간 종양 유전자를 도입하는 방식으로 진행하고 있습니다. 따라서 이 인간 종양 유전자를 생쥐 세포에 도입하기 위해 가장 먼저 해야 할 일은 바이러스 자체를 제작하는 것입니다. 그 다음 단계는 실제로 바이러스를 타이터링(titering)하는 것입니다.여기 2 9 3 T 세포 스톡 플레이트가 있습니다. PBS로 배지를 씻어내야 합니다. 2 9 3 T 세포는 부착 세포이지만, 부착력이 매우 강하지는 않으므로 모든 동작을 상당히 조심스럽게 수행해야 합니다. 세척이 완료되면 PBS를 트립신으로 교체하겠습니다.세포를 플레이트에서 분리하기 위해, 플레이트를 배양기에 약 3분 동안 다시 넣어두어야 합니다. 2~3분 후에 세포들이 실제로 부유 상태가 됩니다. 여기에 일반 배지를 몇 mL 더 추가하겠습니다.이렇게 하면 트립신이 중화됩니다. 이때 모든 세포가 적절히 부유 상태가 되도록 위아래로 파이펫팅을 수행하며, 부유액을 50 ml 튜브로 옮긴 후 트립판 블루(trypan blue) 존재 하에 헤모사이토미터를 사용하여 수동으로 세포 수를 측정합니다. 이제 계산된 대로 희석을 진행하며, 플레이트당 3 × 10⁶ 개의 세포를 분주하겠습니다.4 mL 배지에서 세포가 잘 도말되었는지 확인한 후, 보통 다음 날 아침이 되는 16~18시간 동안 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣어둡니다. 이제 GFP 바이러스 감염 후 48시간이 지났습니다. 클로로퀸은 세포에 투입할 DNA의 흡수율을 높이기 위해 사용됩니다.배지를 세포로부터 조심스럽게 흡입하여 제거하는데, 세포들은 이제 플레이트의 가장자리에 부드럽게 부착되어 있습니다. 이 단계에서 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 약 1시간 동안 둡니다. 그동안 세포에 적용할 DNA 혼합물을 준비하는데, 하나는 네오마이신 저항성 유전자를 발현하는 것이고 다른 하나는 실제로 GFP를 발현하는 것입니다. 전체 트랜스펙션을 제어하기 위해 XI DNA를 사용합니다.마지막으로, 염화 칼슘을 첨가합니다. 염화 칼슘을 사용하면 형질전환 효율이 크게 증가합니다. 한 시간이 지난 후, 클로로퀸 배지가 담긴 플레이트를 준비하여 형질전환 용액을 첨가하겠습니다.마지막 단계는 2x 멸균 HBS 1 ml를 실제로 첨가하는 것이며, H2 XHBS 용액을 넣으면서 진행합니다. 이때 튜브를 동시에 볼텍싱하며 천천히 한 방울씩 떨어뜨려야 합니다. 이는 침전물이 생기는 것을 방지하기 위함입니다. 즉시 용액 1 ml를 해당 플레이트에 분배하며, 이 과정 역시 한 방울씩 떨어뜨리며 수행합니다.이 시점에서 2 9 3 T 세포는 상당히 감작된 상태입니다. 이는 사용 중인 클로로퀸 배지 때문입니다. 모든 영역이 덮여 있어야 하며 플레이트를 최대한 적게 이동시켜야 합니다. 각 플레이트에 도입한 컨스트럭트를 표시하고, 다음 컨스트럭트에 대해 이 과정을 반복하십시오.이 시점에서 플레이트를 인큐베이터에 넣고 7~11시간 동안 배양합니다. 클로로퀸으로 인해 세포가 매우 민감해진 상태이므로 최소 7시간에서 최대 11시간을 넘기지 않아야 하며, 이 시간이 지난 후에는 배지를 교체해야 합니다. 현재는 트랜스펙션 후 약 30시간이 경과한 시점입니다.이 시점에서 배지를 마지막으로 교체하며, 2 9 3 C3 T 세포는 합류도(confluence)에 도달했습니다. 새로운 배지를 플레이트 측면에 넣을 때 다시 한번 매우 조심스럽게 처리해야 합니다. 저는 바늘이 달린 10 ml 주사기를 사용하고 있습니다.바늘을 필터로 교체할 예정이므로, 이 시점에서 배지를 충분히 혼합합니다. 수집된 바이러스는 사용 전까지 -80 °C에 보관할 수 있습니다. 가장 먼저 해야 할 일은 실제로 바이러스를 농축하는 것입니다. 바이러스를 제조하는 과정에는 몇 가지 민감한 단계가 있으며, 그중 첫 번째는 2 9 3 T 세포의 농도를 적절하게 맞추는 것입니다.우리는 10⁶ cells/plate의 밀도로 플레이팅하는데, 이는 18시간 후에 약 80% confluency에 도달하기 때문입니다. 이렇게 하면 세포가 더 성장할 수 있는 시간이 확보되어, 형질전환(transfection) 24시간 후에 100% confluency가 됩니다. 이러한 조건은 우수한 바이러스 타이터(virus titer)를 얻는 데 매우 중요한 것으로 밝혀졌습니다.다음 단계는 클로로퀸을 사용하는 것으로, 실제로 클로로퀸을 사용하면 2 9 3 세포가 민감해집니다. 2 9 3 T 세포 시트 전체가 플레이트에서 떨어지지 않도록 모든 배지 교체는 매우 조심스럽게 수행해야 합니다. 마지막으로, 바이러스 제작에 사용하는 DNA는 매우 순수해야 합니다. 여기서는 C-banded DNA를 사용합니다.바이러스를 확보한 후, -80°C에서 보관합니다. 보통 한 번씩 확인하는데, 각 단계마다 바이러스의 역가가 두 번 감소하게 됩니다. 따라서 실제 바이러스 역가 측정을 수행하기 전에, 제작한 바이러스를 동결 보관하는 것이 좋습니다.바이러스의 종류에 따라, 실제 감염된 세포를 추적하기 위해 바이러스와 함께 GFP 발현을 유도하거나 네오마이신(neomycin) 내성을 갖게 할 수 있습니다. 또한, 실험 간 또는 서로 다른 돌연변이체 간의 조건을 일치시키기 위해서는 바이러스를 사용하기 전에 실제로 바이러스 역가(titer)를 측정하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

lentiviruses을 만들려면, DNA 벡터는 인간의 293 세포에 transfected 수 있습니다. 수확 후 뜨는을 집중, 바이러스 titer는 흐름 cytometer로 형광 표현식에 의해 결정됩니다.

Lentivirus 제작

Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

이 프로토콜에서는 생산, 정제 및 lentiviral 벡터의 적정을 설명합니다. 우리는 기본 교양 뉴런과 astrocytes의 lentiviral 벡터 매개 유전자 전달의 예제를 제공합니다. 우리의 방법은 다른 세포 유형에도 적용될...

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을...

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

여기에서는 Tfap2c, Gata3, Eomes 및 Ets2의 10일 과발현을 통해 쥐 배아 섬유아세포를 완전한 기능을 갖춘 안정적인 영양막아세포 줄기세포로 직접 전환하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

우리는 세포 효능의 주입 연구를 위한 충분한 수에 있는 관심 있는 유전자의 우수한 공동 발현을 가진 세포를 산출하는 rhesus macaque 말초 혈액 단핵 세포의 transduction 그리고 확장을 위한 9 일 프로토콜을 개략적으로 설명합니다.

중앙 메모리 표현형의 유지 보수와 함께 9 일 만에 1 차 T 세포의 전환 및 확장

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

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