Name: 초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 배우세요 초파리 심장 기능의 생체 내 세로 이미징 방법을 광학 간섭 현미경(OCM)을 사용하여. 이 기술은 심장 직경, 심박수 및 변태 기간 동안의 활동을 정량적으로 측정하여 심장 발달 및 질병 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 리하이 대학교 스타트업 펀드, NIH(R00EB010071는 C.Z.로, R15EB019704는 C.Z. 및 A.L.로, R03AR063271는 A.L.로, R01AG014713 및 R01MH060009는 R.E.T.), NSF(1455613는 C.Z. 및 A.L.), Cure Alzheimer's Fund(R.E.T.로) 및 Massachusetts General Hospital(A.L.에 대한 연구 상 집행 위원회)의 지원을 받았습니다. M.C.와 Y.M.은 National Key Basic Research Program의 지원을 받았습니다. 보조금 번호 2014CB340404에 따른 중국(973 프로그램).

초파리 (16)의 광학 이미징에 대한 OCM 시스템의 1. 준비 <ol><li> 분광기 및 OCM 시스템 초파리의 하트 비트를 해석 할 수 있도록 적어도 80 프레임 / 초의 프레임 속도를 제공하는 고속의 라인 스캔 카메라를 선택한다. </li><li> 초파리의 핵심 구조를 식별하기 위해 2 ㎛, 축 해상도를 보장하는 광대역 광원을 사용한다. </li><li> 높은 가로 해상도를 얻기 위해 10X 목표를 사용합니다. </li><li> 기준 암부 광속을 반사하고, 시험편의 초점 심도를 확장하는 환형 샘플 아암 광빔을 생성하는 45 ° 막대 거울을 사용한다. </li><li> OCM이 시스템을 제어하고 측정을 수행하는 사용자 컴퓨터 프로그램을 개발한다. </li></ol> 2. 초파리 문화 <ol><li> 표준 비행 음식 준비 <ol><li> 폴리스티렌 유리 병에 ~ 5 ml의 인스턴트 초파리 수식을 넣어종이 슈트의 도움 튜브. </li><li> 제대로 음식을 포화 식으로 ~ 8 ml의 물을 붓고. </li><li> 다른 실험에 대한 표준 비행 음식에 다른 보충제를 추가합니다. 실험 35 페이싱 optogenetic에 대한 모든 - 트랜스 레티 날 (ATR) 음식을 준비 할 때, 100 mM의 ATR를 추출하여 식품 1 ㎜의 ATR 농도를 얻을 수 ml의 8 ~에 물을 용해 할 수있는 피펫을 사용합니다. 균일 용액을 혼합 한 후, 화학식로 용액을 붓고 충분히 교반한다. </li><li> 전자 레인지에 30 초 동안 컵과 열을 15 ml의 물과 함께 ~ 10, 15 믹스, 초파리에서 비만 관련 심장 기능 장애 연구 10 ml의 공식을 높은 지방 다이어트를 준비합니다. 다른 컵에 일부 유기농 엑스트라 버진 코코넛 오일을 넣고 전자 레인지에 90 초 정도 가열한다. </li><li> 충분히 음식 ~ 30/100 및 제 코코넛 오일의 중량 / 부피 비율을 7.5 ml의 코코넛 오일을 추출하고, 제조 된 화학식 섞어음식을 혼합 추출물 ~ 2 ml의 욕실 튜브의 바닥에 넣어. </li><li> 매체가 완전히 포화 될 때까지 1 분 동안 기다립니다. 초파리 대한 생활 조건을 최적화하기 위해 평평한 신중 음식을 압축. 준비된 공식 효모의 8 곡물, 면화의 클러스터와 튜브를 연결 - 6을 추가합니다. </li></ol></li><li> 과일 비행 십자가와 문화 <ol><li> 준비된 표준 플라이 음식 튜브를 타고와 연결면을 제거합니다. 조심스럽게 튜브 (남성과 여성) 성인 파리를 전송하고 즉시면에 튜브를 연결합니다. 면 튜브로부터 빠져 나가는 파리 방지 튜브 벽 사이에 틈이 생기지 않도록하려면면을 확인한다. </li><li> 교차 사육을 위해 25 ° C에서 인큐베이터에서 초파리를 유지합니다. 유전자의 대부분은 활성 및 세포 단백질은 25 ° C 36 ~ 39에서 합성된다. </li><li> 8 손 전송 ㄱ 후 인큐베이터에서 튜브를 꺼내는 Dult 실험 제어를위한 비슷한 나이에 알을 얻기 위해 관 밖으로 날아갑니다. </li><li> 8.5 40, 41 일의 개발 기간이 초파리 개발 표준 온도 25 ° C에서 인큐베이터에서 계란을 계속 배양. 참고 : 온도가 발달 기간 (성인에 계란) 및 다양한 유전자의 발현에 영향을 미친다. </li></ol></li></ol> 3. OCM와 광학 이미징을 수행 <ol><li> 광학 이미징에 대한 마운트 플라이 유충 참고 : 22 초파리 해치의 달걀 - 첫 번째 령 유충 (L1)에 25 ° C에서 24 시간. 두 번째 령 유충은 또 다른 24 시간 후에 나온다. 가장 큰 애벌레 형태는 약 24 시간 후 털갈이 세 번째 령 유충입니다. 유충의 구조적 특성들은 상이한 발달 단계를 구별하는데 사용될 수있다. 제 령 및 제 령의 입 부분의 크기는 다르다. 입첫 번째 령 유충의 후크가 매우 작고 두 번째 령 유충의 입 고리가 더 크고 구조가 명확하지만, 작은 검은 점 두 쌍처럼 보인다. spiracles 보통 초 령 및 제 령을 식별하는 데 사용된다. 세 번째 령를 들어, 전방 spiracles이 분기되며, 반면에 두 번째 령 유충은 앞쪽에 spiracles을 때리는했다. 어두운 오렌지 링은 세 번째 령 유충의 후부 spiracles의 끝에서 나타나기 시작합니다. <ol><li> 깨끗한 현미경 유리 슬라이드에 양면 테이프의 조각을 적용합니다. 촬상시의 기포에 의한 반사를 방지하기 위해 테이프 하에서 기포를 배출. </li><li> 애벌레 단계에서 인큐베이터 밖으로 배양 파리와 튜브 중 하나를 수행합니다. </li><li> 미디어에 유충을 확인 깨끗한 조직에 부드러운 브러시와 장소 미디어에서 제거합니다. 젖은 부드러운 브러시로 유충에 붙어 음식을 제거하고 조직에 건조. </li><li> 소독기 이동넓은 필드 현미경의 대물 렌즈에서 조직에 도착하는 거라고. </li><li> 파리의 명확한 뷰를 찾기 위해 현미경의 초점을 조정합니다. 현미경과의 구조적 특성에 의해 유충의 오른쪽 발달 단계를 확인합니다. </li><li> 부드러운 브러쉬를 사용하여 비행을 배치합니다. 몸이 똑바로 지느러미 옆 유리 슬라이드에 장착하기위한 준비를 위쪽으로 향하게 지느러미면이 있는지 확인하십시오. 현미경이 단계를 수행합니다. </li><li> 유충이 테이프에 장착하기 전에 완전히 건조해야합니다. 그렇지 않으면, 유충은 테이프에 부착되지 않습니다. </li><li> 적당한 압력으로 유리 슬라이드에 양면 테이프에 위치 파리의 지느러미 측면 스틱. 촬영하는 동안 움직임을 비행 이어질 것 즉시 너무 작은 힘을 죽일 수 너무 많은 압력을합니다. </li></ol></li><li> OCM와 애벌레 스테이지 (L2 및 L3)에서 초파리의 광학 이미징 참고 : 심장 튜브의 광범위한 루멘이 fo를 할 수 있습니다싶게 애벌레 단계에서 A8에 A5 사이의 세그먼트에 위치 (그림 1). 횡 OCM M 모드 화상 (2D + 시간) 수축기 및 확장기 분석을 용이하게하기 위해 각각의 유충 중심 관의 A7 세그먼트에서 획득 하였다. <ol><li> 대물 렌즈 아래에서 위로 향하게 지느러미 측면의 y 가로 방향의 OCM 시스템의 조정 샘플 무대에 탑재 된 애벌레를 놓습니다. 시료 대에 작은 구멍을 스테이지면과의 접촉을 피하도록 유충을 배치 할 필요가있다. </li><li> 열매의 중심 관 이미징 빔의 초점면까지의 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 용이 A7 세그먼트를 찾기 위해, 실시간 화상 획득 소프트웨어 단면 OCM 이미지와 중심 관의 구치부를 찾는. A7 세그먼트가 볼 때까지 앞으로 단계를 이동합니다. </li><li> 세트 B 스캔 100 A-스캔 (프레임) (100) B-스캔으로 화상 획득 소프트웨어 파라미터 및 scanneR 전압 ~ 0.28의 x 폭 방향 mm, 및 Y-가로 방향의 V 0을 포함한다. 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하여 배경 공제에 대한 배경 잡음 데이터를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 백 프레임 (3)은 배경 차감을 위해 사용될 수있다. </li><li> B 주사 당 128 A-스캔 4096 B-스캔 스캐너 전압 데이터 수집 소프트웨어의 집합 파라미터들은, Y 가로 방향은 X 가로 방향 ~ 0.28 mm, 0 V를 포함한다. 약 30 초 동안 0.28 X 0.57 mm (2)를 커버하는 영역에 즉시 심장 튜브의 A7 세그먼트에 걸쳐 가로 M 모드 이미지를 수집하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> 촬상 광 플라이 심장의 긴 노출을 방지하기 위해, 데이터 저장 과정에서 어두운 천을 사용하여 이미징 빔을 차단. </li><li> 심장 재미 신뢰할 수있는 측정을 얻기 위해 5 회 측정을 반복ction. </li><li> B 주사 당 400 A-스캔 800 B-스캔 스캐너 전압 화상 획득 소프트웨어 파라미터 설정은 X 가로 방향 ~ 1.7 mm를 커버하고, Y 가로 방향으로 4 ~ mm한다. 전체 과일 파리가 이미지화 할 수 있도록 양방향으로 무대를 이동합니다. 3 차원 초파리의 이미지를 얻기 위해 하나의 데이터 집합을 획득하기 위해 소프트웨어의 &quot;시작&quot;버튼을 클릭합니다. 주 : 3D 플라이 구조 아미라 3D 소프트웨어를 사용하여 표현 될 수있다 </li><li> 측정 된 파리를 묻혀 살짝 유리 슬라이드에서 제거 젖은 부드러운 브러시를 사용합니다. 지속적인 개발을위한 별도의 튜브로 이동합니다. 다음 발달 단계를 통해 종 연구를위한 튜브를 레이블. </li></ol></li><li> 번데기의 단계에서 이미지 초파리 참고 : 모든 과일 파리는 PD1에서 PD5에 이미징 꺼냈다. 도 1b에 유충 회로도에 도시 된 바와 같이, 넓은 관강은 번째의 세그먼트 A8 A5 유지PD1까지 전자 심장 튜브. PD2에서 원추형 챔버는 A4 세그먼트에 A1 사이에서 발생하기 시작한다. 일관된 이미지를 수집하고 심장의 분석을 용이하게하기 위해, 횡 M 모드 이미지 PD1에서 A7 세그먼트로부터 수득하고,도 1B에 표시된 바와 같이, PD2 후 A1 세그먼트에서. <ol><li> PD1에서 이미지 초파리 참고 : 초파리는 짧은 시간 창 흰색 puparium해야합니다 - PD1 동안 (0, 1 시간). 이 시간 창은 높은 투명성이 OCM 영상에 대한 높은 빛의 침투에 이르게하기 때문에 조기 번데기의 광학 이미징을 수행하기에 적합합니다. <ol><li> 그들은 번데기가 될 때 초파리는 튜브 벽에서 찾을 수있는 바와 같이, 젖은 부드러운 브러시로 PD1에서 이미지에 대한 개별 튜브에서 번데기를 제거하고 몸에 붙어있는 음식이있는 경우 브러시와 번데기를 청소합니다. </li><li> 직접 젖은 브러시로 작은 유리 슬라이드에 초파리를 탑재하고 위로 향하게 지느러미 측면을 유지 (그림 1a </str옹&gt;). 유리 슬라이드는이 단계에서 영상이 완료되면 튜브로 다시 맞게 충분히 작은 있는지 확인합니다. </li><li> 즉시 본체의 측면에서 과도한 물을 제거합니다. </li><li> 상단에 초파리를 유지하면서 OCM 시스템의 샘플 무대에서 유리 슬라이드를 넣습니다. 유충 측정에 설명 된 것과 동일한 전략을 이용하여 비행 마음의 A7 세그먼트의 명확한 실시간으로 이미지를 찾을 수 있습니다. </li><li> 섹션 3.2에서와 같이, 데이터 수집 소프트웨어의 동일한 매개 변수를 설정하고, 이미지 A7 세그먼트에서의 하트 비트 횡 M 모드 및 3D 이미지를 획득. </li><li> 촬영 후, 다시 연속 배양 용 튜브에 번데기와 유리 슬라이드를 배치하기 위해 트위터를 사용합니다. </li></ol></li><li> PD5의 단계에 PD2에서 이미지 초파리 주 : 시험편 더 불투명 번데기 단계 동안지기 때문에, 촬상 장치의 투과 깊이가 감소된다. <ol><li> 신중 유리 S를 제거하는 집게를 사용하여LIDE은 이미징을위한 튜브에서 PD2에서 비행 장착. PD2에서 시험편 쉘 황색이되고 본체 PD1 (도 1)에 비해 덜 투명해진다. </li><li> OCM 시스템의 샘플 무대에 슬라이드를 넣습니다. </li><li> OCM이 시스템의 이미징 빔의 초점면에 비행 이동 시료 스테이지를 조절. 실시간 단면 OCM 이미지 심장 튜브의 앞쪽 끝을 찾을 수 있습니다. 심장 튜브의 A1 세그먼트를 찾기 위해 다시 후방 방향으로 ~ 50 μm의 이동합니다. 참고 : 심장 개발 (PD2)의이 시점에서, 원추형 챔버는 매우 작은되며 박동되지 않을 수 있습니다. </li><li> 이전 발달 단계와 동일한 방법을 이용하여 횡 A1 세그먼트로부터 M 모드 데이터 세트뿐만 아니라, 3 차원 데이터를 수집한다. </li><li> 연속 배양주의 깊게 튜브로 다시 슬라이드를 넣습니다. 주 : PD3에서, 쉘의 시험편의 색 PD2 단계에서보다 더 어둡다. PD4 단계에서, 검은 색 줄무늬가 캘리포니아n은 표본의 쉘 내부에 관찰 될 수있다. 다른 사람이 PD5로 진화하면서 일부 파리, 다음 날에이 단계에서 성인으로 개발할 것입니다. PD5 단계에서, 검은 색 줄무늬가 더욱 분명 초파리에서 볼 수 있습니다. 이 파리는 다음 날 성인이 될 것입니다. </li></ol></li></ol></li><li> 성인 단계에서 이미지 초파리 주 : 성인 단계에서 암수 파리 상기 본체의 크기 및 하복부의 컬러에 의해 구별 될 수있다. 남성은 작고 어두운 색의 하복부에있는 동안 여성 성인, 큰 크기를 가지고있다. <ol><li> 초파리가 성인으로 발전 할 때 인큐베이터에서 튜브를 꺼내, 그리고 성인이 ~ 45 ml의 빈 유리 병에 도착 전송합니다. </li><li> , 마취에 지팡이의 흡수 끝 (~ 1cm 길이, 2 ~ 3 mm 직경)를 찍어 유리 병에 지팡이를 넣어 바로 연결면 아래와로 마취 끝을 유지하는면의 클러스터와 튜브를 연결 anes3 분 동안 비행을 thetize. 마취의 지속 시간은 비행의 크기에 따라 달라집니다 및 분 3.5-2.5 사이에 다를 수 있습니다 (예 : 분 3 여성, 최소 2.5 남성 또는 3.5). </li><li> 양면 테이프의 조각 유리 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 등쪽면이 위를 향 부드러운 브러시를 사용하여 유리 슬라이드 상에 마취 비행 이동합니다. </li><li> 트위터를 사용하여 날개를 분리하고 즉시 수정 및 이미징의 심장 영역을 노출하는 현미경 테이프의 날개 스틱. </li><li> 이미지 플라이 마음의 A1 세그먼트에서 파리 (그림 1). 실험의 끝에, 플라이 희생 될 수있다. </li></ol></li></ol> 4. 이미징 분석 (16) <ol><li> 화상 파일 화상 획득 소프트웨어에 수집 된 2D 및 3D 이진 파일을 변환 매트랩 프로그램을 개발한다. </li><li> creat에하는 횡 M 모드 이미지에서 심장 튜브 영역과 마법의 지팡이 알고리즘을 식별 할 수 ImageJ에를 사용하여각 횡 M 모드 이미지의 심장 지역의 개 마스크입니다. 세그먼트 마스크 영역과 수축기 및 이완기의 위치를 ​​식별하는 피크 발견 알고리즘을 사용한다. 가로 M 모드 이미지의 시간 의존 심장 직경의 변화를 계산합니다. </li><li> 상기 취득 시간 의존성 심장 직경에 기초하여, 예컨대 HR 심장 활동주기 (CAP), 말기 직경 (EDD), 단부 수축기 직경 (ESD), 말기 영역 (EDA)와 심장 파라미터를 계산하고 (수축기 면적 종료 ESA). 소수 단축 (FS)와 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55002/55002eq1.jpg" /></li><li> 플라이 심장의 구조 개발을 시각화하기 위해 3D OCM 이미지를 분석 ImageJ에 사용합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 현재 연구와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

애벌레와 성인 단계에서 400 BPM 주위 최대 HR과 초파리의 빠른 심장 박동, 심장 diastoles 및 systoles (경험을 바탕으로 더 이상 80 프레임 / 초)를 해결하기 위해 높은 이미징 속도를 필요로한다. 작기 때문에 심실 크기 및 마이크론 스케일 심장 벽의 두께 (5-10 μm의) 높은 공간 분해능 (2 ㎛의보다 나은) 중심 관 구조를 해결하기위한 요구된다. 본 연구에서는, 고해상도 및 고속 초고 OCM 시스템 격자 600 라인 / mm의 변속기 분광기와 2048 픽셀 라인 스캔 카메라를 사용한 경우, 개발되었다. 20 kHz에서의 A-스캔 속도는 라인 스캔 카메라에 의해 제공된다. 128 프레임의 프레임 속도는 / 초 L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, 성인 등 다양한 발달 단계에서 초파리 하트 비트를 포착 할 수있을만큼 빠르다. 광원 ~ 800 nm에서의 중심 파장 및 대역폭을 갖는 넓은 대역폭 초 연속 광원이었다220 nm의 각각과 조직 ~ 1.3 ...

작은 동물의 마음의 종단 연구는 유전자와 관련된 선천성 심장 결함 1,2 인간 관련 심혈관 질환의 다양한 이해에 기여한다. 지난 수십 년 동안, 이러한 마우스 3,4-, 5,6- 제노, 제브라 7,8 조류 9 및 초파리 10-16와 같은 다양한 동물 모델에서의 연구와 관련된 인간의 심장 개발을 수행하는데 사용되어왔다. 마우스 모델 널리 정상 및 비정상 심장 개발 및 인간 심장 3,4과의 유사성으로 인해 심장 결함 표현형을 연구하기 위해 사용되었다. Xenopus의 배아 때문에 쉬운 취급 및 부분 투명 5,6에 심장 개발의 연구에서 특히 유용합니다. 배아와 제브라 피쉬 모델의 초기 유충의 투명성 심장 개발 7,8 쉽게 광학 관찰 할 수 있습니다. 조류 모델은 발달 심장 연구의 일반적인 될 수 있습니다 becaus전자 심장 쉽게 알 껍질과 인간 9 조류 마음의 형태 학적 유사성을 제거한 후 액세스 할 수 있습니다. 초파리 모델은 마음의 종 방향 연구를 수행하기에 이상적 몇 가지 독특한 기능을 가지고 있습니다. 첫째, 초파리의 심장 관은 심장의 광 액세스 및 관찰 편의를 제공하는 등의 표면 아래 ~ 200 μm의이다. 또한, 많은 분자 메커니즘 및 유전 경로는 초파리와 척추 동물 사이에 보존되어있다. 인간의 질환 유전자의 75 % 이상의 orthologs은 널리 유전자 연구에 사용 11,13 만든 초파리에서 밝혀졌다. 또한, 짧은 수명과 낮은 유지 보수 비용을 가지며, 일반적으로 발생 생물학 연구 14-16 검체 모델로 사용되고있다. 이전 보고서는 그 예로서 초파리 심장 기능을 모니터링하기위한 프로토콜을 묘사artbeat. 그러나, 해부 절차는 17, 18를 요구했다. 광학 이미징 인해 비 침습 자연 동물에서 심장 개발을 시각화 할 수있는 효과적인 방법을 제공합니다. 다른 광학 이미징 양식은 두 광자 현미경 (19), 공 초점 현미경 (20, 21), 빛 시트 현미경 (22), 및 빛 간섭 단층 촬영 16,23-26으로 수행 동물 심장 연구에 적용되었습니다. 비교적으로, 간섭 단층 촬영 살아있는 동물에 중요한 높은 해상도 및 초고 촬상 속도를 유지하면서, 조영제를 사용하지 않고, 작은 동물 하트 큰 촬상 깊이를 제공 할 수있다. 또한의 OCT 시스템 개발의 저비용 시험편 광학 이미징 기술이 대중화되었다. 간섭 단층 성공적 초파리의 길이 연구에 사용되었다. OCT를 심장 형태 학적 및 기능적 촬상 심장 구조를 연구하기 위해 수행 된 사용하여 FUNC적인 유전자의 역할 및 심장 개발하는 동안 돌연변이 모델에서 심장 혈관 결함의 메커니즘. 예를 들어, 연령에 따라 심장 기능의 감소는 OCT 27 초파리에서 다운 규제 안지오텐신 전환 효소 관련 (ACER) 유전자로 확인되었다. 유전자 관련 심근 병증의 표현형은 10월 28-33를 사용하여 초파리에서 입증되었다. 연구 사용 10월은 초파리 (34)의 중심에 인간의 SOX5 유전자의 기능적 역할을 한 것으로 보입니다. 간섭 단층 비해 OCM 더 가로 해상도를 제공하기 위해 높은 개구 수를 가지는 대물 렌즈를 사용한다. 과거에서, ortholog 인간 주기성 유전자 dCry / dClock 입을로 인한 심장 기능 장애는 비만 유도 인간 이해 맞춤 OCM 시스템 (15, 16),뿐만 아니라 초파리 심근증에 고 지방식이의 효과를 사용하여 연구되어왔다 심장 질환. (15) 여기에, 일전자 실험 프로토콜은 두 번째 령 (L2), 세 번째 령 (L3), 번데기 1 일 (PD1), 번데기 2 일 (PD2), 번데기 3 일에서 초파리의 심장 형태 학적 및 기능적 변화의 길이 방향 연구 (PD3)를 요약 , 번데기 4 일 인간과 관련된 선천성 심장 질환의 연구를 촉진하기 위해 OCM을 사용하여 (PD4), 번데기 5 일 (PD5), 성인 (그림 1). 이러한 HR 및 CAP 등 심장 기능 매개 변수를 정량적으로 심장 개발 기능을 나타 내기 위해 다른 발달 단계에서 분석 하였다.

<table><tbody><tr><td>우리 연구실</td><td></td><td></td>에서 개발 된 <td>맞춤형 OCM 이미징 시스템</td></tr><tr><td>my Temp Mini Digital Incubator</td><td>Benchmark</td><td>H2200-HC</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>AmScope</td><td>200PCS</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>RITE AID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Drosophila Formula</td><td>CAROLINA</td><td>formula 4-24</td><td></td></tr><tr><td>Yeast</td><td>ActiveDry</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>SONY</td><td>WILD M420</td><td></td></tr><tr><td>Brush</td><td>Loew-Cornell</td><td>245B</td><td>는 표본을 이동하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Labview 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Wiha</td><td>AA SA</td><td>과일을 고정하는 데 사용됩니다. 플라이 윙스</td></tr><tr><td>FlyNap</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>4,224,898</td><td></td></tr><tr><td>스카치 퍼머넌트 양면 테이프, 3M</td><td>스카치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>MU18837</td><td></td></tr><tr><td>유기농 엑스트라 코코넛 오일</td><td>Spring Valley</td><td>13183</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>캐피톨브랜드</td><td>M3504-E</td><td></td></tr><tr><td> Drosophila 바이알</td><td>SEOH</td><td>8401SS</td><td></td></tr><tr><td>All-trans-retinal</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>R2500</td><td></td></tr></tbody></table>

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (ocm)

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

작은 동물의 심장 박동에 대한 종단 연구는 심장 발달 중 구조적, 기능적 변화를 이해하는 데 기여합니다. 광간섭 현미경(OCM)은 높은 공간 해상도와 초고속 이미징 속도로 작은 동물의 심장을 이미징할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 높은 이미지 대비와 비침습적 특성으로 인해 OCM은 조직 해부나 염색 없이 종단 연구를 수행하는 데 이상적입니다. 초파리는 많은 수의 상동 인간 질병 유전자, 척추 동물과의 분자 메커니즘 및 유전 경로의 유사성, 짧은 수명주기 및 낮은 배양 비용으로 인해 심장 발달 연구에서 모델 유기체로 널리 사용되었습니다. 여기에서 실험 프로토콜은 표본의 수명 주기 동안 맞춤형 OCM 시스템을 사용하여 초파리를 준비하고 심장 박동을 광학 이미징하기 위해 설명됩니다. 이 보고서에 제공된 단계를 따르면 횡방향 M-모드 및 3D OCM 이미지를 획득하여 초파리 심장 형태 및 기능에 대한 종단 연구를 수행할 수 있습니다. 또한 안면 및 축 단면 OCM 이미지와 심박수(HR) 및 심장 활동 기간(CAP) 히스토그램을 통해 심장 구조 변화를 분석하고 초파리 변태 중 심장 역학을 정량화했으며, 심장 활동을 직관적으로 추적하기 위해 M 모드 이미지로 구성된 비디오와 결합했습니다. 초파리와 척추동물 사이의 유전적 유사성으로 인해 초파리의 심장 형태와 역학에 대한 종단 연구는 인간 심장 질환의 기원을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기서의 프로토콜은 인간의 심장 질환 메커니즘을 이해하기 위해 광범위한 연구를 수행할 수 있는 효과적인 방법을 제공할 것입니다.

길이 심장 이미징 OCM 실온에서 24B-GAL4 / + 균주와 초파리를 사용하여 수행 하였다. 측정 L2, L3에서 수행하고, PD4에 PD1에서 8 시간 간격으로, 성인 1 일 (AD1)는 변형 과정 (표 1)를 추적 할 수 있었다. 유충, 번데기 초, 늦은 번데기 및 성인 파리는 그림 1A에서 볼 수 있듯이 유리 슬라이드에 장착했다. 애벌레와 성인 파리의 심장의 세그먼트 기능은 그림 1B의 개략적 인 표현에 나타내었다. 이 발달 연구에서, 4096 프레임은 초파리의 심장 박동을 추적하는 우리의 사용자 정의 OCM 시스템으로 32 초에서 획득 하였다. 측정 정확도를 개선하기 위해 다섯 반복 측정은 각 발달 단계에서 각각의 시료에 대해 수행 하였다. 3D 데이터는 변형 동안 심장 구조 변화를 관찰하기 위해 얻어 질 수있다. 가로 M ...

여기에서는 다양한 발달 단계에서 초파리를 준비하고 맞춤형 광학 간섭 현미경(OCM) 시스템을 사용하여 초파리 심장 박동의 종단 광학 이미징을 수행하기 위한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다. 심장의 형태학적 및 역학적 변화는 OCM 이미지에서 심장의 구조적 및 기능적 매개변수를 분석하여 정량적으로 특성화할 수 있습니다.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

이 절차의 전반적인 목표는 광간섭 현미경 기술을 사용하여 생체 내에서 초파리의 심장 기능을 세로로 이미지화하는 것입니다. 이 방법은 초파리 변태 중 심장 직경, 심박수 및 심장 활동 기간의 변화와 같은 지표를 제공함으로써 초파리 심장 구조 및 기능 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광간섭 현미경 검사가 높은 공간 및 시간 해상도로 작은 동물의 심장을 비침습적으로 이미징할 수 있다는 것입니다.이 기술은 초파리와 척추동물 사이에 존재하는 유전적 유사성으로 인해 인간 심장 질환의 메커니즘과 심장 발달과의 관계를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 동물 모델에서 약화된 심박 조율기 기능을 연구하거나 치료하기 위한 광유전학적 페이싱과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 실험을 위해 파리를 생산할 때 생식 부모 파리가 짝짓기를 하고 신선한 유리병에 8시간 동안 알을 낳도록 합니다.따라서 낳은 알의 클러치는 비슷한 나이의 파리로 발전 할 것입니다. OCM 이미징을 위해 유충을 장착하려면 먼저 양면 테이프 조각으로 깨끗한 면을 준비합니다. 테이프 아래에 갇힌 기포를 밀어냅니다.그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 바이알에서 올바른 크기의 유충을 제거합니다. 깨끗한 티슈에 유충을 놓습니다. 물에 적신 솔을 사용하여 붙은 음식물을 제거한 다음 말리십시오.이제 광시야 현미경으로 유충의 발달 단계를 확인하십시오. 그런 다음 장착을 위해 등쪽이 위쪽을 향하도록 유충을 배치합니다. 그런 다음 끈적끈적한 슬라이드를 유충 위로 내리고 적당한 압력을 사용하여 테이프에 고정합니다.장착된 유충을 조정 가능한 스테이지에 놓습니다.tage 등쪽이 위쪽을 향하도록 y-가로 방향을 따라 OCM 시스템의 e. 무대에 있는 작은 구멍은 유충이 무대 평면과 접촉하지 않도록 합니다. 심장관의 넓은 내강은 A5 분절에서 A8 분절까지 발견됩니다. 컴퓨터의 실시간 이미지를 사용하여 심장관의 뒤쪽 영역을 찾고 A7 세그먼트가 보일 때까지 스테이지를 앞으로 이동합니다.이제 이미지 획득의 매개변수를 설정합니다. B 스캔당 100개의 A 스캔을 사용하고 100개의 B 스캔을 사용합니다. 그런 다음 스캐너 전압을 x-가로 방향으로 약 0.28mm를 커버하도록 설정하고 y-가로 방향으로 0볼트로 설정합니다.다음으로, 어두운 천으로 샘플 빔 경로를 차단하고 소프트웨어에서 시작 버튼을 클릭하여 배경 빼기를 위한 배경 노이즈 데이터를 수집합니다. 횡방향 M 모드 이미지를 수집하려면 매개변수를 B 스캔당 128개의 A 스캔으로 조정하고 4, 096 B 스캔을 사용합니다. 그런 다음 이전과 같이 x 방향으로 0.28mm, y 방향으로 0볼트를 커버하도록 전압을 다시 조정합니다.그런 다음 파리 심관의 A7 세그먼트의 횡방향 M 모드에서 이미지를 획득합니다. 데이터 저장 프로세스 중에는 어두운 천으로 이미징 빔을 차단하여 샘플 표본에 대한 빛 노출을 최소화합니다. 심장 기능을 안정적으로 측정하기 위해 심장을 5회 이미지화합니다.3차원 이미지를 수집하려면 B-스캔당 400개의 A-스캔, 800개의 B-스캔을 사용하고, x-횡방향에서 1.7mm, y-횡방향에서 약 4mm의 전압을 사용합니다. 그런 다음 현미경 스테이지를 이동하여 전체 플라이를 관찰하고 초점을 조정하여 선명한 이미지를 볼 수 있습니다. 유충을 제거하려면 젖은 부드러운 브러시를 사용하여 지속적인 개발과 종단 연구를 위해 신선한 음식이 담긴 새 바이알로 옮깁니다.심장관의 넓은 내강은 번데기 PD1에서 A5 - A8 분절에 남아 있습니다. PD1에서 L2 및 L3 단계 유충과 마찬가지로 A7 세그먼트를 이미지화하려고 노력하십시오. PD1 번데기는 흰 번데기로 식별됩니다.이 시간 창은 높은 투명도로 인해 OCM 이미징을 위한 더 높은 빛 투과율로 이어지기 때문에 초기 번데기의 광학 이미징을 수행하는 데 이상적입니다. 몸에 음식이 붙어 있으면 브러시로 번데기를 청소하십시오. 젖은 브러시를 사용하여 번데기를 작은 유리 슬라이드에 장착하고 등쪽이 위를 향하도록 합니다.슬라이드는 자체 챔버에서 동물의 발달을 보존하기 위해 플라이 튜브에 맞아야 합니다. 번데기의 여분의 물을 건조시킨 다음 번데기가 위를 향하도록 무대에 놓고 유충과 함께 한 것처럼 A7 세그먼트를 이미지화합니다. 이미징 후 번데기가 있는 유리 슬라이드를 튜브로 옮겨 지속적인 배양을 위해 합니다.PD1 단계 후, PD2에서 시작하여 A1과 A4 세그먼트 사이에 원추형 챔버가 발달하기 시작합니다. 번데기는 점점 더 불투명해지기 때문에 이미징 시스템의 침투 깊이가 줄어듭니다. PD2에서 번데기 껍질은 황색을 띠고 몸체는 PD1보다 덜 투명합니다.PD3에서 번데기의 색은 PD2 단계보다 약간 더 어둡습니다. PD4 단계에서는 껍질 내부에 검은색 줄무늬가 관찰될 수 있습니다. 일부 PD4는 성인으로 발달하고 다른 PD4는 PD5 단계로 들어갑니다.PD5 단계에서는 검은색 줄무늬가 훨씬 더 뚜렷합니다. 핀셋을 사용하여 PD2 번데기를 집어 슬라이드에 장착합니다. OCM 시스템에서 심장관의 앞쪽 끝을 찾은 다음 뒤쪽으로 약 50미크론을 이동하여 심장관의 A1 세그먼트를 찾습니다.PD2 단계에서는 심장의 원뿔 방이 매우 작아서 아직 박동하지 않을 수 있습니다. 앞에서 설명한 대로 이미징을 진행합니다. PD3, PD4 및 PD5 단계에서 초파리를 이미징하기 위해 동일한 절차를 반복합니다.시작하려면 성충 파리를 약 45밀리리터 용량의 빈 바이알로 옮깁니다. 그런 다음 면 어플리케이터를 마취액에 담그고 면 마개 바로 아래에 면 끝이 있는 막대를 유리병에 넣습니다. 3분 동안 기다립니다.성충 파리는 크기에 따라 2분 30초에서 3분 30초 동안 마취됩니다. 이제 양면 테이프로 유리 슬라이드를 준비합니다. 그런 다음 부드러운 브러시를 사용하여 마취된 파리를 등쪽이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드로 이동합니다.광시야 현미경에서 핀셋을 사용하여 날개를 분리하고 테이프에 붙여서 이미징을 위해 심장 부위를 노출시킵니다. 이제 앞서 설명한 이미징 기술을 사용하여 심장의 A1 분절을 이미지화하고 실험이 끝날 때 파리를 희생합니다. 종방향 심장 영상은 24B-GAL4 드라이버 1개와 함께 스트레인 플라이를 사용하여 수행되었습니다.유충 단계에서 심장관은 더 넓은 내강을 가진 후복부 부위 A8에서 시작하여 더 좁은 직경을 가진 앞쪽 등쪽 분절 A1에서 끝납니다. PD2 후반부에 원뿔형 챔버가 A1에서 A4 세그먼트에서 발생하기 시작했습니다. 플라이 심박수는 횡방향 M 모드 OCM 이미지에서 정량화되었습니다.흥미롭게도, 번데기 단계에서는 심장 박동이 이따금 멈췄다. 전반적으로 심장 박동은 애벌레 단계에서 번데기 단계로 크게 느려졌다가 번데기에서 성충으로 상당히 증가했습니다. 이러한 개발 이후, 이 기술은 발달 심장학 분야의 연구자들에게 초파리 모델에서 심장 발달에 대한 다양한 유전자의 영향을 탐구할 수 있는 새로운 도구를 제공했습니다.이 절차를 시도하는 동안 각 발달 단계에서 이미지를 생성하기 위해 초파리의 발달을 주의 깊게 추적하는 것이 중요합니다.

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연구

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배우세요 초파리 심장 기능의 생체 내 세로 이미징 방법을 광학 간섭 현미경(OCM)을 사용하여. 이 기술은 심장 직경, 심박수 및 변태 기간 동안의 활동을 정량적으로 측정하여 심장 발달 및 질병 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

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