Name: Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 덱스트란을 활용한 NK 세포의 렌티바이러스 유전자 전달 방법을 통해 면역치료 연구에서 유전자 변형 효율을 높이는 기술을 익히세요.

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우리는 루시아 Sammarco와 그녀의 룰 루의 레모네이드 스탠드 영감, 동기 부여, 및 지원을 위한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 AI102893와 NCI R01 CA179363 (S.M.);에 의해 부분적으로 지원 NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); 알렉스 레모네이드 스탠드 재단 (S.M.); MACC 기금 (S.M.;의 HRHM 프로그램 S.R.; M.S.T); 니콜라스 가족 재단 (S.M.); Gardetto 가족 (S.M.); 현대 학자 (M.S.T.) 프로그램; 바퀴 (S.R.);에 현대 희망 MACC 기금 (M.S.T. 및 S.M.); 어린이 연구소, MCW (S.R.); 그리고 캐시 Duffey Fogerty 수상 (M.J.R.).

모든 동물 프로토콜 동물의 자비 롭 고 윤리적인 치료를 따 랐 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 내는 생물 의학 연구 센터 (BRC) 의학 대학 위스콘신 (MCW), 밀워키, 위스콘신에 의해 승인 했다. 인간 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 사용 하 여 혈액 센터 위스콘신, 밀워키, 위스콘신의 혈액 연구소의 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다.
1. 마우스, 셀 라인, 및 벡터
<ol><li>상용 공급 업체에서 C57BL/6 마우스를 가져옵니다. 병원 체-무료 조건에서 마우스 식민지를 유지 하 고 6과 12 주 사이의 암컷과 수 컷 쥐를 사용 하 여. IRB 승인 소스에서 취소 확인 된 인간의 PBMCs를 가져옵니다.</li>
	<li>Anesthetize는 마우스를 프로필 렌 글리콜 (1, 2-propanediol, USP 급료)에 20-30 %v / v isoflurane의 혼합물으로 동물 anesthetize 쥐 마 취하는 동안 건조를 방지 하기 위해 눈에 수 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>동물 안락사, 마 취 유도 후 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.<ol>
<li>단단히 쥐고 한 손으로 꼬리의 기지에 의해 쥐를 제 지. 튼튼한 스틱 형 펜 또는 엄지와 첫 번째 손가락, 목의 뒤에 대 한 다른 한편의 두개골의 기지에서 배치 합니다.</li>
		<li>전위를 생성 하려면 동물의 머리 앞으로 하 고 기본 꼬리를 잡고 손으로 뒤로 당기면 밀어 억제 손을 밀어. 자 궁 경부 조직의 분리에 대 한 느낌으로 전위의 효과 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적어도 5 분 동안 챔버/장에 동물을 유지 하 고 있을 때는 탐지의 부족 또는 호흡 활동은 결 석 하는 경우에 그들을 제거.</li>
	<li>상업용 공급 업체에서 K562과 YAC-1 세포를 가져오고 RPMI1640에서 그들을 유지 하는 것 10%를 포함 하는 중간 열 비활성화 FBS. 이러한 셀 라인 mycoplasma 오염의 가능성을 제외을 정기적으로 테스트 합니다.</li>
</ol>2. 준비 및 lentiviral 벡터의 적정
<ol><li>문화 5 × 106 293T 세포 포함 된 솔루션 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 1mm 나트륨 pyruvate, RPMI1640 매체의 20 mL의 5% 7.5% 나트륨 중 탄산염 용액의 0.001% T75 cm2 플라스 크에서 하룻밤 Β-mercaptoethanol입니다. 5.2% CO2주입 37 ° C 배양 기에서 플라스 크를 놓습니다.</li>
	<li>트립 신 (0.025%)/EDTA (1mm) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 사용 하 여 293T 세포 수확. PBS에서 트립 신/EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37 ° C T75 cm2 플라스 크에서 293T 세포의 분리를 허용 하는 인큐베이터에서에서 10 분 동안 flasks를 품 어.<ol>
<li>분리 된 세포를 수집 하 고 PBS trypsin의 모든 흔적을 제거 하 고 EDTA에 두 번 그들을 씻어. hemocytometer와 셀 고 mL 당 1 백만 셀에 셀 번호를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PsPAX2의 3.95 µ g, 1.32 µ g의 pMD2G, 및 pLEP-GFP-순수 하지 않아 (생성 된 사내 브리 pLenti CMV GFP 순수 하지 않아에에서 CMV 발기인 대신 pWPI에서 EF1alpha 발기인 복제에 의해)의 5.26 µ g 293T 세포18 transfect19.<ol>
<li>150 mM NaCl의 1 mL 플러스 0.6 mg/mL polyethylenimine의 63 µ L를 준비 (페이; 25000 kD, 선형). 잘 혼합 후는 플라스 미드를 추가 하 고 혼합. 실 온에서 20 분 동안 incubate 고 셀에 추가 합니다.</li>
		<li>16 h 후 transfection, 대체 신선한 매체와 transfection 매체 플러스 4.5 m m 나트륨 낙 산 염. 포함 하는 바이러스 48 h 후 transfection 상쾌한 수확 하 고 5000 × g에서 하룻밤 원심 분리에 의해 집중. 자료 테이블을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>293T 세포를 사용 하 여 직렬 희석을 수행 하 여 바이러스 titers를 확인 하 고 시험의 흐름 cytometry 72 h 후 변환20. 측정으로 녹색 형광 단백질 (GFP)의 식을 사용 하 여 바이러스 titers을 계량.</li>
</ol>3. 정화와 murine 기본 NK 세포의 확장
<ol><li>정화 murine 기본 NK 세포21. 간단히, 단일 셀 비장 정지 나일론 양모 열 B 세포와 대 식 세포로 구성 된 부착 인구를 고갈을 통해 전달 합니다.</li>
	<li>문화 비 점착 인구 eluted murine NK 세포 1000 U/mL 인터 루 킨 (IL)-2 RPMI1640 매체에 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 1mm 나트륨 pyruvate, 7.5% 나트륨 중 탄산염의 5%를 포함 하는 나일론 양모 열에서 솔루션, 그리고 0.001% β-mercaptoethanol (RPMI1640 완전 한 매체).</li>
	<li>하루에 4의 비 부착 T와 NKT 세포; 제거 하이 문화는 플라스 크에서 매체를 변경 준수는 플라스 크에 남아 있는 세포는 주로 NK 세포. 20 mL 신선한 RPMI1640 완전 한 매체 및 1000 U/mL는 플라스 크를 보충 하기 위해 일리노이-2 추가 합니다.</li>
	<li>NK 세포 특정 마커20 CD3의 95% 이상으로 준비를 사용 하 여 하루 7 cytometry에 murine NK 세포 배양의 순도 확인-NK1.1+ 인구.</li>
</ol>4. 정화와 인간의 기본 NK 세포의 확장
<ol><li>건강 한 인간의 지원 자의 버 피 코트에서 밀도 그라데이션에 의해 PBMCs를 격리 합니다. 잠시, 신중 하 게 반-희석 (HBSS) 셀 밀도 그라데이션 50 mL 정식 튜브에서의 15 mL 이상 35 mL 레이어. 브레이크 없이 진동 물통 회전자에 20 ° C에서 30 분 400 × g에서 원심.</li>
	<li>상업 항 체 기반 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 기본 인간 NK 세포를 정화.</li>
	<li>절연, 다음 면역 형광 분석으로 NK 세포 준비의 순도 결정 합니다. PBS NK 세포 인구 세포 표면에 CD56의 존재와 CD3의 부재에 의해 결정으로 두 번 NK 세포 준비 2 µ g/mL 안티-CD3와 4 ° C에서 2 µ g/mL 안티 CD56 항 체 20 분 세척에 대 한 셀을 얼룩.</li>
	<li>4 ° C에서 20 분에 대 한 항 체와 세포 준비 품 어, PBS로 세척 하 고 교류 cytometer에서 분석. NK 세포 준비를 사용 하 여 85% 이상의 순도 유전자 변환에 대 한 분석 실험20.</li>
</ol>5. 변환 lentivirus와 murine 및 인간의 기본 NK 세포의
<ol><li>GFP lentivirus 감염 (MOI)의 5, 10, 그리고 20 다양성에서 표면에 뜨는 존재와 Pb의 존재 하는 매체의 0.5 × 105/mL에서 마우스 또는 24-잘 접시의 인간의 기본 NK 세포를 일시 중단 (8 µ g/mL), PS (8 µ g/mL) 또는 dextran (8 µ g/mL).</li>
	<li>60 분에 대 한 1000 × g에서 격판덮개 원심</li>
	<li>셀 하룻밤 (16-18 h) 5.2% 주입 37 ° C 배양 기에서 문화는 상쾌한 decanting, 없이 공동2.
</li>
	<li>10 mL의 PBS로 세척 하 고 일리노이-2의 완전 한 RPMI1640 문화 매체의 2 mL에 resuspend (300 U/mL).</li>
	<li>인간을 테스트 하 고 51크롬 (Cr)을 수행 하 여 각각 기본 NK 세포 중재 된 세포 독성 K562과 YAC-1에 대 한 마우스-릴리스 분석 실험에서 다양 한 이펙터-대상 셀 비율22.<ol>
<li>간단히, 방사선된 나트륨 크롬 51Cr의 1 백만 대상 셀 50 µCi를 제공 합니다. 4-h 인큐베이션 기간 동안, 그들은 이해는 51Cr 세포 단백질으로. 외피의 끝에, 어떤 비법 인된 라벨을 제거 하는 세포를 씻어.</li>
		<li>대상 셀에서 51Cr의 절대 자연과 실험 자료의 양에 의해 특정 종양 세포 세포의 용 해를 계산 합니다. 주: pentaplicate 실험에서 특정 세포의 비율의 계산 수행은 다음 수식을 사용 하 여: % 특정 세포 = ((51Cr 의미 실험 자료- 51Cr 의미 자연 방출) (51의 Cr 의미 / 최대한 출시- 51Cr 의미 자연 스러운 릴리스)) х 100, 어디 "51Cr 의미 자발적인 방출" 51NK 세포의 부재에서 대상 셀에서 발표 하는 Cr 이며 "51Cr 말은 최대한 릴리스" 51Cr 2 N 염 산 (HCl)에 의해 대상 세포 세포의 용 해 시에서 발표.</li>
	</ol>
</li>
	<li>7 일에는 플라스 크를 부드럽게 눌러 transduced NK 세포를 수확.<ol>
<li>밤새 안티 NKG2D mAb의 2.5 µ g/mL 농도와 96-잘, 높은 단백질 흡수 폴리스 티 렌 플레이트를 코팅 하 여 플레이트-바인딩 안티-NKG2D (A10) mAb의 적정 한 농도와 수확된 셀을 활성화 합니다.</li>
		<li>각 씻어 주 NK 세포의 추가 하기 전에 세 번 PBS의 100 µ L로 잘.</li>
	</ol>
</li>
	<li>문화 supernatants 크린 시 토 킨 IFN-γ 등 계량 h 후 활성화 16와 18 사이 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 재조합 cytokines 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트와 함께 제공 된를 사용 하 여 표준 곡선을 생성 합니다.</li>
	<li>Annexin-V/7-아미노-악티노마이신 D (7-AAD) 얼룩23 을 사용 하 여 NK 세포 생존 능력을 테스트 하 고 교류 cytometer를 사용 하 여 변환 된 NK 세포 중 회 저 성 세포의 비율을 결정 합니다.<ol>
<li>이 분석을 수행 하려면 수확 murine 및 인간 NK 세포 변환, 후 4 일 두 번 5 분 각, 500 × g에서 차가운 PBS의 10 mL로 씻어과 Annexin V (PE)와 함께 알을 품고 / 7 AAD 키트.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 흐름 cytometry 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석. 라이브 세포 인구를 선택 하 고 바이러스 성 변환24의 GFP (FITC 채널)의 식을 분석.</li>
</ol>

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금융 분쟁의 관심을 주장 하는 저자.

이 연구는 양이온 폴리머 에이전트 murine 및 인간의 기본 NK 세포의 lentiviral 변환 효율 향상 dextran의 사용 하는 보여줍니다. 또한, 다른 양이온 대리인, Pb 등 PS, 아무 인지할 수에 영향을 바이러스 성 벡터의 기본 인간 NK 세포에. 이전에, Pb 인간 T 세포17에 유전자 변환 증가 수 있습니다 입증 되었습니다. 그러나 이러한 결과, Pb도 PS 기본 인간 NK 세포에 비슷한 효율을가지고 제안. 이 연구에서 Pb만 겸손 하 게 변환 효능 향상 murine NK 세포에서. 그것은 보였다는 증강으로 BX795, TBK1/IKKɛ, 및 PS의 억제제를 사용 하 여 세포내 항 바이러스 방어 메커니즘의 저해 lentiviral 변환 효율25증가 시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 결과 보여주었다이 억제제는 murine 인간의 기본 NK 세포 (데이터 표시 되지 않음)에 변환 효능에 영향을 주지 않습니다.
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자연적인 살인자 (NK) 세포는 타고 난 면역 시스템1의 주요 림프모구 인구. NK 세포는 종양과 감염2,,34에 대 한 호스트 면역 반응의 첫 번째 라인 수비수로 작동합니다. NK 세포는 또한 발산5와 강력한 cytokines의 분 비를 통해 관용의 개발에 중심 역할을 한다. 종양 세포를 대상으로 그들의 강력한 능력으로 인해 여러 임상 시험 암6,7에 대 한 입양 immunotherapy로 인간 NK 세포 기증자 파생 된을 평가 하기 위해 실시 되고있다. 달리 T 세포, NK 세포의 발달 생물학이 있다 아직 잘 특징8. 지식의이 부족은 부분적으로 마우스 또는 인간의 기본 NK 세포의 유전자를 전달 하는 효율적인 기술의 부재 때문입니다. 이러한 이유로 대부분의 NK 세포 연구 1 차 셀 대신 셀 라인에서 실시 되었습니다. 따라서, 안정적이 고 효율적인 프로토콜 transduce 기본 NK 세포의 유전자에 대 한 필요성은 중요 합니다.
이 연구의 전반적인 목표는 기본 인간 또는 murine NK 세포 lenti-또는 레트로 바이러스 불리고 수 있는 일관 되 고 신뢰할 수 있는 방법을 공식화 했다.
이 문제를 해결 하려고 하는 이전 연구, 크게 기본 NK 세포의 과도 변화를 사용 하 여 수행 되었습니다. 이 플라스 미드 transfection9,10, 엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 포함 / 하이브리드 retroviral 벡터11, vaccinia 벡터12,13및 Ad5/F35 공상 adenoviral 벡터14. 이러한 기술의 겸손 한 효율성에도 불구 하 고 변환의 과도 특성은 그들이 유전자 변형된 NK 세포의 장기 활용에 적합 합니다. 몇 가지 최근 연구 transduce NK 세포, 감염 유전자 표현11,15의 수락 가능한 수준을 달성 하기의 여러 주기를 요구를 retroviral 벡터를 사용 했습니다. Retroviral 벡터, 달리 lentiviral 벡터는 바이러스 사전 통합 복잡 한 핵으로 이동 하 호스트 세포 핵 가져오기 기계를 사용할 수 있습니다. 이것은 기본 NK 세포를 포함 하는 비 분열 세포에서 바이러스의 복제에 주요 제한 요소 이다.
다른 세포 표면 수용 체와 바이러스 성 입자 사이 상호 작용 셀으로 바이러스 성 통풍 관을 허용합니다. 바이러스 성 봉투 단백질 및 그들의 동족 호스트 수용 체 사이의 초기 계약이 두 가지 사이의 기존 잠재적인 부정적인 요금 때문에 제한 될 수 있습니다. 많은 변환 기법 뒤에 근거는 polybrene (Pb), protamine 황산 (PS), 등 dextran, 양이온 중합체의 세포 표면 수용 체에 포지티브 차지를 줄 수 있고 그로 인하여 증가 바이러스 성 봉투의 바인딩 단백질입니다. 이 셀16퓨전 효율성과 바이러스 성 입자의 통풍 관을 증가할 것 이다. Pb 또는 PS 향상 시킬 수 있는 T 세포17에 유전자 이동으로 보고 되어, 그들의 응용 프로그램 없 어떤 효과 기본 NK 셀의 변환 효율에서. 또한, 기본 NK 세포를 사용 하 여 이러한 시 약 사이의 비교 분석 하지 수행 되었습니다. 이 연구에서는 3 개의 양이온 중합체의 변환 효율성 비교 되었다. 결과,이 3 개의 양이온 폴리머 중 dextran만 크게 향상 마우스 및 인간의 기본 NK 세포로 효율적인 바이러스 성 변환 보여.

<table><tbody><tr><td>덱스트란</td><td>시그마-알드리치</td><td>90-64-91-9</td><td></td></tr><tr><td>폴리브레네(Pb)</td><td>시그마-알드리치</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>프로타민 설페이트(PS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>p3369</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>코닝</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>코닝</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>아탈란타</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>페니실린</td><td>코닝</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>B-메르캅토에탄올</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>피루브산</td><td>나트륨 코닝</td><td>MT25000CI</td><td></td></tr><tr><td>인터페론 감마 (IFN-&gamma; )</td><td>eBioscience</td><td>14-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>Propidium lodding 염색 용액</td><td>BD</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>PHOENIX</td><td>NDC 57319-559-05</td><td></td></tr><tr><td>NK cell negative selection kit</td><td>Stem Cell</td><td>19855</td><td></td></tr><tr><td>Yac-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td>, <td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>마우스</td>, <td>Jakson</td><td>664</td><td></td></tr>, <tr><td>293T 세포</td>, <td>ATCC,</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr>, <tr><td>T75 플라스크,</td><td>Cornnig</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>항체 기반 음성 선택 키트,</td><td>줄기 세포</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>51Chromium (Cr) 방출 분석</td><td>perkin elmer의</td><td>NEZ030</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 키트</td><td>Ebioscience</td><td>00-4201-56</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마</td><td>5887-5G</td><td></td></tr><tr><td>선형 폴리에틸렌이민</td><td>폴리사이언스</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE 생명과학</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>코닝</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

dextran murine 및 인간의 기본 nk 세포의 lentiviral 변환 효율 향상

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

자연적인 살인자 (NK) 세포에 특정 유전자의 효율적인 변환 주요 도전 하고있다. 성공적인 transductions는 개발, 차별화, 및 NK 세포의 기능에 관심사의 유전자의 역할을 정의 하는 데 중요 합니다. 암 immunotherapy에 공상 항 원 수용 체 (자동차)에 관련 된 최근의 진보 effector 세포에 세 유전자를 전달 하는 효율적인 방법에 대 한 필요성을 강조 합니다. 기본 인간 또는 마우스 NK 세포 중재 lentiviral 유전자 transductions의 효율성 유지 크게 낮은 주요 제한 요인입니다. 최근 진보 양이온 중합체, polybrene, 등을 사용 하 여 T 세포에서 향상 된 유전자 변환 효율을 표시 합니다. 그러나, 이러한 제품 NK 셀의 변환 효율을 개선 하지 못했습니다. 이 작품 보여줍니다 그 dextran, 분기 글 루 칸 다 당 류, 크게는 인간의 변환 효율 및 마우스 기본 NK 세포 향상 됩니다. 이 높은 재현성 변환 방법론 인간의 기본 NK 세포, 임상 유전자 배달 응용 프로그램 및 따라서 NK 세포 기반 암 immunotherapy. 훨씬 향상 시킬 수 있는 시험을 위한 유능한 도구를 제공 합니다.

Dextran 유도 lentiviral 벡터 기본 인간과 murine NK 세포에서의 효율적인 유전자 이동
인간 NK 세포 격리 및 (85% 이상의 순도)와 PBMC에서 정화 되었고 rIL-2 300 U/mL와 함께 밤새 껏 알을 품. 이러한 기본 NK 세포 감염의 다양 한 복합성에 GFP lentivirus로 불리고 다음 했다 (나; 3, 10, 및 셀 20 IU) 8 µ g/mL Pb, PS, 또는 dextran 있을 때 24-잘 접시에. 셀 60 분 1000 × g에서 centrifuged 그리고 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 하룻밤 배양 (바이러스)의 존재. 셀 씻어 고 7 일에 대 한 rIL-2 300 U/mL와 함께 신선한 RPMI1640 완전 한 매체에서 resuspended. 변환 효율 cytometry GFP 식 변환 후 7 일...

이 연구의 목표는 기본 자연적인 살인자 (NK) 세포에서 성공적인 유전자 변환에 대 한 허용 하는 기술을 공식화 했다. 인간의 lentiviral 변환 dextran 중재 또는 더 높은 유전자 식 효율성에 마우스 기본 NK 세포 결과. 이 방법은 유전자 변환의 NK 세포 유전자 조작을 향상 방대 하 게 됩니다.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

본 프로토콜의 전체적인 목표는 일차 자연 살해 세포에서 성공적인 유전자 도입을 가능하게 하는 기술을 정립하는 것입니다. 이 방법은 자연 살해 세포(NK 세포)와 같은 작동 림프구에 대한 유전자 변형의 영향 등 면역 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일차 마우스 또는 인간 NK 세포에서 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 렌티바이러스 벡터를 준비하고 적정(titrating)한 후, 단일 세포 비장 현탁액을 나일론 울 컬럼에 통과시켜 B 세포와 대식세포로 구성된 부착 세포군을 제거함으로써 마우스 일차 NK 세포를 정제합니다. NK 세포가 포함된 비부착 세포군을 배양하기 위해 RPMI1640 완전 배지에 1, 000 units/mL의 Interleukin-2를 사용하십시오. 배양 4일 차에 20 mL의 RPMI1640 완전 배지와 1, 000 units/mL의 IL-2를 사용하여 배지를 교체함으로써 비부착 T 세포 및 NKT 세포를 제거합니다.7일 차에 MK 세포 특이적 마커를 사용하여 유세포 분석법으로 마우스 NK 세포의 순도를 확인하며, CD3 음성 및 NK1.1 양성 세포군이 95% 이상인 준비물을 사용합니다. 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리하려면, 50 mL 원추형 튜브에 15 mL의 밀도 구배 용액을 넣고 그 위에 2배 희석한 세포 35 mL를 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 구배 용액을 400 ×g, 20 °C에서 30분 동안 감속 없이 원심분리합니다.텍스트 프로토콜에 따라 인간 일차 NK 세포를 정제한 후, 2 µg/mL의 anti-CD3 및 2 µg/mL의 anti-CD56 항체를 첨가하여 세포의 순도를 결정합니다. 세포를 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.그런 다음, 유세포 분석법으로 세포를 분석합니다. NK 세포 집단은 세포 표면의 CD56에 대해 양성이고 CD3에 대해 음성일 것입니다. 24-웰 플레이트의 웰에 마우스 또는 인간 일차 NK 세포를 배지 mL당 0.5 × 10⁵개 농도로 현탁하고, NLY를 5, 10, 20으로 하여 GFP 렌티바이러스 상청액을 처리합니다.그 후 polybrene, protamine sulfate 또는 dextran이 존재하는 상태에서 플레이트를 1,000 ×g로 60분간 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하지 않은 상태로 5.2% CO2가 충전된 37 °C 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.세포를 10 milliliters의 PBS로 세척한 후, IL-2가 포함된 2 milliliters의 RPMI1640 배지를 사용하여 세포를 재부유합니다. 세포를 수확하기 전날, 96-well 고단백 흡착 폴리스티렌 플레이트를 2.5 micrograms per milliliter의 anti-MKG2D 단클론 항체로 코팅하고, 플레이트를 실온 또는 냉장고에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 100 µL의 PBS를 사용하여 각 웰을 3회 세척합니다. 플레이트를 가볍게 두드려 형질전환된 NK 세포를 수확한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 100 µL를 첨가합니다. 활성화 16~18시간 후에 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다.그런 다음 ELISA 키트의 재조합 사이토카인을 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 상층액 내의 Interferon Gamma와 같은 사이토카인을 정량합니다. NK 세포의 생존력을 테스트하기 위해, 형질전환 4일 후 차가운 PBS 10 milliliters로 세포를 2회 세척합니다. 그 후, 세포를 수확하고 XM5 7-aminoactinomycin D를 사용하여 염색합니다.유세포 분석법을 사용하여 형질전환된 NK 세포 중 괴사된 세포의 비율을 결정하고, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 이 그림은 recombinant IL-2와 함께 배양한 후 GFP Lentivirus를 도입한 인간 NK 세포가 polybrene 또는 protamine sulfate를 추가했을 때보다 dextran을 배양액에 추가했을 때 더 높은 도입 효율을 달성하고 바이러스 타이터가 증가했음을 보여줍니다. 여기서 볼 수 있듯이, 마우스 NK 세포에서도 유사한 결과가 나타났으며, polybrene 또는 protamine sulfate와 비교하여 dextran이 Lentiviral 벡터의 효율을 증대시켰습니다.본 실험에서는 K562 및 YAC-1을 표적 세포로 하여 CR-방출 분석법을 통해 형질전환된 일차 NK 세포의 세포독성 능력을 조사하였습니다. 덱스트란을 이용한 NK 세포의 형질전환은 형질전환되지 않은 NK 세포와 비교했을 때, 형질전환된 NK 세포의 살상 잠재력에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 여기서는 형질전환된 인간 일차 NK 세포를 K562와 24시간 동안 공동 배양한 후, 상층액을 수집하여 Interferon Gamma를 측정하였습니다.결과는 dextran이 형질전환된 NK 세포의 사이토카인 생성 능력에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 또한, 별도의 검증을 통해 plate-bound anti-NKG2DA10 단일클론 항체로 활성화된 dextran 처리 NK 세포가 여전히 사이토카인인 Interferon Gamma를 생성할 수 있음을 확인했습니다. 이 절차를 수행할 때, 형질전환된 세포를 원심분리해야 한다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.이 절차 이후에, 유전자 전달 효율을 높이는 방법과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 transfection과 같은 다른 방법들을 심도 있게 적용할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 면역학 분야의 연구자들은 NK 세포의 유전자 조작을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, NK 세포를 어떻게 형질전환(transduce)시키는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

dextran-enhances-lentiviral-transduction-efficiency-murine-human

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

Lentiviral - 중재 최저 동안 예 VIVO</em인간 조혈 줄기 세포의> 적혈구 조혈

Lentiviruses는 유전자 기능을 탐험을위한 가치있는 연구 도구되지만, 연구진은 알려진 pantropic lentivirus 인코딩이나 의심 oncogenes의 생산을 방지하실 수 있습니다. 대안으로, 우리는 ecotropic 수용체 mSlc7a1을 표현하는 수정된 인간의 세포에 ecotropic lentivirus의 사용을 위해 안전한 프로토콜을 제시한다.

향상된 Biosafety에 대한 고분자 - complexed Ecotropic Lentivirus과 인간의 세포의 형질 도입

이 비디오는 자연살해(NK) 세포에서 양이온 고분자 매개 바이러스 전달에 대한 분석을 보여줍니다. 세포는 형광 단백질을 인코딩하는 형질전환 렌티바이러스 벡터로 배양됩니다. 양이온성 폴리머를 추가하면 바이러스가 세포에 부착하고 RNA를 숙주 게놈에 통합하여 형광 단백질을 발현할 수 있습니다. 형광은 형질주입의 폴리머 유도 향상을 평가하기 위해 정량화됩니다.

Enhancing Viral Transduction in Natural Killer cells Using a Cationic Polymer(양이온성 고분자를 이용한 자연살해세포에서의 바이러스 전달(Viral Transduction in Natural Killer Cells Using a Cationic Polymer)

여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.

항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성

이 문서에서는, 우리는 murine 골에 형광 성 융해 단백질의 표정에 대 한 자세한 프로토콜 파생 수지상 세포와 대 식 세포 제공 합니다. 메서드를 기반으로 골 수의 변환에 창시자 retroviral 구문 뒤에 대 식 세포로 분화 및 수지상 세포 생체 외에서.

Murine 골 수 유래 수지상 세포와 대 식 세포에 형광 성 융해 단백질의 표정

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

본 프로토콜은 3D 및 2D 배양 조건 모두에서 인간 확장 전위 줄기 세포 (hEPSC)로부터 경미한 세포 독성을 갖는 CD3- / CD45 + CD56 + 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다. 이를 통해 복잡한 미세 환경을 파괴하지 않고 일상적인 표현형 검증이 가능합니다.

인간 확장 잠재적 줄기 세포로부터 자연 살해 세포 생성

우리는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생체 내에서 복막 조직 상주 대식세포의 유전자 기능을 조사하기 위한 단계별 프로토콜을 보여줍니다.

생쥐의 In Vivo 에서 복막강 조직 거주 대식세포의 효율적인 유전자 및 MicroRNA 조절을 위한 렌티바이러스 벡터 준비

배우세요 덱스트란을 활용한 NK 세포의 렌티바이러스 유전자 전달 방법을 통해 면역치료 연구에서 유전자 변형 효율을 높이는 기술을 익히세요.

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

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