격리 혈관 혈관 확장 타이트 피부 마우스의 세포 외 기질의 분리

세포외 기질의 분리 및 생체 외 혈관 확장을 위한 이러한 절차의 전반적인 목표는 설치류에서 IRF5 억제 펩타이드 처리를 연구하는 것입니다. 이 방법은 세포외 기질의 변화가 어떻게 질병 진행을 증가시키거나 약화시킬 수 있는지에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 혈관 확장 연구의 주요 장점은 모든 신호 전달 요소를 고려하지 않고도 생체 내 과정에 대한 통찰력을 얻을 수 있다는 것입니다.

심장 세포외 기질의 분리는 뒷다리 또는 폐와 같은 다른 장기에 적용될 수 있습니다. 우리는 단단한 피부 마우스에서 피브릴린 1의 복제에 초점을 맞추기 시작했을 때 처음으로 아이디어를 얻었고 변경된 세포 외 기질과 세포 행동의 영향을 인식했습니다. 마우스를 마취하고 수술 준비를 한 후 가위를 사용하여 피부를 엽니다.

턱뼈 앞쪽의 기저 조직을 방해하지 않도록 주의하면서 가슴에서 턱뼈 옆으로 절단합니다. 그런 다음 근막 동맥 주변의 연조직을 제거하여 근막 동맥을 절개합니다. 이 작업을 수행하는 동안 동맥이 손상되지 않도록 주의하십시오.

노출된 조직을 걸레 완충액으로 목욕시켜 건강을 유지하십시오. 근막 동맥이 완전히 노출되면 동맥이 절단될 원위부의 첫 번째 분기점 근위부를 잡습니다. 그런 다음 모 동맥에서 근막 동맥을 잘라내고 겸자로 근막 동맥을 잡습니다.

근막에서 나오는 두 개의 가지를 잘라낸 다음 분기점에 도달할 때까지 주변 조직과의 연결을 끊으면서 혈관을 부드럽게 들어 올립니다. 분기점에서 양쪽 딸 동맥을 잘라 혈관을 빼내고 필요할 때까지 수분을 유지할 수 있는 걸레 완충액 접시로 옮깁니다. 혈관 확장을 측정하려면 먼저 혈관을 캐뉼레이션할 준비를 합니다.

말단 직경이 125-175미크론인 유리 피펫에 걸레 버퍼로 가득 찬 것을 로드합니다. 또한 용액 저장소를 걸레로 채우십시오. 이제 고립된 혈관을 캐뉼레이션하십시오.

안과 봉합사를 사용하여 유리 피펫에 묶습니다. 피펫에 기포가 형성되지 않도록 하십시오. 다음으로, 비디오 카메라가 부착된 도립 현미경에 용기 챔버를 장착합니다.

혈관의 화면 측정을 위해 비디오 캘리퍼 측정 시스템을 통해 비디오를 실행합니다. 이제 2단계 프로세스를 사용하여 용기에 압력을 가합니다. 먼저 걸레로 채워진 저장소를 용기 위의 높이에서 20mm의 수은 압력으로 들어 올립니다.

걸레로 용기에 줄을 엽니다. 용기가 압력을 가할 때 타이 주변과 용기 길이로 누출 징후가 있는지 확인하십시오. 누출이 발견되지 않으면 60mm의 수은 수은을 생성하도록 저장소를 올리십시오.

그런 다음 용기에 누출이 있는지 다시 검사하십시오. 압력이 누출 없이 유지되면 이 압력에서 30분 동안 용기를 평형을 이룹니다. 평형을 이룬 후, 관심 화합물에 대한 반응으로 혈관 확장을 측정합니다.

먼저 U46619를 추가하여 용기를 1/2에서 3/4로 축소합니다. 용액이 혈관을 6분 동안 목욕시켜 안정화되도록 합니다. 그런 다음 테스트 화합물을 아세틸콜린과 같은 수조 용액에 점차적으로 첨가합니다.

2분마다 수조에서 테스트 용액의 농도를 000001 어금니에서 시작하여 001 어금니까지 10씩 증가시킵니다. 혈관 확장의 변화는 신호 전달에 대한 질문을 불러일으켰습니다. 그러나 우리의 초점은 마음에 있습니다.

동물 사용을 줄이기 위해 심장 세포외 기질을 분리하여 외부에서 시작된 신호에 집중하기로 결정했습니다. 마취된 쥐에서 심장을 채취하는 것으로 시작합니다. 15ml의 긴장성 1% 도데실황산나트륨이 들어 있는 비커로 옮깁니다.

용액을 실온의 교반 플레이트에 올려 18시간 동안 부드럽게 저어줍니다. 다음 날, 용액을 5% 트리톤 X100 15ml로 30분 동안 바꾼 다음 PBS 15ml로 15분 동안 변경합니다. 그런 다음 ECM과 액체 질소를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 급속 동결합니다.

일단 얼면 조직을 미리 냉각된 절구와 절굿공이에 옮기고 가루로 갈아냅니다. 항생제를 첨가한 PBS의 분말을 점성 용액에 1:100 농도로 현탁시킵니다. 높은 초음파 설정의 얼음 수조에서 30-60 초 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다.

ECM 단백질은 이제 분리되어 차갑게 유지되어야 합니다. 단백질을 사용하기 전에 Bradford Assay를 사용하여 농도를 측정하십시오. IRF5D 펩티드는 정상적인 IRF5와 크게 다른 억제성 펩타이드입니다.

IRF5D는 17개의 아미노산만 가지고 있으며 IRF5의 인산화 부위에 결합합니다. 이것은 인산화 및 동질이합체화를 방지하여 IRF5 활성 상태의 형성을 방해합니다. 이형접합적 타이트한 피부 마우스를 3주 동안 IRF5D로 피하 처리했습니다.

호중구 및 CD64의 수는 시야당 염색된 세포의 평균 수에서 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같이 감소되었습니다. IRF5D 처리는 인산염 완충액으로 처리한 마우스와 비교하여 IRF5D로 처리된 이형접합성 타이트한 피부 마우스에서 근막 동맥의 아세틸콜린 유도 혈관 확장을 개선했습니다. 형질전환 마우스의 심장 조직에서 유래된 배양된 근세포에서, 대조군 마우스보다 단단한 피부 이형접합 마우스의 배양물에는 더 많은 IRF5 양성 세포가 있었습니다.

두 배양물 중 하나를 IRF5D로 처리하면 IRF5 양성 핵이 감소했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 심장을 탈세포화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일단 숙달되면이 기술은 많은 장기로 옮겨 다양한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다 그리고 매트릭스를 과도하게 소화하지 않는 것이 중요하다는 것을 기억하십시오.

또한 근막 동맥을 절개하고 매달아 놓는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이 기술을 완전히 익히면 약 60분이 소요되며 거의 모든 혈관 침대에 사용할 수 있습니다. 내피가 얼마나 약한지 기억하고 해부 중에는 주의해서 진행하는 것이 중요합니다.

건강한 평활근과 손상된 내피가 있는 것은 드문 일이 아닙니다.