초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

이 절차의 전반적인 목표는 광간섭 현미경 기술을 사용하여 생체 내에서 초파리의 심장 기능을 세로로 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 초파리 변태 중 심장 직경, 심박수 및 심장 활동 기간의 변화와 같은 지표를 제공함으로써 초파리 심장 구조 및 기능 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광간섭 현미경 검사가 높은 공간 및 시간 해상도로 작은 동물의 심장을 비침습적으로 이미징할 수 있다는 것입니다.

이 기술은 초파리와 척추동물 사이에 존재하는 유전적 유사성으로 인해 인간 심장 질환의 메커니즘과 심장 발달과의 관계를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 동물 모델에서 약화된 심박 조율기 기능을 연구하거나 치료하기 위한 광유전학적 페이싱과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 실험을 위해 파리를 생산할 때 생식 부모 파리가 짝짓기를 하고 신선한 유리병에 8시간 동안 알을 낳도록 합니다.

따라서 낳은 알의 클러치는 비슷한 나이의 파리로 발전 할 것입니다. OCM 이미징을 위해 유충을 장착하려면 먼저 양면 테이프 조각으로 깨끗한 면을 준비합니다. 테이프 아래에 갇힌 기포를 밀어냅니다.

그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 바이알에서 올바른 크기의 유충을 제거합니다. 깨끗한 티슈에 유충을 놓습니다. 물에 적신 솔을 사용하여 붙은 음식물을 제거한 다음 말리십시오.

이제 광시야 현미경으로 유충의 발달 단계를 확인하십시오. 그런 다음 장착을 위해 등쪽이 위쪽을 향하도록 유충을 배치합니다. 그런 다음 끈적끈적한 슬라이드를 유충 위로 내리고 적당한 압력을 사용하여 테이프에 고정합니다.

장착된 유충을 조정 가능한 스테이지에 놓습니다.tage 등쪽이 위쪽을 향하도록 y-가로 방향을 따라 OCM 시스템의 e. 무대에 있는 작은 구멍은 유충이 무대 평면과 접촉하지 않도록 합니다. 심장관의 넓은 내강은 A5 분절에서 A8 분절까지 발견됩니다. 컴퓨터의 실시간 이미지를 사용하여 심장관의 뒤쪽 영역을 찾고 A7 세그먼트가 보일 때까지 스테이지를 앞으로 이동합니다.

이제 이미지 획득의 매개변수를 설정합니다. B 스캔당 100개의 A 스캔을 사용하고 100개의 B 스캔을 사용합니다. 그런 다음 스캐너 전압을 x-가로 방향으로 약 0.28mm를 커버하도록 설정하고 y-가로 방향으로 0볼트로 설정합니다.

다음으로, 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하고 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하여 배경 빼기를 위한 배경 노이즈 데이터를 수집합니다. 횡방향 M 모드 이미지를 수집하려면 매개변수를 B 스캔당 128개의 A 스캔으로 조정하고 4, 096 B 스캔을 사용합니다. 그런 다음 이전과 같이 x 방향으로 0.28mm, y 방향으로 0볼트를 커버하도록 전압을 다시 조정합니다.

그런 다음 파리 심관의 A7 세그먼트의 횡방향 M 모드에서 이미지를 획득합니다. 데이터 저장 프로세스 중에는 어두운 천으로 이미징 빔을 차단하여 샘플 표본에 대한 빛 노출을 최소화합니다. 심장 기능을 안정적으로 측정하기 위해 심장을 5회 이미지화합니다.

3차원 이미지를 수집하려면 B-스캔당 400개의 A-스캔, 800개의 B-스캔을 사용하고, x-횡방향에서 1.7mm, y-횡방향에서 약 4mm의 전압을 사용합니다. 그런 다음 현미경 스테이지를 이동하여 전체 플라이를 관찰하고 초점을 조정하여 선명한 이미지를 볼 수 있습니다. 유충을 제거하려면 젖은 부드러운 브러시를 사용하여 지속적인 개발과 종단 연구를 위해 신선한 음식이 담긴 새 바이알로 옮깁니다.

심장관의 넓은 내강은 번데기 PD1에서 A5 - A8 분절에 남아 있습니다. PD1에서 L2 및 L3 단계 유충과 마찬가지로 A7 세그먼트를 이미지화하려고 노력하십시오. PD1 번데기는 흰 번데기로 식별됩니다.

이 시간 창은 높은 투명도로 인해 OCM 이미징을 위한 더 높은 빛 투과율로 이어지기 때문에 초기 번데기의 광학 이미징을 수행하는 데 이상적입니다. 몸에 음식이 붙어 있으면 브러시로 번데기를 청소하십시오. 젖은 브러시를 사용하여 번데기를 작은 유리 슬라이드에 장착하고 등쪽이 위를 향하도록 합니다.

슬라이드는 자체 챔버에서 동물의 발달을 보존하기 위해 플라이 튜브에 맞아야 합니다. 번데기의 여분의 물을 건조시킨 다음 번데기가 위를 향하도록 무대에 놓고 유충과 함께 한 것처럼 A7 세그먼트를 이미지화합니다. 이미징 후 번데기가 있는 유리 슬라이드를 튜브로 옮겨 지속적인 배양을 위해 합니다.

PD1 단계 후, PD2에서 시작하여 A1과 A4 세그먼트 사이에 원추형 챔버가 발달하기 시작합니다. 번데기는 점점 더 불투명해지기 때문에 이미징 시스템의 침투 깊이가 줄어듭니다. PD2에서 번데기 껍질은 황색을 띠고 몸체는 PD1보다 덜 투명합니다.

PD3에서 번데기의 색은 PD2 단계보다 약간 더 어둡습니다. PD4 단계에서는 껍질 내부에 검은색 줄무늬가 관찰될 수 있습니다. 일부 PD4는 성인으로 발달하고 다른 PD4는 PD5 단계로 들어갑니다.

PD5 단계에서는 검은색 줄무늬가 훨씬 더 뚜렷합니다. 핀셋을 사용하여 PD2 번데기를 집어 슬라이드에 장착합니다. OCM 시스템에서 심장관의 앞쪽 끝을 찾은 다음 뒤쪽으로 약 50미크론을 이동하여 심장관의 A1 세그먼트를 찾습니다.

PD2 단계에서는 심장의 원뿔 방이 매우 작아서 아직 박동하지 않을 수 있습니다. 앞에서 설명한 대로 이미징을 진행합니다. PD3, PD4 및 PD5 단계에서 초파리를 이미징하기 위해 동일한 절차를 반복합니다.

시작하려면 성충 파리를 약 45밀리리터 용량의 빈 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 면 어플리케이터를 마취액에 담그고 면 마개 바로 아래에 면 끝이 있는 막대를 유리병에 넣습니다. 3분 동안 기다립니다.

성충 파리는 크기에 따라 2분 30초에서 3분 30초 동안 마취됩니다. 이제 양면 테이프로 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 마취된 파리를 등쪽이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드로 이동합니다.

광시야 현미경에서 핀셋을 사용하여 날개를 분리하고 테이프에 붙여서 이미징을 위해 심장 부위를 노출시킵니다. 이제 앞서 설명한 이미징 기술을 사용하여 심장의 A1 분절을 이미지화하고 실험이 끝날 때 파리를 희생합니다. 종방향 심장 영상은 24B-GAL4 드라이버 1개와 함께 스트레인 플라이를 사용하여 수행되었습니다.

유충 단계에서 심장관은 더 넓은 내강을 가진 후복부 부위 A8에서 시작하여 더 좁은 직경을 가진 앞쪽 등쪽 분절 A1에서 끝납니다. PD2 후반부에 원뿔형 챔버가 A1에서 A4 세그먼트에서 발생하기 시작했습니다. 플라이 심박수는 횡방향 M 모드 OCM 이미지에서 정량화되었습니다.

흥미롭게도, 번데기 단계에서는 심장 박동이 이따금 멈췄다. 전반적으로 심장 박동은 애벌레 단계에서 번데기 단계로 크게 느려졌다가 번데기에서 성충으로 상당히 증가했습니다. 이러한 개발 이후, 이 기술은 발달 심장학 분야의 연구자들에게 초파리 모델에서 심장 발달에 대한 다양한 유전자의 영향을 탐구할 수 있는 새로운 도구를 제공했습니다.

이 절차를 시도하는 동안 각 발달 단계에서 이미지를 생성하기 위해 초파리의 발달을 주의 깊게 추적하는 것이 중요합니다.