에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

이 절차의 전반적인 목표는 비통합형 에피솜 벡터를 사용하여 성인 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 iPS 세포를 생성하는 것입니다. 이 프로토콜은 질병 모니터링, 약물 스크리닝 및 일반 방사선 치료를 위해 iPS 세포를 생성하고자 하는 줄기세포 분야의 과학자들에게 도움이 될 수 있습니다. 우리의 리프로그래밍 프로토콜은 매우 간단하지만 매우 효율적입니다.

이 절차를 따르면 혈액 세포 재프로그래밍 기술을 쉽게 습득할 수 있습니다. 플라즈마의 품질은 성공적인 재프로그래밍을 위해 중요합니다. 오염 물질은 재프로그래밍 효율성을 감소시킬 수 있으므로 Episomal Plasmid를 정제하기 위해 Endofree 키트를 사용하는 것이 좋습니다.

iPS 세포는 다른 세포보다 더 취약합니다. 유전자가 통과하는 동안 하나 이상의 세포를 준비시키는 것은 특히 초기 계대에서 대량 세포 사멸을 유발할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 동봉된 원고에 따라 필요한 모든 배양 배지를 준비하십시오.

그런 다음 10mL의 새로운 PB 샘플과 10mL의 PBS 버퍼를 50mL 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 사용하기 전에 PBS를 실온 또는 섭씨 37도로 가져오십시오. 다음으로, 튜브 바닥에 10mL의 피콜을 추가합니다.

이 프로세스는 피콜 층이 PB와 혼합되지 않도록 천천히 수행해야 합니다. 혼합물을 400 x g에서 낮은 가속 및 감속으로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, PB MNC는 PB 플라즈마와 피콜 사이에 위치한 백색 층에 있습니다. 버프 피콜 층을 방해하지 않고 10mL의 PB 혈장을 천천히 흡입합니다.

그런 다음 흰색 층을 새 50mL 튜브에 조심스럽게 수확합니다. 백색층에서 수집된 세포의 총 부피는 약 3-6mL여야 합니다. 그런 다음 PBS를 첨가하여 총 부피를 30mL로 만들고 잘 섞습니다.

그런 다음 400 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 10분 후, 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 20mL의 배양 배지에 재현탁합니다. 잘 섞은 후 400 x g에서 5분 동안 검체를 원심분리하여 대부분의 혈소판을 제거합니다.

그 후, 상등액을 제거하고 1-2mL의 IMDM에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포는 즉시 배양에 사용하거나 나중에 사용하기 위해 냉동할 수 있습니다. 동결 보존을 위해 동일한 양의 동결 보존 매체를 추가하십시오.

세포를 극저온으로 분취하고 즉시 섭씨 80도의 냉동고로 옮깁니다. 이 절차에서는 15mL 튜브에 5mL의 IMDM 배지를 준비합니다. IMDM 배지가 있는 튜브로 옮기기 전에 얼어붙은 PB MNC를 섭씨 37도의 수조에서 빠르게 해동합니다.

400 x g에서 5분에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 그 후, 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 적혈구 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 현미경으로 세포를 계수합니다.

그 후, 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도의 웰당 2mL의 배지로 처리된 6웰 플레이트를 비조직 배양에서 배양했습니다. 3일째와 5일째, 배지를 변경하지 않고 각 웰에 1mL의 신선한 적혈구 배지를 직접 추가합니다. 6일째에는 핵 절제를 위해 PB MNC를 채취합니다.

핵 절제 하루 전, 조직 배양 처리 된 6 웰 플레이트를 섭씨 37도에서 20 분 동안 0.1 % 젤라틴으로 사전 코팅합니다. 비활성화된 MEF 공급 세포를 섭씨 37도의 수조에서 해동하고 즉시 5mL의 MEF 배지가 들어 있는 15mL 튜브로 옮깁니다. 다음으로 400 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다.

그런 다음 6웰 플레이트에서 젤라틴을 제거하고 MEF 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그 후, 젤라틴 전처리된 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 2mL의 MEF 배지에 비활성화된 MEF 세포를 파종하고 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 핵 절제 당일, MEF 배지를 흡인하고 1mL의 적혈구 배지로 교체합니다.

그런 다음 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 10-30분 동안 배양 플레이트를 사전 평형화합니다. 1.5mL 멸균 튜브에 Sox2에 PEV OCT4 2마이크로그램, PEV MYC 1마이크로그램, PEV KLF4 1마이크로그램, PEV Bcl-XL 0.5마이크로그램을 추가합니다. 오염을 방지하기 위해 튜브를 섭씨 50도에서 5분 동안 가열한 다음 실온으로 냉각합니다.

그 후, 57마이크로리터의 뉴클레오펙션 완충액과 13마이크로리터의 보충제 완충액을 샘플에 추가합니다. 10번째에서 6번째 배양된 PBMNC를 2회 배양하여 200 x g에서 7분 동안 원심분리하여 5mL 튜브에 넣습니다. 그 후, 상등액을 제거하고 플라스미드와 핵 펙션 완충액 혼합물을 세포 펠렛에 첨가합니다.

그런 다음 손가락으로 튜브를 튕겨 잘 섞습니다. 다음으로, 세포 현탁액의 DNA를 키트에서 제공하는 큐벳으로 옮기고 큐벳을 덮습니다. 핵 절제 장치에서 프로그램 U-008을 선택합니다.

그런 다음 큐벳을 홀더에 삽입하고 확인을 누릅니다. 그런 다음 홀더에서 큐벳을 꺼냅니다. 0.5-1mL의 예열된 적혈구 배지를 각 큐벳에 추가하고 세포를 사전 평형화된 MEF 플레이트로 즉시 옮깁니다. 일부 샘플의 경우 1mil의 혈액에서 수천 개의 군체를 얻을 수 있습니다.

추가 배양을 위해 단일 콜로니를 선택하려는 경우 100만 개의 세포만 있는 웰 하나를 추가로 파종해야 할 수 있습니다. 저산소증 챔버를 인큐베이터에 넣기 직전에 챔버를 여러 번 부드럽게 흔들어 배양 웰에 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 저산소증 챔버로 옮깁니다.

분당 20리터의 속도로 1-2분 동안 혼합 가스로 챔버를 세척합니다. 그 후, 챔버를 밀봉하고 섭씨 37도에서 샘플을 배양합니다. 뉴클레오펙션 후 2일차에 2mL의 iPSC 배지를 각 웰에 직접 추가합니다.

핵절제 후 4일째에 배지 3mL를 제거하고 새로운 iPSC 배지 2mL를 추가합니다. 이 단계에서 대부분의 살아있는 세포는 피더 층에 부착됩니다. 핵 절제 후 6일째 후, 500마이크로리터의 사용한 배지를 남겨두고 14-18일까지 0.25밀리몰 부티레이트가 보충된 새로운 E8 배지 2mL를 추가하여 배지를 이틀마다 교체하십시오.

여기에 표시된 것은 말초 혈액 세포를 재프로그래밍하기 위한 프로토콜의 개략도입니다. 이 이미지는 AP가 그릇에 서 있는 것을 보여주며, 이 이미지는 PB MNC의 핵 절제 후 14일째에 전형적인 ESC와 같은 iPSC 집락을 보여줍니다. 다음은 TRA-1-60 또는 SSEA4를 표현하는 5번 통로에서 iPSC의 대표적인 FACS 다이어그램입니다.

다음은 NANOG 및 OCT4를 발현하는 iPSC 콜로니의 대표적인 컨포칼 이미지입니다. 여기 이미지는 세 개의 세균층을 모두 포함하는 테라토마의 H&E 염색을 보여줍니다. 이 동영상을 시청한 후에는 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 통합 없는 iPS 세포를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

일단 숙달되면 3주 안에 많은 양의 iPS 세포를 생성할 수 있으므로 실습 시간이 3시간 미만입니다. 우리는 효율적인 혈액 세포 재프로그래밍을 위한 간단한 에피소드 벡터 시스템을 개발했습니다. 우리는 이 저렴한 시스템이 특히 자원이 제한된 소규모 실험실에서 쉽게 채택될 수 있다고 믿습니다.

사람의 혈액과 혈장으로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험복을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.