Name: 격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 심장 세포 외 기질 분리 및 혈관 확장 연구 방법을 통해 IRF5 억제 펩타이드 처리가 혈관 반응 및 질병 진행에 미치는 영향을 분석하는 기술을. 타이트 스킨 마우스 모델을 활용한 이 방법은 심혈관 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 작업은 NIH 보조금 HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) 및 HL-102836 (KAP) 및 Cimphoni Life Sciences (DW 급여의 일부)의 지원을 받았습니다. 저자는 원고를 편집한 Meghann Sytsma에게 감사를 표합니다.

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

목표는 쯧 / + 마우스의 마음에 염증, 섬유화, 혈관 기능에 IRF5의 역할을 규명하기 위해 IRF5 억제제를 설계하는 것이 었습니다. 결과는 IRF5D이 증식 또는 세포 사멸을 유도하지 않았다 있습니다. 또한, 염증 감소와 혈관 기능이 향상되었다. 이러한 데이터는 IRF5 쯧 / + 마우스의 심장 염증 및 섬유증의 개발에 중요한 역할을 기계적 것을 제안하고이 치료 표적이 될 수있는 잠재력을 가지고있다. 첫 번째 단계는 억제제를 설계하는 것이었다. 펩티드를 설계 할 때, 여러 점을 고려되어야한다 : 시퀀스 길이, 이차 구조의 C 말단의 N 말단 아미노산의 산화, 아미노산 조성, 아미드 화 및 캡 아미노산 경향 잔류 와 리간드 첨부. 이상적인 시퀀스 길이가 가장 전체 수율, 적은 불순물 및 비용 절감을 보장하기 위해 15-10 사이의 잔류 물이다. 그것은 impor의입니다중대장은 베타 시트 형성과 같은 보조 구조를 알고 있어야합니다. 베타 시트 형성 삭제 서열의 높은 수준을 ...

<html> 세포 증식과 세포 사멸의 면역 반응의 조절은 인터페론 조절 인자의 전사 인자 계열의 역할 핵심이다. IRF5는 1 형과 면역 반응의 조절, 염증 촉진 반응과 2 형, 면역 반응 대상으로 조직 복구에 매우 중요하다고 강조한다. IRF5 1 암 및자가 면역 2, 3, 4, 5의 핵심이다. 꽉 피부 마우스 (쯧 / +)이 때문에 피 브릴 린 (fibrillin)-1 유전자의 중복 돌연변이에 조직의 섬유화 및 경피증을위한 모델이다. 단단한 피부에이 돌연변이 결과 및 결합 조직의 증가. 이러한 쥐 심근 염증, 섬유증 최종적 심부전 5, 6, 7을 개발&gt; 8,9. 경피증은 미국 (6)에서 약 15 만 명에 영향을 미치는자가 면역 섬유 성 질환이다. 이 질환의 특징은 하트 7, 8, 9, 10, 11을 포함한 내부 장기의 섬유화된다. 연구의 특성상 저해 펩티드의 디자인을 요구했다. 소프트웨어 방법은 파지 디스플레이를 이용하여 기존의 방식을 통해 선택되었다. 소프트웨어 접근 방식은 쉽고 적은 시간을 소모합니다. RCSB 데이터 뱅크는 적절한 결합 부위 (12)를 식별하는 데 사용된다. 재조합 단백질 새롭게 설계 펩타이드의 상호 작용을 연구 및 바인딩 파라미터에 집중하는 기술이라고 biolayer 간섭 법을 사용 하였다. Biolayer 간섭은 바이오 센서 기반 techniq입니다UE 즉, 바이오 센서 및 바인딩 샘플을 사용하여 결합 친화, 협회 및 탈퇴를 결정한다. 바이오 센서는 형광, luminescently, 라디오 측정 및 비색 표시 될 수 있습니다. 이 측정은 질량 부가 또는 고갈 협회 탈퇴 13, 14 닮은에 기초한다. 본 연구의 목적은 염증과 심근 섬유증 IRF5의 역할을 이해하는 것이다. 목표는 조직의 섬유화 및 경피증의 개발에 IRF5의 역할에 대한 통찰력을 얻을 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labeled 염소 안티-마우스 IgG 항체&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford 시약</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>피어스&nbsp;</td></tr><tr><td>바이오센서</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrate</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>1:1,000 희석, PBS</td></tr><tr><td>당나귀 안티 쥐 Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>1:1,000 희석, PBS</td></tr><tr><td>ECL 및</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>많은 시행착오 끝에 EZ</td></tr> C1 레이저 스캐닝 소프트웨어 Nikon <tr><td></td><td></td><td></td>염소 안티 토끼 Alexa 488 Thermo Fisher가<td>있는 Eclipse TE 200-U 현미경</td></tr>으로 돌아왔습니다.<tr><td></td><td></td><td>A-11008</td><td>1:1,000 PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anti-goat</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10,000 희석 TBS</td></tr><tr><td>HRP 당나귀</td><td>anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>1:10,000 TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>1:200 PBS</td></tr><tr><td>IRF5 항체 (H56)</td><td>Santa Cruz 1:200 희석 Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트 리더 Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP 호중구 마커</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>1:200 PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>단백질-단백질 결합</td></tr><tr><td>펩타이드 설계에 희석&nbsp; Medit SA 소프트웨어</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>재조합 IRF5 단백질 합성</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>단백질 발현, 합성 서비스</td></tr><tr><td>소듐 도데실 포스페이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>436143</td><td>세제</td></tr><tr><td>케타민</td><td>약국</td><td></td><td>스케줄 III 통제 물질, 처방 필요&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X 삼안 해부 줌 스테레오 현미경 구즈넥 LED 라이트</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Zeba 탈염 컬럼</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>내피 기초 미디어 EBM 불릿 키트</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>키트에는 성장 서플메트</td></tr><tr><td>VIA-100K</td>가 포함되어 있습니다<td>. Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>MedSuMo 소프트웨어</td><td>Medit, Palaiseau, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

인터페론 조절 인자 5(IRF5)는 세포가 전염증 또는 항염증 방식으로 반응하는지 결정하는 데 중요합니다. 한 경로에서 다른 경로로 세포를 전환하는 IRF5의 능력은 치료 대상으로서 매우 매력적입니다. 우리는 소분자 및 펩타이드를 설계하기 위한 분자 모델링 소프트웨어로 미끼 펩타이드 IRF5D를 설계했습니다.
IRF5D는 IRF5를 억제하고, 세포외 기질의 변화를 감소시키며, 타이트스킨 마우스(Tsk/+)의 내피 혈관 확장을 개선했습니다. 재조합 IRF5에 대한 IRF5D의 K는 3.72 ± 0.74 x 10-6 M이며, 이는 생물층 간섭계 실험을 사용한 결합 실험에 의해 결정된 바와 같습니다. 내피 세포(EC) 증식 및 세포사멸은 IRF5D의 농도 증가를 사용하여 변하지 않았습니다(0 - 100 μg/mL, 24 시간). Tsk/+ 마우스는 IRF5D(피하 1mg/kg/d, 21d)로 처리했습니다. IRF5D 처리 후 IRF5 및 ICAM 발현이 감소했습니다. IRF5D로 치료한 Tsk/+ 마우스의 안면 동맥 혈관 확장으로 평가한 바와 같이 내피 기능이 개선되었으며, 이는 IRF5D 치료를 받지 않은 Tsk/+ 마우스와 비교되었습니다. 전사 인자(transcription factor)로서 IRF5는 세포질에서 핵으로 이동합니다. 전좌는 다른 심장 세포외 기질에서 배양된 심장 근세포에 대한 면역조직화학에 의해 평가되었습니다. Tsk/+ 마우스의 IRF5D 처리는 IRF5D 처리하지 않은 동물에 비해 IRF5 양성 핵의 수를 감소시켰습니다(50μg/mL, 24시간). 이러한 발견은 IRF5가 Tsk/+ 마우스의 염증 및 섬유증에 중요한 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

도 1에서 보여준 결과 펩타이드를 디자인하는 방법을 보여준다. 그림 1, 왼쪽은 키나제의 숫자에 의해 인산화되어 IRF5의 영역 (2 노란색 화살표 사이, 아미노산 (AA) 425-436)를 보여줍니다. 그림 1, 오른쪽은 IRF5의 인산화 도메인이 결합하는 노란 타원형을 보여줍니다. 3DSH의 이량 체 구조는 나선 2 (aa303-312)의 왼쪽에 갈라진 틈이나 계곡을 관찰하기 위해 회전했다. IRF5의 포스 테일 도메인이 완전히 (즉, 세린 인산화) 호모 다이머 형성 및 가정 생물학적으로 활성 상태로 활성화 될 때 바인딩 예상되는 곳이다. 도 2에서, biolayer 간섭계에 의해 측정 된 결합 활성이 도시되어있다. 미끼...

우리는 IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 C57Bl/6J 대조군 마우스, 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에서 심장 세포외 기질의 분리를 설명합니다. 또한 C57Bl/6J에서 분리된 혈관, IRF5 억제성 펩타이드로 처리된 타이트-스킨 마우스 및 타이트-스킨 마우스에 대한 혈관 확장 연구를 설명합니다.

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

세포외 기질의 분리 및 ex vivo 혈관 확장을 위한 이 절차들의 전반적인 목적은 설치류에서 IRF5 억제 펩타이드 치료를 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포외 기질의 변화가 질병 진행을 어떻게 촉진하거나 완화하는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 혈관 확장 연구의 주요 장점은 모든 신호 전달 구성 요소를 고려하지 않고도 in vivo 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있다는 점입니다.심장 세포외 기질의 분리 방법은 뒷다리나 폐와 같은 다른 장기에도 적용될 수 있습니다. 저희는 처음 타이트 스킨(tight skin) 생쥐의 fibrillin 1 중복에 집중하기 시작했을 때, 변화된 세포외 기질과 세포 행동의 영향을 인식하며 이 아이디어를 얻었습니다. 생쥐를 마취하고 수술 준비를 마친 후, 가위를 사용하여 피부를 절개하십시오.흉부에서 턱뼈 가측까지 절개하되, 턱 앞쪽의 하부 조직이 손상되지 않도록 주의합니다. 그런 다음 주변 연부 조직을 제거하여 안면동맥(fascialis artery)을 박리합니다. 이 과정에서 동맥이 손상되지 않도록 주의하십시오.노출된 조직이 건강한 상태를 유지하도록 MOPS 완충액으로 적셔줍니다. 안면동맥(fascialis artery)이 완전히 노출되면, 동맥을 절단할 지점에서 원위부(distal)에 있는 첫 번째 분기점의 근위부(proximal) 안면동맥을 잡습니다. 그다음, 모동맥으로부터 이를 절단하고 포셉으로 안면동맥을 잡습니다.fascialis에서 뻗어 나온 두 분지를 절단한 후, 분기점에 도달할 때까지 주변 조직과의 연결을 끊으며 혈관을 조심스럽게 들어 올립니다. 분기점에서 두 자동맥을 절단하여 혈관을 분리하고, 필요할 때까지 수분이 유지되도록 mops buffer가 담긴 접시에 옮깁니다. 혈관 확장을 측정하기 위해, 먼저 혈관에 캐뉴라를 삽입할 준비를 합니다.말단 직경이 125에서 175 micron인 유리 피펫에 MOPS 완충액을 가득 채웁니다. 용액 저장조 또한 MOPS로 채웁니다. 이제 분리된 혈관에 캐뉼라를 삽입합니다.안과용 봉합사를 사용하여 유리 피펫에 묶으십시오. 피펫 내부에 기포가 형성되지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 비디오 카메라가 부착된 도립 현미경에 혈관 챔버를 장착하십시오.비디오 캘리퍼 측정 시스템을 통해 비디오를 실행하여 화면상에서 혈관을 측정합니다. 이제 2단계 과정을 통해 혈관에 가압합니다. 먼저, 20 mmHg의 압력이 가해지도록 MOP

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 원시 그대로의 미세 혈관 내피 세포의 칼슘 신호를 시각화하고 조작하기위한 준비를 제시한다. 내피 튜브 갓 골격 근육 주위의 세포 내와 사이에 생체 형태와 동적 신호의 유지 공급 마우스 저항 동맥에서입니다. 내피 튜브는 다른 조직 및 기관의 미세 혈관으로부터 제조 될 수있다.

마우스 저항 동맥의 미세 혈관 내피 튜브의 분리

세포 외 기질은 상처 치유, 염증과 종양 발생시 상당한 개조를 겪는다. 우리는 섬유의 역학뿐만 아니라 표면 형광 또는 이광자 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도를 가진 메쉬 형상의 매트릭스 성분을 시각화하는 신규의 intravital 면역 형광 현미경 방식을 제시한다.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

제시 한 쥐의 등쪽 피하 지방 챔버의 창은 musculocutaneous 플랩의 급성 지속적인 허혈 영역을 시각화. 미세 혈관 및 혈류 역학의 정량의 직접적이고 반복적 인 평가를위한 생체 내에 에피 형광 현미경 수 있습니다. 형태 학적 및 혈역학 적 결과는 더 조직 학적 및 분자 분석과 관련 될 수있다.

마우스의 등쪽 피하 지방 상공 회의소에서 허혈성 조직 손상 : 피부 플랩 모델은 급성 영구 허혈을 조사하기

이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.

쥐 관상 동맥 혈관 평활근 세포의 분리

우리는 매트릭스 겔 플러그 혈관 분석의 변형을 사용하여 마우스에서의 인간 내피 주연 세포의 상호 작용을 연구하는 프로토콜을 제시한다.

마우스의 매트릭스 젤 플러그 분석을 사용하여 인간의 내피 - 주연 세포 상호 작용의 생체 내 연구에

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

여기, 선물이 murine 피부에 침투성 홍보 요원의 피부 관리에 의해 유도 된 혈관 누설을 측정 하는 프로토콜. 이 기술은 홍보 또는 혈관 누설을 억제 하거나 혈관 침투성을 조절 하는 분자 메커니즘 연구를 분자의 능력을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

마일 분석 결과 함께 피부에 혈관 Hyperpermeability 유도 요원 평가

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

대뇌 실질 세동맥으로부터의 무손상 마우스 대뇌 내피 "튜브"의 집중적 인 준비는 뇌 혈류 조절을 연구하기 위해 예시된다. 또한, 우리는 세포 내 [Ca2+] 및 막 전위의 변화를 포함한 주요 세포 신호 전달 경로의 형광 이미징 및 전기 생리학 측정을위한 내피 연구 모델의 실험 강점을 입증합니다.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

학습하세요 심장 세포 외 기질 분리 및 혈관 확장 연구 방법을 통해 IRF5 억제 펩타이드 처리가 혈관 반응 및 질병 진행에 미치는 영향을 분석하는 기술을. 타이트 스킨 마우스 모델을 활용한 이 방법은 심혈관 생물학 연구에 활용됩니다.

격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

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