면역 적격 설치류에서 강력한 폐렴 모델에 대해 항균 효능을 평가하기 S. 폐렴 H. 인플루엔자 K. 폐렴 P. 녹농균 또는를했다. baumannii가

이 비수술적 기관지 내 감염 절차의 전반적인 목표는 면역 능력이 있는 설치류에서 강력한 세균성 폐렴을 확립하는 것입니다. 이 방법은 중증 폐렴의 면역 역량 모델에서 잠재적 치료법의 효능을 평가할 수 있도록 함으로써 항균제의 발견 및 개발에 가치를 더합니다. 이 기술의 주요 장점은 일반적으로 동물이 호중구 감소증을 필요로 하는 것 또는 다른 방법으로 생존 가능한 감염을 일으키지 않는 분리물을 포함하여 많은 분리물로 강력하고 재현 가능한 폐 감염을 확립한다는 것입니다.

일반적으로 이 절차를 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 적절한 삽관은 식도 대신 기관을 삽관하기 위한 올바른 감각을 배워야 하는 맹검 절차입니다. 적절한 삽관은 과학자마다 다릅니다.

캐뉼라의 정확한 각도는 모든 사람에게 동일하지 않을 수 있습니다. 기관의 융기에 대한 느낌이 핵심입니다. 이 기술을 시연하는 사람은 우리 실험실의 과학자인 Cindy Mininger가 될 것입니다.

먼저, 텍스트 프로토콜에 표시된 대로 하룻밤 동안 배양한 배양 또는 여기에 설명된 대로 한천 플레이트에서 식염수 박테리아 현탁액을 준비합니다. 멸균 루프를 사용하여 표면에서 집락을 긁어내어 한천 플레이트에서 밤새 성장을 수확합니다. 수확된 물질을 흐리고 불투명한 현탁액이 얻어질 때까지 5ml의 멸균 식염수로 옮기고 균질해질 때까지 배양물을 부드럽게 와류로 만듭니다.

그런 다음 연속적으로 희석하고 텍스트 프로토콜에 따라 각 희석액에서 부분 표본을 플레이팅합니다. 한천을 준비하고 감염 과정에 필요한 도구를 조립한 후 텍스트 프로토콜에 따라 9ml의 한천을 멸균 튜브에 분취한 다음 한천이 약 섭씨 42도로 평형을 이룰 때까지 튜브를 수조에 넣습니다. 미리 준비된 식염수 박테리아 현탁액 1ml를 한천 튜브에 추가합니다.

그런 다음 튜브를 여러 번 뒤집어 섞고 물에 다시 넣으십시오. 수조에 가까운 작업 표면에 깨끗한 일회용 매트를 놓습니다. 작업 표면 및 삽관 장치를 준비하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 금속 캐뉼라와 폴리에틸렌 튜브를 멸균한 다음 유리 저장 튜브에 넣어 작업 표면으로 옮깁니다.

그런 다음 보관 튜브에서 캡을 제거하고 캐뉼라의 손잡이 끝을 튜브의 열린 끝으로 밉니다. 멸균 집게를 사용하여 비커에서 한 길이의 폴리에틸렌 튜브를 제거하고 멸균 금속 캐뉼라 내부를 통해 삽입하여 자유롭게 움직이는지 확인합니다. 지울 수 없는 펜으로 미리 정해진 위치에 가이드 마크를 놓습니다.

다음으로, 바늘을 튜브 안으로 몇 밀리미터 밀어 넣어 멸균 일회용 25 게이지 바늘을 폴리에틸렌 튜브의 자유 끝에 끼웁니다. 그런 다음 멸균 식염수를 사용하여 일회용 새 1ml 주사기를 채웁니다. 폴리에틸렌 튜브에 장착된 바늘에 주사기를 부착하고 튜브를 통해 전체 식염수를 씻어냅니다.

사용한 주사기는 날카로운 물건 용기에 버리십시오. 그런 다음 새 멸균 일회용 1ml 주사기에 수조의 한천 기반 접종물을 채웁니다. 25 게이지 바늘과 튜브를 다시 부착하고 튜브가 한천으로 완전히 채워질 때까지 플런저를 눌러 튜브를 통해 한천을 플러시합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 쥐를 마취한 후 머리가 오른쪽을 향하고 꼬리가 왼쪽을 향하도록 일회용 매트 위에 동물을 누운 자세로 놓습니다. 다음으로, 금속 캐뉼라의 자유 끝을 동물의 입에 삽입합니다. 캐뉼라를 돌려 자유 끝이 위쪽으로 기울어지도록 하고 약간 비틀는 동작으로 후두 구조를 조심스럽게 우회하여 기관으로 부드럽게 전진시킵니다.

왼쪽 집게손가락을 사용하여 기관 고리를 촉진하면서 캐뉼라를 약간 앞뒤로 여러 번 부드럽게 밀어 식도가 아닌 기관에 삽입을 확인합니다. 식도가 아닌 기관으로 삽관을 하려면 캐뉼라를 앞뒤로 약간 움직여 융기를 만져 보십시오. 캐뉼라가 목구멍 아래로 부드럽게 미끄러져 내려가고 융기가 느껴지지 않으면 장치를 제거하고 다시 시도하십시오.

캐뉼라가 기관이 왼쪽과 오른쪽 기관지로 갈라지는 분기점에 도달하면 캐뉼라가 왼쪽 기관지에 삽입되도록 동물의 왼쪽을 향해 약간 비틀는 동작을 합니다. 흔한 오류는 접종물을 폐 깊숙이 삽입하지 않는 것인데, 이는 기도를 막고 호흡을 방해할 수 있습니다. 캐뉼라가 적절한 각도로 돌면 왼쪽 기관지로 쉽게 미끄러져 들어가 적절한 깊이로 부드럽게 전진해야 합니다.

금속 캐뉼라의 끝이 왼쪽 폐의 절반에서 3/4 지점까지 전진시키고, 이전에 배치된 가이드 마크를 사용하여 적절한 깊이에 도달했는지 확인합니다. 금속 캐뉼라가 제자리에 있는 상태에서 튜브에 미리 배치된 가이드 마크를 사용하여 폴리에틸렌 튜브를 몇 밀리미터 전진시켜 금속 캐뉼라의 끝을 빠져 나와 폐에 구멍을 뚫지 않을 만큼만 전진하도록 합니다. 두 캐뉼라가 모두 제자리에 있는 상태에서 부착된 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 한천 현탁액을 왼쪽 폐의 대엽 깊숙이 주입합니다.

튜브를 몇 밀리미터 빼내고 손상되지 않은 삽관 장치를 부드럽게 제거합니다. 유리 보관 튜브에 다시 넣고 동물을 새 우리로 옮겨 회복하세요. 쥐를 위해 적절한 크기의 장비를 사용하여 쥐를 위해 방금 시연한 것처럼 작업 표면과 캐뉼라를 준비합니다.

멸균 일회용 1ml 주사기와 멸균 25게이지 바늘을 사용하여 유리 마이크로 주입 주사기에 멸균 식염수를 채웁니다. 그런 다음 재조립된 장치를 통해 식염수를 세척합니다. 다음으로, 새로운 멸균 일회용 1ml 주사기와 멸균 25게이지 바늘을 사용하여 마이크로 주입 주사기에 한천 접종물을 채웁니다.

그런 다음 장치를 다시 조립하고 튜브가 한천으로 완전히 채워질 때까지 튜브를 통해 한천을 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 마취한 후, 쥐에게 보여준 것과 동일한 방향으로 동물을 배치하고, 쥐와 유사한 방식으로 기관을 삽관하기 위해 꾸준하지만 부드러운 압력을 사용합니다. 이 기술은 마우스에서 더 섬세하므로 힘을 사용하지 마십시오.

기관 고리에 대한 감각을 통해 캐뉼라가 기관에 삽입되었는지 확인합니다. 캐뉼라를 약간 돌려 왼쪽 기관지로 전진시키고 이전에 배치된 가이드 마크를 사용하여 폐 깊숙이 삽입합니다. 금속 캐뉼라를 제자리에 놓고 폴리에틸렌 튜브를 몇 밀리미터 전진시키고 20마이크로리터의 한천 현탁액을 주입합니다.

여기에 표시된 것은 폐 균질산 샘플의 연속 희석 및 삼중 도금 후 한천 플레이트에서 성장하는 콜로니의 대표적인 예입니다. S.pneumoniae에 대한 이 그래프에서 알 수 있듯이, 감염 후 96시간에도 대부분의 박테리아 분리물에서 감염된 폐에서 기준선 대조군보다 높은 여러 log base 10 CFU의 박테리아 부담 증가가 일반적으로 관찰되며 동물 간의 변동성은 낮습니다. 이 실험에서는 S.pneumoniae의 퀴놀론 감수성 또는 퀴놀론 내성 분리물에 대해 두 가지 화합물을 평가하여 이 폐 감염 모델이 구조 활성 관계를 지원하기 위해 선도 화학 계열을 최적화하는 동안 사용될 수 있음을 설명했습니다.

각 기호는 한 쥐의 폐에서 결정된 CFU를 나타냅니다. 다음은 새로운 폴리펩티드 데포르밀라아제 억제제에 대한 약동학적, 약력학적 표적을 결정하기 위해 S.폐렴균 또는 H.인플루엔자에 감염된 면역 능력이 있는 마우스의 용량 범위 효능 데이터를 사용하여 만든 E max 모델입니다. Circles는 다양한 용량의 화합물로 처리된 그룹당 4-5마리의 마우스의 평균 박테리아 부담을 나타냅니다.

열린 원은 곡선 아래의 자유 영역을 나타내고 채워진 원은 최소 억제 농도에 대한 농도 시간 곡선 아래의 영역을 나타냅니다. 이 기술은 일단 숙달되면 동물 한 마리당 약 30초 안에 완료할 수 있으며, 주사기 한 마리당 최대 5-6마리의 동물에게 한천 접종을 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 비수술적 기관지 내 감염 방법을 수행하는 방법을 잘 이해하고 다양한 박테리아 분리물로 폐 감염을 설정하는 데 활용할 수 있어야 합니다.

정력적인 instrumetnal