Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

본 프로토콜의 전체적인 목표는 일차 자연 살해 세포에서 성공적인 유전자 도입을 가능하게 하는 기술을 정립하는 것입니다. 이 방법은 자연 살해 세포(NK 세포)와 같은 작동 림프구에 대한 유전자 변형의 영향 등 면역 요법 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일차 마우스 또는 인간 NK 세포에서 목적 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있다는 점입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 렌티바이러스 벡터를 준비하고 적정(titrating)한 후, 단일 세포 비장 현탁액을 나일론 울 컬럼에 통과시켜 B 세포와 대식세포로 구성된 부착 세포군을 제거함으로써 마우스 일차 NK 세포를 정제합니다. NK 세포가 포함된 비부착 세포군을 배양하기 위해 RPMI1640 완전 배지에 1, 000 units/mL의 Interleukin-2를 사용하십시오. 배양 4일 차에 20 mL의 RPMI1640 완전 배지와 1, 000 units/mL의 IL-2를 사용하여 배지를 교체함으로써 비부착 T 세포 및 NKT 세포를 제거합니다.

7일 차에 MK 세포 특이적 마커를 사용하여 유세포 분석법으로 마우스 NK 세포의 순도를 확인하며, CD3 음성 및 NK1.1 양성 세포군이 95% 이상인 준비물을 사용합니다. 말초혈액 단핵구(PBMC)를 분리하려면, 50 mL 원추형 튜브에 15 mL의 밀도 구배 용액을 넣고 그 위에 2배 희석한 세포 35 mL를 조심스럽게 층이 지도록 쌓습니다. 스윙 버킷 로터를 사용하여 구배 용액을 400 ×g, 20 °C에서 30분 동안 감속 없이 원심분리합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 인간 일차 NK 세포를 정제한 후, 2 µg/mL의 anti-CD3 및 2 µg/mL의 anti-CD56 항체를 첨가하여 세포의 순도를 결정합니다. 세포를 4 °C에서 20분 동안 배양합니다. PBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.

그런 다음, 유세포 분석법으로 세포를 분석합니다. NK 세포 집단은 세포 표면의 CD56에 대해 양성이고 CD3에 대해 음성일 것입니다. 24-웰 플레이트의 웰에 마우스 또는 인간 일차 NK 세포를 배지 mL당 0.5 × 10⁵개 농도로 현탁하고, NLY를 5, 10, 20으로 하여 GFP 렌티바이러스 상청액을 처리합니다.

그 후 polybrene, protamine sulfate 또는 dextran이 존재하는 상태에서 플레이트를 1,000 ×g로 60분간 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하지 않은 상태로 5.2% CO2가 충전된 37 °C 배양기에서 세포를 하룻밤 동안 배양합니다.

세포를 10 milliliters의 PBS로 세척한 후, IL-2가 포함된 2 milliliters의 RPMI1640 배지를 사용하여 세포를 재부유합니다. 세포를 수확하기 전날, 96-well 고단백 흡착 폴리스티렌 플레이트를 2.5 micrograms per milliliter의 anti-MKG2D 단클론 항체로 코팅하고, 플레이트를 실온 또는 냉장고에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 100 µL의 PBS를 사용하여 각 웰을 3회 세척합니다. 플레이트를 가볍게 두드려 형질전환된 NK 세포를 수확한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰에 세포 100 µL를 첨가합니다. 활성화 16~18시간 후에 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다.

그런 다음 ELISA 키트의 재조합 사이토카인을 사용하여 표준 곡선을 작성하고, 상층액 내의 Interferon Gamma와 같은 사이토카인을 정량합니다. NK 세포의 생존력을 테스트하기 위해, 형질전환 4일 후 차가운 PBS 10 milliliters로 세포를 2회 세척합니다. 그 후, 세포를 수확하고 XM5 7-aminoactinomycin D를 사용하여 염색합니다.

유세포 분석법을 사용하여 형질전환된 NK 세포 중 괴사된 세포의 비율을 결정하고, 텍스트 프로토콜에 따라 데이터를 분석하십시오. 이 그림은 recombinant IL-2와 함께 배양한 후 GFP Lentivirus를 도입한 인간 NK 세포가 polybrene 또는 protamine sulfate를 추가했을 때보다 dextran을 배양액에 추가했을 때 더 높은 도입 효율을 달성하고 바이러스 타이터가 증가했음을 보여줍니다. 여기서 볼 수 있듯이, 마우스 NK 세포에서도 유사한 결과가 나타났으며, polybrene 또는 protamine sulfate와 비교하여 dextran이 Lentiviral 벡터의 효율을 증대시켰습니다.

본 실험에서는 K562 및 YAC-1을 표적 세포로 하여 CR-방출 분석법을 통해 형질전환된 일차 NK 세포의 세포독성 능력을 조사하였습니다. 덱스트란을 이용한 NK 세포의 형질전환은 형질전환되지 않은 NK 세포와 비교했을 때, 형질전환된 NK 세포의 살상 잠재력에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 여기서는 형질전환된 인간 일차 NK 세포를 K562와 24시간 동안 공동 배양한 후, 상층액을 수집하여 Interferon Gamma를 측정하였습니다.

결과는 dextran이 형질전환된 NK 세포의 사이토카인 생성 능력에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 또한, 별도의 검증을 통해 plate-bound anti-NKG2DA10 단일클론 항체로 활성화된 dextran 처리 NK 세포가 여전히 사이토카인인 Interferon Gamma를 생성할 수 있음을 확인했습니다. 이 절차를 수행할 때, 형질전환된 세포를 원심분리해야 한다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.

이 절차 이후에, 유전자 전달 효율을 높이는 방법과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 transfection과 같은 다른 방법들을 심도 있게 적용할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 면역학 분야의 연구자들은 NK 세포의 유전자 조작을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, NK 세포를 어떻게 형질전환(transduce)시키는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.