293T 세포의 과도 Transfection하여 복제 - 결함이 레트로 바이러스의 생산

저희는 현재 Tufts New England Medical Center의 분자종양학 연구소에 나와 있습니다. 제 이름은 Christina Lesco이며, Dr. Rick Van 연구실의 박사후 연구원입니다. 저희 연구실은 인간 면역유전자 백혈병, CML 및 CML 유사 질환을 연구하고 있습니다.

우리는 이 인간 질병을 생쥐 모델로 구현하고 있으며, 레트로바이러스 벡터를 통해 인간 종양 유전자를 도입하는 방식으로 진행하고 있습니다. 따라서 이 인간 종양 유전자를 생쥐 세포에 도입하기 위해 가장 먼저 해야 할 일은 바이러스 자체를 제작하는 것입니다. 그 다음 단계는 실제로 바이러스를 타이터링(titering)하는 것입니다.

여기 2 9 3 T 세포 스톡 플레이트가 있습니다. PBS로 배지를 씻어내야 합니다. 2 9 3 T 세포는 부착 세포이지만, 부착력이 매우 강하지는 않으므로 모든 동작을 상당히 조심스럽게 수행해야 합니다. 세척이 완료되면 PBS를 트립신으로 교체하겠습니다.

세포를 플레이트에서 분리하기 위해, 플레이트를 배양기에 약 3분 동안 다시 넣어두어야 합니다. 2~3분 후에 세포들이 실제로 부유 상태가 됩니다. 여기에 일반 배지를 몇 mL 더 추가하겠습니다.

이렇게 하면 트립신이 중화됩니다. 이때 모든 세포가 적절히 부유 상태가 되도록 위아래로 파이펫팅을 수행하며, 부유액을 50 ml 튜브로 옮긴 후 트립판 블루(trypan blue) 존재 하에 헤모사이토미터를 사용하여 수동으로 세포 수를 측정합니다. 이제 계산된 대로 희석을 진행하며, 플레이트당 3 × 10⁶ 개의 세포를 분주하겠습니다.

4 mL 배지에서 세포가 잘 도말되었는지 확인한 후, 보통 다음 날 아침이 되는 16~18시간 동안 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣어둡니다. 이제 GFP 바이러스 감염 후 48시간이 지났습니다. 클로로퀸은 세포에 투입할 DNA의 흡수율을 높이기 위해 사용됩니다.

배지를 세포로부터 조심스럽게 흡입하여 제거하는데, 세포들은 이제 플레이트의 가장자리에 부드럽게 부착되어 있습니다. 이 단계에서 플레이트를 다시 인큐베이터에 넣고 약 1시간 동안 둡니다. 그동안 세포에 적용할 DNA 혼합물을 준비하는데, 하나는 네오마이신 저항성 유전자를 발현하는 것이고 다른 하나는 실제로 GFP를 발현하는 것입니다. 전체 트랜스펙션을 제어하기 위해 XI DNA를 사용합니다.

마지막으로, 염화 칼슘을 첨가합니다. 염화 칼슘을 사용하면 형질전환 효율이 크게 증가합니다. 한 시간이 지난 후, 클로로퀸 배지가 담긴 플레이트를 준비하여 형질전환 용액을 첨가하겠습니다.

마지막 단계는 2x 멸균 HBS 1 ml를 실제로 첨가하는 것이며, H2 XHBS 용액을 넣으면서 진행합니다. 이때 튜브를 동시에 볼텍싱하며 천천히 한 방울씩 떨어뜨려야 합니다. 이는 침전물이 생기는 것을 방지하기 위함입니다. 즉시 용액 1 ml를 해당 플레이트에 분배하며, 이 과정 역시 한 방울씩 떨어뜨리며 수행합니다.

이 시점에서 2 9 3 T 세포는 상당히 감작된 상태입니다. 이는 사용 중인 클로로퀸 배지 때문입니다. 모든 영역이 덮여 있어야 하며 플레이트를 최대한 적게 이동시켜야 합니다. 각 플레이트에 도입한 컨스트럭트를 표시하고, 다음 컨스트럭트에 대해 이 과정을 반복하십시오.

이 시점에서 플레이트를 인큐베이터에 넣고 7~11시간 동안 배양합니다. 클로로퀸으로 인해 세포가 매우 민감해진 상태이므로 최소 7시간에서 최대 11시간을 넘기지 않아야 하며, 이 시간이 지난 후에는 배지를 교체해야 합니다. 현재는 트랜스펙션 후 약 30시간이 경과한 시점입니다.

이 시점에서 배지를 마지막으로 교체하며, 2 9 3 C3 T 세포는 합류도(confluence)에 도달했습니다. 새로운 배지를 플레이트 측면에 넣을 때 다시 한번 매우 조심스럽게 처리해야 합니다. 저는 바늘이 달린 10 ml 주사기를 사용하고 있습니다.

바늘을 필터로 교체할 예정이므로, 이 시점에서 배지를 충분히 혼합합니다. 수집된 바이러스는 사용 전까지 -80 °C에 보관할 수 있습니다. 가장 먼저 해야 할 일은 실제로 바이러스를 농축하는 것입니다. 바이러스를 제조하는 과정에는 몇 가지 민감한 단계가 있으며, 그중 첫 번째는 2 9 3 T 세포의 농도를 적절하게 맞추는 것입니다.

우리는 10⁶ cells/plate의 밀도로 플레이팅하는데, 이는 18시간 후에 약 80% confluency에 도달하기 때문입니다. 이렇게 하면 세포가 더 성장할 수 있는 시간이 확보되어, 형질전환(transfection) 24시간 후에 100% confluency가 됩니다. 이러한 조건은 우수한 바이러스 타이터(virus titer)를 얻는 데 매우 중요한 것으로 밝혀졌습니다.

다음 단계는 클로로퀸을 사용하는 것으로, 실제로 클로로퀸을 사용하면 2 9 3 세포가 민감해집니다. 2 9 3 T 세포 시트 전체가 플레이트에서 떨어지지 않도록 모든 배지 교체는 매우 조심스럽게 수행해야 합니다. 마지막으로, 바이러스 제작에 사용하는 DNA는 매우 순수해야 합니다. 여기서는 C-banded DNA를 사용합니다.

바이러스를 확보한 후, -80°C에서 보관합니다. 보통 한 번씩 확인하는데, 각 단계마다 바이러스의 역가가 두 번 감소하게 됩니다. 따라서 실제 바이러스 역가 측정을 수행하기 전에, 제작한 바이러스를 동결 보관하는 것이 좋습니다.

바이러스의 종류에 따라, 실제 감염된 세포를 추적하기 위해 바이러스와 함께 GFP 발현을 유도하거나 네오마이신(neomycin) 내성을 갖게 할 수 있습니다. 또한, 실험 간 또는 서로 다른 돌연변이체 간의 조건을 일치시키기 위해서는 바이러스를 사용하기 전에 실제로 바이러스 역가(titer)를 측정하는 것이 매우 중요합니다.