Name: 안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 학습하세요 안정 동위 원소 추적과 세포 분류를 결합하여 복잡한 세포 공동체의 정렬된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법을. 질량 분석을 통해 세포 유형 간 대사 차이와 협력을 연구할 수 있습니다.

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저자는 질량 분석 방법을 최적화하는 데 귀중한 도움을 준 Anas Kamleh 박사와 세포 분류에 도움을 준 Annika von Vollenhoven에게 감사를 표합니다. 이 연구는 스웨덴 전략 연구 재단(Swedish Foundation for Strategic Research)의 지원을 받았습니다(보조금 번호. FFL12-0220) 및 암 연구 전략 프로그램(IR, RN); 스웨덴 심장-폐 재단(CEW, HG); 및 Mary Kay Foundation (JW, MJ).

1. 대사 추출 <ol><li> 접시에서 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 영양 보충제 (혈청 또는 다른 성장 보조제)에서 삼중의 6 웰 플레이트에서 배양 세포는 세포는 75 %의 합류가 될 때까지. 주 : U- 13 C 40 % 글루코스를 함유하는 RPMI에서 48 시간 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 및 5 % 투석 된 FBS (태아 소 혈청)은 여기 HeLa 세포 배양. 투석 FBS는 레이블이 미디어를 오염시킬 수있는 작은 분자량 대사 물질을 제거하는 데 사용됩니다. 실제 실험 이전에 투석 보충에 세포를 배양하는 세포가 배지에서 정상적으로 성장하고 확인하는 것이 좋습니다. 보충 밤새 뱀 피부 투석 튜브를 사용하여 0.15 M NaCl 용액에서 투석된다. </li><li> 추출 폐기 문화 매체의 날에, 500 μL 차가운 HBSS로 두 번 우물을 씻어 후 폐기합니다. 참고 : 여기에 HBSS 40 %를 포함하는 사용 U-13 C 글루코스가 배양 배지에도 때문이다. </li><li> 추가 600 μL의 100 % 메탄올을 드라이 아이스에 미리 냉각시켰다. </li><li> 얼음을 건조 세포 스크레이퍼와 세포 물질을 제거 할 수있는 요리를 전송합니다. </li><li> 조심 질량 분광 분석까지 -80 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 세포 추출물 피펫. </li></ol></li><li> 모의 분류 세포의 추출 <ol><li> 안정 동위 원소 표지 된 배양 배지 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 주 : 100mm 접시에 48 시간 동안 배양 여기 HeLa 세포 세포의 높은 번호 (~ 4 × 106)은 50 정렬 세포를 얻기 위해 필요하기 때문이다. 헬라 세포 추출물이 숫자는 대사 산물의 좋은 측정을 받아야했다. 사용되는 배양 배지는 40 % RPMI는 U- 13 C 글루코스 70 % U- 13 C, 15-N2 글루타민 투석 FBS, 5 %를 함유 하였다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, w 우물을 씻어i 번째 1.5 mL의 따뜻한 HBSS 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션) + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 정렬 만 단봉들에 대한 셀 소터 게이팅을 통해 세포, 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에 원심 분리기 분류 세포. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 헬라 세포는 크고 그래서 그들은 가능한 한 그대로 펠렛을 얻기 위해 느린 이벤트 속도와 큰 노즐로 분류되어야한다. throughou 감기 블록 세포 유지t은 신진 대사를 감소 정렬. 정렬 절차의 철저한 설명은 이전 12 설명한다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출하여 액체 크로마토 그래피 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지 - 고해상도 질량 분석 (LC-HRMS) 분석. </li></ol></li><li> 세포주기의 추출 세포 정렬 <ol><li> 문화 미디어 + 투석 보충 교재에서 삼중의 100mm 접시에 배양 세포. 참고 : Geminin Fucci 녹색 G1 (음)과 SG2M (양의) 세포로 정렬 할 수 있습니다 (MAG1-hGem) 탐침 (13)를 포함하는 다음 문화 HeLa 세포. 세포는 안정 동위 원소 추적 미디어에서 배양 될 수있다필요에 따라 긴이야. 여기에 우리가 레이블이없는 미디어에서 46 시간 동안을 배양 한 후, 우리는 RPMI 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- (13) C를 함유로 전환 한 15 N2 - 글루타민 2 시간 전에 정렬 시작. 이것은 짧은 펄스 라벨링 필요한 세포주기 단계를 연구 할 수 있도록하기 위해 수행되었다. </li><li> 추출, 폐기 문화 매체의 날에, 1.5 mL의 따뜻한 HBSS와 우물을 씻어 후 폐기합니다. </li><li> 37 ℃에서 4 분 동안 150 mL의 트립신 / EDTA를 첨가하여 세포를 분리. 4 ° C 또는 얼음에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 3 mL의 얼음 차가운 HBSS + 투석 보충을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 3 분 동안 750 XG에 15 mL의 튜브와 원심 분리기에서 세포를 수집합니다. </li><li> 1-2 × 10 6 세포 / ㎖가, 단일 세포를 얻기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통과하고, 5 ㎖ 튜브로 전송 농도로 HBSS + 투석 보충 + 1 mM의 EDTA의 펠렛을 재현 탁. </li><li> 셀 소터 g을 통해 정렬 세포다음, 파편과 이중선을 ating 관심의 세포 마커에 대한 게이팅, 원심 분리기 분류 세포를 4 ℃에서 3 분 동안 750 XG에. 참고 : 여기에 정렬 헬라 계기 압력 27 PSI와 속도 1000 이벤트 / s로 세포, 및 100 μm의 노즐을 사용하여. 신진 대사 속도를 감소 정렬을 통해 차가운 ​​블록 세포를 유지합니다. </li><li> 뜨는을 취소하고 메탄올을 추가하기 전에 균일 한 펠렛을 얻기 위해 50 μL 얼음 차가운 DH 2 O의 펠렛을 재현 탁. 직접 펠릿을 냉 메탄올에 첨가 재현 탁 어렵다 고체 펠렛을 형성한다. </li><li> 드라이 아이스에 보관 540 μL 메탄올을 추가하여 대사 물질을 추출 및 LC-HRMS 분석 할 때까지 -80 ° C에서 추출물을 유지합니다. </li></ol></li></ol> 2. 질량 분석 분석 참고 : 여기에 우리가 LC-HRMS 시스템에서 세포 추출물을 분석하기위한 프로토콜을 설명합니다. 세포 추출물의 분석에 대한 대사 체학 방법이 사용될 수있다. 전체 검사분석은 대사 산물의 다양한 검출에 유용 할 수있다. <ol><li> 질량 분석 참조 교정 믹스를 사용하여 기기를 보정합니다. </li><li> 15 초 30 분, 소용돌이 얼음에 해동 세포 추출물. </li><li> 4 ℃에서 13,000 × g으로 10 분 동안 스핀 필터 및 원심 분리하여 세포 추출물 100 ㎕를 옮긴다. </li><li> 액정-HRMS 시스템에 여액 12.5 μL를 주입한다. </li><li> (ZIC-HILIC) 칼럼 (150mm X 4.6 mm, 5 ㎛의 입자 크기) 양쪽이 온성 친수성 상호 작용 액체 크로마토 그래피를 이용하여 분리 된 대사 물질 0.1 % 포름산 구배 용출을 이용하여 ZIC-HILIC 가드 컬럼 (20mm mm 2.1 ×) 장착 물에 산 (용매 A) 및 아세토 니트릴 (용매 B). 용매 (A)의 20 % 구배 용출를 시작하고 17 분에서 80 %까지 증가한다. 각각 최소 400 μL의 흐름 -1 컬럼 온도 및 샘플 트레이 23 ° C에서 4 ° C와 4 분 동안이 비율을 유지한다. </li><li> 는 I를 사용하여대사 검출 이온화 소스로서 포지티브 및 네거티브 모드 모두에서 가열 된 전기 분무 (H-ESI II) 및 70,000 전폭 반치 (FWHM)의 질량 분해능의 전체 검사를 획득 모드의 크로마토 그래피 분리에 결합 nstrument ( m / z 200). </li><li> 플로우 (45)의 속도와 350 ° C에서 10 노소 (임의의 단위) 및 설정 증발기 온도와 긍정적 인 모드와 -3.5 kV의 4 kV로에서의 전기 분무 전압에서 시스 가스 및 보조 가스 질소 (순도&gt; 99.995 %)를 사용하여 부정적인 모드입니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 표준이 가능하며 샘플에서 좋은 품질의 피크를 표시하는 대사 산물의 번호를 선택합니다. 양질의 피크 대 잡음비가 높은 신호. 최고 품질을 확인하고 거짓 동위 원소를 포함하지 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 모양 및 / 또는 체류 시간이 다른 동위 원소 피크 가능성이 false입니다. </li><li> 동위 원소 표지 샘플 (질량 동위 원소를 계산을 위해MI) 모든 잘못의 총 피크 면적과 각 MI의 피크 면적을 나누어 분수. </li><li> 로 각각 13 C, 15 N의 농축을 표지 탄소 / 질소 분수를 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" /> 여기서 n은 대사 산물의 탄소의 총 수 (또는 질소 각각은)이며, 혼합 x의 MI 분율이다. 주 : 모든 계산은 프로그래밍 언어를 사용하여 수행 될 수있다. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리의 방법은 세포의 대사에서의 MID는 세포 대사 활동의 &quot;히스토리&quot;를 반영한다는 원리에 기초한다. 이것은 그들이 이전 셀 정렬 절차 세포의 복잡한 지역에서 발생으로 가능 세포의 하위 집단에서 대사 활동을 조사 할 수있다. 반면, 대사 산물의 피크 지역 분류 세포와 배양 접시 (11)에서 직접 추출 추출 사이에 현저하게 다르다. 일부 다른 화학 성분은 질량 분석, 소위 &quot;매트릭스 효과&quot;의 신호 응답을 변경하기 때문이다, 그러나 또한 세포가 버퍼 (11)로 유지하면서 아미노산이 정렬 동안 세포로부터 손실 된 것으로 나타났다. 이 정렬 동안 신진 대사 상태와 세포의 활동을 변경할 수 있지만,이 자체가 우리의 방법과 관련이 : MID를 직접 추출에서 관찰 된 것과 합리적으로 가까운 것을 제공, 데이터는 VALI 남아원래 복잡한 문화의 각 모집단의 대사 상태 라 측정. <p class="jove_conte...

고등 생물은 더 복잡한 기능에 대해 가지고 협력 별개의 세포 유형의 복잡한 사회를 포함한다. 예를 들어, 종양은 단지 암세포 만, 섬유 아세포, 혈관을 구성하고, 주로 면역 세포가 침투 한 세포를 포함하고; 혈액은 면역 세포 아형 2의 수십의 복잡한 혼합물을 포함, 심지어 배양 세포주는 내강 및 유방암 세포 (3)의 기부 아형 여러 개체군, 구성 될 수있다. 대사 &quot;협력&quot;을 나타낼 수있다 공존 또한, 서로 다른 세포 유형. 예를 들어, 뇌, 성상이 기판 (4)을 산화 한 후 뉴런 &quot;공급&quot;인 락트산 포도당 변환 생각된다; T 림프구는 시스테인 (5)의 소스로 인접 수지상 세포에 의존하는 일부 경우에; 암 세포는 asso과 협력 할 수있다종양 6 ciated 섬유 아세포. 이러한 시스템의 대사 동작을 이해하기 위해서는 본 분리하고 다양한 종류의 세포 대사 활동을 측정하는 것이 필수적이다. 지금까지 세포 유형을 분리하기위한 가장 널리 사용되는 방법은 형광 활성화 세포 분류이다. 이 방법은 세포 유형 또는 관심 상태는 형광 항체, 조작 된 형광 단백질의 발현 또는 다른 염료를 사용하여 &quot;표지&quot;가 제공 될 수 넓게 적용 가능하다. 하나의 옵션은 셀 소터 통해 초기 개별 세포 유형, 다시 배양 얻어진 각 세포 유형이다하고이 배양 물 (7)의 대사 과정을 수행한다. 세포 유형 또는 표현형은 배양 조건에 안정하며, 이러한 세포주기 상태 않으며 공동 배양 물에서 대사 협력으로 과도 행동을 캡처 할 수없는 경우,이 경우에만 가능하다. 이러한 경우를 들어, 신진 대사가 너무 직접 측정해야rted 세포. 이 절차를 선별 세포 신진 대사 8 왜곡 될 응력 세포 주제 때문에 도전이며, 우리는이 방법 (9) (10)를 가지고 단지 약간의 연구 알고있다. 특히, 절대 대사 풍부 측정이 더 이상 신뢰성있게 아미노산 등 주요 대사 산물은 세포 정렬 버퍼에 보관 세포로부터 누출하지 않을 수 있음을 발견 하였다 (11) (정렬 된 분획의 상대 비교가 여전히 유용 할 수 있음). 이러한 문제를 회피하기 위해, 우리는 정렬하기 전에 안정 동위 원소와 셀 라벨, 및 세포 대사보다는 대사 산물 존재비에서의 MID에 초점을 맞 춥니 다. MID를 길게 시간 규모 상에 형성되기 때문에, 그들은 적은 정렬 조건에 단기간 노출에 의해 영향을받을 것이다. 우리는 DA를 제공하기에 충분히 민감 전체 스캔 고분해능 질량 분석법을 이용하여 MID를 정량화셀 정렬 시간의 약 30 ~ 60 분을 필요로하는 약 50 만 분류 세포에서 시작 대사 산물의 수백에 따. 배양 접시가 관찰 된 MID는 원래 배양 대표적되도록 이루어진다에서의 비교를 직접 제어 (특정 인구 게이팅없이 셀 소터 구 통과 세포) 및 대사 추출 &quot;모의 정렬&quot;. 안정 동위 원소 추적자의 선택에 따라 다양한 대사 경로는이 방법으로 공부하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (inFlux v7 Sorter)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glucose</td><td>Cambridge isotopes</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-Glutamine</td><td>Cambridge isotopes</td><td>CNLM-1275-H-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol (JT Baker), HPLC grade</td><td>VWR</td><td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV 원심 필터. 듀라포어 PVDF 0.1 &마이크로; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3,000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC 컬럼 (150 mm x 4.6&nbsp; mm, 5 &마이크로; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC 가드 컬럼 (20 mm x 2.1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴 Optima LC-MS, 호박색 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore</td><td></td><td>Milli-Q Gradient system</td></tr><tr><td>Myrsyra 99.5% Optima (Formic acid)</td>로 생산<td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 스크류 바이알 1.5 ml, 8-425 32x11.6 mm, 호박색, 100</td>개 <td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE 패킹 8-425 (스크류 캡)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Pos. Mode Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>캘리브레이션 키트</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Wolfram 연구</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

포유류 세포 유형은 특화된 신진대사를 나타내며, 다양한 공존 세포 유형이 대사 협력에 관여한다는 충분한 증거가 있습니다. 더욱이, 단일 세포 유형의 배양물조차도 휴지 세포 또는 순환 세포와 같은 뚜렷한 대사 상태의 세포를 포함할 수 있습니다. 이러한 하위 집단의 대사 활동을 측정하는 방법은 세포 대사를 이해하는 데 유용한 도구입니다. 복잡한 세포 집단은 세포 분류기를 사용하여 가장 일반적으로 분리되며, 이 방법으로 분리된 하위 집단은 대사체학 방법으로 분석할 수 있습니다. 그러나 이 접근 방식의 문제는 세포 분류 절차가 세포의 신진대사를 왜곡할 수 있는 스트레스를 가한다는 것입니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, MID는 장기간에 걸쳐 형성되고 세포 분류 조건에 대한 단기 노출의 영향을 덜 받아야 하기 때문에 안정적인 동위원소 표지 영양소로 배양된 세포의 대사산물의 질량 동위원소 분포(MID)가 절대 대사 산물 농도보다 더 안정적일 가능성이 높다고 추론했습니다. 여기에서는 이 원리를 기반으로 세포 분류와 액체 크로마토그래피-고분해능 질량 분석법(LC-HRMS)을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 세 가지 유형의 샘플 분석이 포함됩니다: (1) 복합 집단에서 직접 얻은 대사 산물 추출물; (2) 특정 집단을 게이팅하지 않고 세포 분류 기기를 통과한 "모의 분류된" 세포의 추출물; (3) 실제 정렬된 모집단의 추출물. 실제 분류된 집단을 분석하기 전에 MID가 세포 분류 절차 자체에 의해 실제로 변경되지 않았는지 확인하기 위해 모의 분류된 세포를 직접 추출과 비교합니다. 세포주기 단계에 따라 분류된 HeLa 세포의 결과를 예시하여 뉴클레오티드 대사의 변화를 보여줍니다.

일례로서, 우리가 세포주기의 단계에 따라 정렬 HeLa 세포의 신진 대사를 조사하는 실험을 기술한다. 모두 탄소와 질소에 중앙 대사의 다양한 레이블을 지정하려면, 우리는 U- (13) C-포도당과 U-13 C, 추적자로 15 N 글루타민을 사용하여 48 시간 동안 세포를 배양. 동위 원소의 중간 수준보다 다양한 MI 패턴 (14)을 생성하는 경향이 검증 실험에 대한 풍부한 MID를 얻으려면, 우리는 여기에, 40 % U- (13) C-포도당 70 % U- 13 C, 15 N2 - 글루타민의 혼합물을 선택했다. 검증 실험을 위해 우리는 85 대사의 대상으로 분석을 수행 하였다. 품질이 좋지 품질 LC-M...

이 논문은 안정 동위원소 추적, 특정 세포 유형을 분리하기 위한 세포 분류 및 질량 분석법의 조합을 사용하여 여러 세포 유형의 복잡한 군집에서 세포 대사를 연구하는 방법을 설명합니다.

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

이 방법의 전반적인 목표는 동위원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 군집의 분류된 집단의 신진대사를 측정하는 것입니다. 따라서 이 방법을 통해 우리는 복잡한 세포 군집의 하위 집단 간의 대사 차이와 이러한 하위 집단 간의 대사 협력을 연구할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동위원소 추적과 세포 분류를 결합함으로써 보다 신뢰할 수 있는 대사 측정을 얻을 수 있고 이 방법이 얼마나 신뢰할 수 있는지 검증할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 다양한 기술을 결합하고 세포를 처리하는 방식 및 절차의 길이가 세포 대사에 영향을 미칠 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 접시에서 대사 산물을 추출하기 위해, 먼저 투석 보충제를 함유한 안정 동위원소 표지 배양 배지의 6웰 플레이트에서 세포를 배양합니다. 세포가 75% 포화도에 도달하면 균일하게 라벨링된 포도당을 함유한 500마이크로리터의 차가운 HBSS로 웰을 두 번 헹굽니다.그런 다음 600마이크로리터의 100% 드라이아이스 예냉각된 메탄올을 각 웰에 추가하고 플레이트를 드라이아이스로 옮깁니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리한 다음 각 웰의 추출물을 개별 마이크로 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 질량 분석이 이루어질 때까지 섭씨 영하 80도에서 세포를 보관합니다.분류된 세포의 대사 산물 추출을 위해 투석 보충제가 포함된 라벨이 부착된 배양 배지의 100mm 접시에 세포를 배양하여 분류 날짜까지 75% 포화도에 도달하도록 합니다. 세포주기가 분류된 세포의 펄스 라벨링을 위해 투석 보충제가 포함된 라벨링되지 않은 배지에서 세포가 75% 포화도에 도달할 때까지 배양합니다. 그런 다음 배지를 표지된 새로운 배양 배지로 교체하여 2시간 동안 세포에 펄스 라벨을 부착합니다.균일하게 표시된 포도당이 함유된 따뜻한 HBSS로 접시를 헹구고 섭씨 37도에서 1.5ml의 트립신 EDTA로 세포를 분리합니다. 4분 후, 라벨이 붙은 포도당 및 투석 보충제가 함유된 얼음처럼 차가운 HBSS 3ml로 트립신을 비활성화하고 원심분리를 위해 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 표지된 포도당, 투석 보충제 및 EDTA를 함유한 펠릿을 1-2배 10배에서 밀리리터당 6개 세포 농도로 재현탁하고 40미크론 스트레이너를 통해 세포를 여과하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.세포를 5ml 튜브로 옮기고 유세포 분석기에서 분류합니다. 모의 분류된 세포에서 대사 산물을 추출하려면 파편을 걸어 내고 단일체만 분류합니다. 세포주기 분류된 세포에서 대사산물을 추출하기 위해 geminin 프로브 형광을 기반으로 파편과 이중항을 걸어 내고 세포를 G1 및 SG2M으로 분류합니다.종류가 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 50마이크로리터의 얼음처럼 차가운 증류수에 재현탁하여 균일한 펠릿을 얻습니다. 그런 다음 540마이크로리터의 드라이아이스 냉각 메탄올을 첨가하여 대사 산물을 빠르게 추출합니다. LCMS 분석이 이루어질 때까지 시료를 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.분류된 세포에서 대사 산물을 추출하는 것은 사전에 잘 계획되어야 하며, 대사 변화를 최소화하기 위해 가능한 한 빨리 실험 작업을 완료해야 합니다. 추출된 대사산물을 분석하려면 먼저 우수한 품질의 샘플 피크를 나타내는 해당 사용 가능한 표준물질을 가진 여러 대사산물을 선택합니다. 다음으로, 거짓 동위원소가 포함되지 않도록 주의하면서 피크의 품질을 확인합니다.각 질량 동위원소의 피크 면적을 우리 분획에서 모든 질량 동위원소의 총 피크 면적으로 나누어 동위원소로 표시된 샘플에 대한 분획에서 질량 동위원소를 계산합니다. 그런 다음, 탄소 농축 공식을 사용하여 탄소-13 농축에 대해 표시된 탄소 분율을 계산합니다. 마지막으로, 질소 농축 공식을 사용하여 질소-15 농축에 대해 표시된 질소 분율을 계산합니다.이 대표적인 실험에서, 데이터 분석에서 선택된 66개의 대사 산물이 모의 분류된 세포에 존재했으며, 그 중 60개는 접시 추출물과 모의 분류된 세포 사이의 분포에서 유사한 질량 동위원소로 표지된 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 글루타메이트 분포의 질량 동위원소는 접시와 모의 분류된 추출물 간에 유사하며, 이는 분포의 글루타메이트 질량 동위원소가 분류된 세포 집단에서도 신뢰할 수 있음을 나타냅니다. FUCCI geminin 프로브를 사용하여 G0, G1 또는 SG2M 세포 주기 단계로 분류된 HELA 세포를 분석한 결과, 두 집단 모두에서 SG2M 단계에서 더 높은 농축을 보인 시티딘 표지가 확인되었으며, 이는 S기 동안 뉴클레오티드의 새로운 합성이 증가한 것과 일치합니다.이 실험에서, 우리 분포의 질량 동위원소는 두 세포주기 분류 분획 모두에서 동일한 패턴을 보였는데, 이는 동일한 합성 경로가 사용되지만 SG2M 단계에서 더 활성화됨을 시사하며, 밀접하게 관련된 하위 집단 사이에서도 이 방법으로 대사 차이를 쉽게 감지할 수 있음을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 정렬된 분획에서 대사 산물을 추출하는 방법을 잘 이해하고 주의 사항을 이해해야 합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포를 처리하는 방식과 시간이 신진대사에 영향을 미칠 수 있으므로 분류 및 대사 산물 추출 중에 세포를 신속하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술을 숙달하면 5시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차는 다른 셀 유형에도 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 혈액 내 면역 세포 부분 집합 또는 종양 내의 다양한 유형의 세포는 다양한 프로브, 항체 또는 염색 방법을 사용하여 분류할 수 있습니다.

a-method-for-measuring-metabolism-sorted-subpopulations-complex-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

중간 신진 대사 유량의 가스 크로마 토그래피 질량 spectrometric 분석하여 안정 원소 프로파일은 선충류에 설명되어...

개발하고 성인 단계에서 중개 신진 대사 플럭스 안정 원소 프로파일 Caenorhabditis 엘레간스</em

13 C - 동위 원소 라벨링은 미생물의 다양한 유형의 셀 중앙 신진 대사를 결정하기위한 유용한 기법입니다. 세포가 특정 레이블 기판과 교양되었습니다 후, GC - MS 측정은 proteinogenic 아미노산의 고유 라벨 패턴을 기반으로 기능성 대사 경로를 확인할 수 있습니다.

을 통해 대사 경로 확인 및 검색 13</supProteinogenic 아미노산> C - 라벨링

스포 도프 테라 리토 랄리스의 가트와 연관된 활성 박테리아 여행자는 pyrosequencing 기법에 결합 안정 동위체 프로빙 (SIP)에 의해 결정되었다. 이 방법을 사용하여, 지역 사회 내에서 대사 활성 박테리아 종의 식별은 높은 해상도와 정밀도로 이루어졌다.

제너럴의 장내 대사 활성 박테리아의 식별<em&gt; 스포 도프 테라 리토 랄</em&gt; DNA 안정 동위 원소를 통해 사용 프로빙<sup&gt; 13</sup&gt; C-포도당

이 프로토콜 양적이 고 포괄적으로 여러 영양소 소스의 신진 대사를 조사 하는 실험 절차를 설명 합니다. 이 워크플로, 동위 원소 추적 실험 및 분석 절차의 조합에 따라 결정 될 미생물 소비 영양분의 운명과 분자 synthetized의 대사 기원 수 있습니다.

여러 영양소 소스의 미생물 대사를 조사 하기 위해 동위 원소 추적 실험의 조합에 따라 워크플로

지방산 영양 마커 접근, 즉, 전체 분자와 소비자 조직으로 전송으로 지방산의 동화 없이 또는 사소한 수정, 작은 토양 무척 추 동물의 지방 산 성 대사에 지식 격차에 의해 방해 된다. Isotopologue 프로 파일링 풀 영양 상호 작용 하는 귀중 한 도구로 제공 됩니다.

영양 탄소 전송 및 무척 추 동물 소비자의 지질 대사에 대 한 통찰력을 제공 합니다 지방산 13C Isotopologue 프로 파일링

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

여기에서는 희귀 세포 유형의 대사 산물을 정확하고 안정적으로 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세포 분류를 위한 변형된 sheath 유체 및 관련 blank 샘플 생성을 포함한 기술 개선을 통해 샘플당 5000개의 세포만 입력하여 대사 산물을 포괄적으로 정량화할 수 있습니다.

희귀 일차 세포에 대한 표적 대사체학

여기에서는 MIP-FISH(mid-infrared photothermal-FISH)라고도 하는 광학 광열 적외선 형광 in situ hybridization(OPTIR-FISH)을 사용하여 개별 세포를 식별하고 세포의 신진대사를 이해하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 single-cell resolution으로 세포 대사를 매핑하는 것을 포함하여 다양한 응용 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

이 프로토콜은 맞춤형 생물반응기 시스템을 과분극 ¹³C NMR 분광법과 통합하여 살아있는 세포의 실시간 피루브산 대사를 측정함으로써 대사 연구 및 약물 스크리닝 응용 분야의 재현성과 운동 정확도를 개선합니다.

과분극 13CNMR을 사용한 살아있는 세포의 실시간 대사 검출

학습하세요 안정 동위 원소 추적과 세포 분류를 결합하여 복잡한 세포 공동체의 정렬된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법을. 질량 분석을 통해 세포 유형 간 대사 차이와 협력을 연구할 수 있습니다.

안정 동위 원소 추적을 사용하여 복잡한 세포 공동체의 정렬 된 부분 집단에서 대사를 측정하는 방법

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