Name: 단순함의 힘 : 같은 성게 배아 생체 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 배우세요 무척추동물 배아에서 복잡한 세포 신호 전달 경로와 유전자 조절 네트워크를 생체 내에서 효율적으로 특성화하는 방법을. 이 연구는 진화 및 발달 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

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원고를 주의 깊게 읽고 편집해 주신 Robert Angerer 박사님께 감사드립니다. NIH R15HD088272-01, 미시시피 주립 대학의 연구 개발 사무소 및 생물 과학부는 RCR에 이 프로젝트를 지원했습니다.

1. 높은 처리량 모르 폴리 노 디자인 전략 <ol><li> 관심의 유전자 (들) (예를 들어 후보 유전자 접근 방식, 시스 - 규제 분석, RNAseq 및 / 또는 단백체 차동 화면)를 확인합니다. </li><li> 자주 업데이트되는 웹 사이트에서 게놈, transcriptomic 및 유전자 발현 데이터를 사용 (예 : SpBase http://www.echinobase.org (20)와 S. purpuratus 게놈 검색에 http : ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html)을 시공간 발현 프로파일이 문제의 발달 메커니즘과 겹치는 것을 확인합니다. 어떤 발현 데이터가 없다면, qPCR에 프라이머를 생성 및 / 또는 인 시츄 프로브는 안티센스 유전자 발현 패턴을 평가. </li><li> 시공간 발현 패턴을 결정한 후, 게놈 웹 사이트로부터의 DNA 서열을 얻었다. <ol><li> 번역 차단 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 생성하는 오 시퀀스를 획득F 5 &#39;비 - 번역 영역 (5&#39;UTR) 직접 상류에서 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 웹 사이트에서 표현 된 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스에서 개시 코돈. 이 정보가 관심의 유전자를 사용할 수없는 경우, 다음 5 &#39;RACE를 수행합니다. </li><li> , 스플 라이스 차단 모르 폴리 노를 설계 엑손과 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 도구의 발판 BLASTN 도구를 사용하여 인트론을 포함하여 게놈 시퀀스를 검색합니다. </li></ol></li><li> 목적하는 25 염기 쌍 모르 시퀀스를 설계하기 위해, 올리고 뉴클레오티드 설계 사이트 http://oligodesign.gene-tools.com를 사용한다. <ol><li> 병진 차단 모르 들어 병진 표적 서열의 소스로 &#39;3&#39;(5)로부터의 mRNA 서열을 사용한다. 5 &#39;UTR 서열 (전사 시작 사이트의 상류 약 70 뉴클레오티드) 플러스 마크 위스콘신 코돈 시작으로 (시작 사이트의 다운 스트림) 코딩 영역의 25 기지를 포함번째 괄호 (ATG). </li><li> 스플 라이스 차단 모르 들면, 인트론 - 엑손 또는 인트론 - 엑손 경계 시퀀스를 선택하고, 경계 영역 50 염기 (엑손 서열 25 염기 및 인트론 서열 25 염기)를 포함한다. 순서가 고유한지 확인 모르 폴리 노 서열과 게놈을 스캔합니다. </li></ol></li></ol> 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 2. 미세 주입 <ol><li> 300 nmol의 모르 폴리 노의 바이알에 클레아없는 물 100 μL를 첨가하여 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 3 mM의 스톡 용액을 준비한다. 참고 : 디 에틸 피로 카보네이트는 모르 폴리 노를 손상시킬 수 있기 때문에 재 현탁액에 대한 DEPC 처리 된 물을 사용하지 마십시오. </li><li> 최고 속도로 30 초에 대한 재고 올리고 뉴클레오티드 용액이 들어있는 유리 병 아래 첫 번째 재구성 스핀 - 5 ~ 10 분, 짧게 소용돌이 65 ° C에서 (14,000 16,000 XG), 간단히 소용돌이, 열, 룸에서 모르 폴리 노의 재고를 유지 적어도 1 시간 동안 온도. 모르 폴리 노 원액<html> 들 +4 ℃로 -20 ° C에서 저장됩니다. </li><li> 원하는 농도 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 주사 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 일반적으로 20 % 글리세롤 또는 캐리어 125 밀리미터의 KCl 15 % (형광 염료 덱스 트란 10,000 MW 2.5 밀리그램 / μL 원액) FITC-덱스 트란이 포함되어 있습니다. FITC 덱스 트란 등의 형광 덱스 트란 접합체 일상적 표면 형광 현미경으로 주입 된 배아를 식별하는 데 사용된다. -20 ℃에서 보관 주사액. </li><li> 5 분 - 적어도 2 열 블록 또는 수욕에서 65 ° C에서 모르 용액을 가열한다. </li><li> 적어도 10 분 - (16,000 XG 14,000) 최고 속도로 1 분간 원심 분리를위한 - (16,000 XG 14,000), 소용돌이 짧게 모르 폴리 노의 최고 속도에서 30 초 동안 솔루션을 스핀. </li><li> 모르 폴리 노 용액 주입 바늘을 넣습니다. 자세한 미세 주입 프로토콜 Stepicheva과 노래 2014 년 21 환호와 Ettensohn 2004를 참조하십시오&quot;&gt; 22. </li></ol> S. purpuratus 태아에서 24 시간 후 수정 (HPF)에서 3. 고정하고 제자리 프로토콜에서 참고 :이 프로토콜은 아레나스 - 메나 등에서 수정됩니다. 2000 년 23 세티 등. 2014 년 24. <ol><li> 정착 <ol><li> , 배아를 포함하는 웰 (아래 참조) 정착의 몇 방울을 추가 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 그들이 정착 할 수 있습니다. 정착액 솔루션을 제거하고 고정액의 두 개의 추가 180 μL 세척과 배아를 혼합한다. 참고 : 철저하게 부드러운 피펫 위아래로 몇 번으로 세척하는 동안 배아를 혼합하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 신호 대 잡음비를 낮출 수있다. </li><li> pH를 7.0 10mM의 MOPS로 구성된 4 % 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드 실온에서 50 분 시간 1에 대한 두 번째 정착액 세척 (RT)에 수정 배아를 남겨, 0.1 % 트윈 20, 인공 seawateR (ASW). 최상의 결과를 위해 각 시간이 솔루션은 신선합니다. 또한, 편의성과 실용성 배아 96 웰 플레이트에 고정되어있다. <ol><li> 20 ML의 정착액 사용 5 mL의 16 % 파라 포름 알데히드, 15 mL의 ASW, 200 μL 1 M MOPS pH를 7.0, 20 μL 트윈 20. </li></ol></li><li> MOPS 180 μL에 실온에서 5 회 반복한다 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M의 NaCl 및 트윈 20 적어도 5 분 동안 또는 배아 때까지이 우물의 바닥에 떨어 0.1 %로 구성된 버퍼를 씻는다. 다시, 충분히 부드럽게 피펫 팅하여 여러 번 아래 세척 완충액으로 배아를 혼합하는 것이 중요하다. (4)에 저장된 경우 MOPS 세척 완충액을 2 일 동안 사용될 수있다 기음. <ol><li> 40 mL를 들어 MOPS 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을 32 mL의 DH 2 O, 40 μL 트윈 20을 씻는다. </li><li> 고정 배아 2 일 동안 4 ℃로 저장 될 수있다. 주 : 이상 고정 된 배아를 저장하는 경우, 박테리아 성장을 방지하기 위해 버퍼 워시 MOPS에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다.</li></ol></li></ol></li><li> 사전 하이브리드 <ol><li> MOPS는 버퍼 워시 기음과 2의 180 μL를 추가, 하이브리드 버퍼에 버퍼 부드러운 피펫 몇 배 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS의 1의 비율. 혼성화 완충액 70 % 포름 아미드, 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M NaCl을 구성, 1 ㎎ / ㎖의 BSA, 0.1 % 트윈 -20. <ol><li> 40 mL의 하이브리드 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을, 4 mL의 DH 2 O, 0.04 g의 BSA, 40 μL 트윈 20. , 텍싱에 의해 잘 섞는다 다시 28 mL의 포름 아미드, 및 소용돌이를 추가합니다. </li></ol></li><li> MOPS 세척 및 하이브리드 버퍼의 1의 비율과 1의 180 μL를 추가 : 2를 제거, 하이브리드 버퍼에 버퍼 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS 2 비율. </li><li> 하이브리드 버퍼 150 μL - 프로브 하이브리드 부드럽게 (100)에 배아를 혼합하기 전에. 적어도 1, 50 ° C에서 배아 부화시간. 참고 : 하룻밤 배아를 배양하는 것은 허용됩니다. 배양 전에 증발을 방지하기 위해 접착 시트 웰을 밀봉. </li></ol></li><li> 이종 교잡 <ol><li> 프로브 솔루션을 만들 부드럽게 한 다음, 하이브리드 버퍼에 소용돌이를 0.3 프로브의 NG / μL 500 μg의 / mL의 효모의 tRNA - 별도의 튜브에 0.1를 추가합니다. 효모의 tRNA는 안티센스 프로브의 비특이적 결합을 감소 시키도록 프로브 용액에 첨가된다. 이 50 ° C의 솔루션 및 흡인 하이브리드 버퍼를 예열. </li><li> 프로브 용액 100 μL에 미리 혼성화 된 배아 믹스 접착 시트로 밀봉하고, 상기 프로브에 따라 2 내지 7 일 동안 50 ° C에서 혼성화합니다 (foxq2 프로브 2 일 동안 배양 될 수있다). 참고 : 배양 시간은 프로브를 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 수준으로 발현 일부 유전자는 7 일 동안 배양까지 필요로한다. 96- 웰 플레이트는 ADHES 경우 증발에 대하여 보험 등 습도 상자에 배치 될 수있다필자 시트가 제대로 밀봉되지 않습니다. </li><li> 갓 만든 MOPS 180 μL와 50 ° C에서 5 회 반복 3 시간 총 버퍼를 씻는다. 이어서, MOPS의 μL 실온에서 세척 완충액 (180)으로 3 회 (15 분) 세척 하였다. 세척에 배아 부드럽게 여러 번 피펫 팅에 의해 때마다 버퍼 혼합해야합니다. </li></ol></li><li> 항체 배양 <ol><li> MOPS는 버퍼 워시 대기음 10 % 정상 양 혈청 5 밀리그램으로 구성된 버퍼를 차단의 180 μL에 배아를 혼합 / 버퍼 하룻밤 실온에서 적어도 45 분 4 ° C에 대해 품어 씻어 MOPS에서 ㎖의 BSA. </li><li> 버퍼를 차단 제거한 다음 1 포함하는 버퍼 차단으로 배아를 혼합 : 버퍼를 차단에 희석 알칼리 포스 파타 아제 접합 된 항 - 디그 옥시 제닌 항체의 1,500 희석. 증발을 방지하기위한 밀봉 판에 RT에서 밤새 인큐베이션. 참고 : 하룻밤 이상에서 항체를 두지 마십시오. </li><li> 배아 6 번 씻으 (5 분 또는 배아가 떨어질 때까지) MOPS에 실온에서 버퍼를 씻는다. 배아 수4 ℃에서 하룻밤 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 현장 개발 <ol><li> 0.1 M 트리스의 pH 9.5, 100 mM의 염화나트륨, 50 mM의의 MgCl 2, 1 ㎜의 levamisole로 구성된 갓의 pH 9.5 완충액으로 실온에서 배아 3 회 (10 분) 세척하고, 0.1 % 트윈 20. <ol><li> 20 ㎖의 pH 9.5 버퍼 사용 2 mL의 1 M 트리스 산도 9.5, 400 μL 5M NaCl을 1 mL의 1 M의 MgCl 2, 20 μL 트윈 20, 16.6 mL의 DH 2 O, 및 0.0048 g의의 levamisole. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 염색 버퍼에 37 ° C에서 배아를 품어. 염색 완충액 10 %의 디메틸 포름 아미드로 구성 4.5 μL / ㎖ 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 및 갓의 pH 9.5 완충액 3.5 μL / ㎖의 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 일 포스페이트 (BCIP) . <ol><li> 염색 버퍼의 한 ML 100 μL 디메틸 포름 아미드, 4.5 μL NBT, 3.5 μL의 BCIP를 사용합니다. </li></ol></li><li> MOPS에 3 ~ 5 회 세척하여 알칼리 포스 파타 아제 반응을 중지 버퍼를 씻는다. 반응 위스콘신foxq2 프로브는 일반적으로 1 시간 30 분 소요 번째. 일부 프로브는 RT 4 °에 C 중 하나에서 하룻밤 배양을해야 할 수도 있습니다. </li><li> 70 % MOPS 세척 30 % 글리세롤의 솔루션으로 배아를 섞는다. 글리세롤 현미경 필요한 굴절률을 제공한다. 배아 몇 주 동안이 용액에 저장 될 수있다. 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀으로 판을 밀봉합니다. </li></ol></li><li> 슬라이드 준비 및 이미지 캡처 <ol><li> 슬라이드 위에 스트립 사이의 작은 틈으로 삼각형에 양면 테이프의 세 개의 작은 스트립을 배치하여 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 삼각형의 중심에 70 % MOPS 세척하고 30 %의 글리세롤 용액에서 배아를 전송하고, 커버 슬립으로 덮고. </li><li> 커버 슬립의 가장자리 주위 매니큐어의 층을 도포하여 커버 슬립을 밀봉. </li><li> 20 배의 대물 렌즈와 연결된 카메라 복합 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐. </li></ol></li></ol>

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<li>Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal%3A+master+and+commander+of+the+dorsal-ventral+and+left-right+axes+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo.</a> Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).</li>
<li>Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LvNumb+works+synergistically+with+Notch+signaling+to+specify+non-skeletal+mesoderm+cells+in+the+sea+urchin+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo.</a> Development. 135, 2445-2454 (2008).</li>
<li>Range, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-regulatory+analysis+of+nodal+and+maternal+control+of+dorsal-ventral+axis+formation+by+Univin%2C+a+TGF-beta+related+to+Vg1%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1.</a> Development. 134, 3649-3664 (2007).</li>
<li>Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+hedgehog+signaling+to+the+establishment+of+left-right+asymmetry+in+the+sea+urchin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin.</a> Dev Biol. 411, 314-324 (2016).</li>
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</ol>

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여기에 제시된 방법은 .. 많은 연구소가 해부 일찍 성게 개발 과정에서 유사한 분석을 사용하는 기본적인 발달 메커니즘을 지배하는 신호 전달 경로와 GRNs을 이해하는 척추 동물보다 작은 게놈과 형태 학적 복잡성 배아를 사용하는 능력을 보여주는 예입니다 다른 세포 운명 사양 이벤트에 관련된 신호 전달 경로 (예 노치 헤지 호그, TGF-β의와 FGF 신호) 27, 28, 29, 30, 31. 이 성게 연구는 후구 동물 9, 27, 30 &lt;사이에서 보존되는...

유전자 조절 네트워크 (GRNs) 신호 전달 경로는 성인 동물 신체 계획을 작성하는 데 사용되는 배아 발달 동안 유전자의 시공간적 식을 설정. 세포 간 신호 전달 경로는 세포가 통신하는 수단을 제공하는 이러한 규제 네트워크의 필수적인 구성 요소이다. 이러한 세포의 상호 작용을 수립하고 배아 1, 2 중에 다양한 지역과 중 규제 및 분화 유전자의 발현을 수정. 세포 외 분비 조절제 (리간드 길항제) 수용체 공동 수용체 간의 상호 작용은 신호 전달 경로의 활동을 제어한다. 세포 내 분자의 구색은 세포의 변형 된 유전자 발현, 분할 및 / 또는 형상의 결과로 이러한 입력을 transduces. 주요 경로에있는 세포 및 세포 수준에서 사용되는 키 분자의 대부분은 있지만공지 그것은 개개 신호 경로의 복잡성으로 인해 많은 부분에서 불완전한 지식이다. 또한, 다른 신호 경로는 종종 세포, 세포 내에서 양 또는 음 중 서로 상호 작용하고 전사 레벨 3, 4, 5, 6. 중요한 신호 전달 경로의 중심 구성 요소는 고도로 모든 후생 동물 종에서 보존하고, 특히 관련성 phyla의 발 미생물과 비교하면 현저하게 중요한 신호 전달 경로의 대부분은 종종 많은 종에서 유사한 발달 기능을 수행하는 7, 8, 9, 10, 11. 개발하는 동안 신호의 연구는 모든 생물의 발굴 작업이며,이척추 동물에서 큰 가능한 리간드 및 수용체 / 공동 변조기 상호 작용의 수, 세포 내 전달 분자뿐만 아니라, 거기에 1) : 가장 후구 동물 모델 (척추 동물, 무척추 척색, 반삭 동물 및 극피)의 신호 전달 경로를 연구하는 몇 가지 중요한 문제는 때문에 유전체 (12, 13), (14)의 복잡도에 서로 다른 신호 경로들 사이의 상호 작용 가능성; 2) 척추 동물의 복잡한 형태와 형태 형성의 움직임은 종종 더 어렵게 및 신호 전달 경로 사이에서 상호 작용을 해석 할 수 있도록; 3) 대부분의 비 극피 동물 무척추 동물의 후구 동물 모델 종의 분석은 일부 피막이 종 (15, 16)를 제외하고 임신 횟수의 짧은 창으로 제한됩니다. 그만큼성게 배아 상술 제한 몇 가지며 생체 내 신호 전달 경로의 상세한 분석을 수행하기 위해 많은 독특한 특성을 제공한다. 이들은 다음을 포함한다 : 1) 성게 게놈의 상대적 단순성 크게 가능한 리간드, 수용체 / 공동 수용체 및 세포 내 전달 분자의 수를 감소시킨다 (17)과의 상호 작용; 2) 세균 층 및 주요 배아 축 사양 및 패턴을 제어하는 GRNs 잘 신호 (18), (19) 수신 셀 / 지역의 규제 문맥의 이해를 돕고, 성게 배아 년에 설립된다 배아가 그 형태를 분석하기 쉽다 단층 상피 구성 때 3) 다수의 신호 전달 경로는 초기 및 절단 낭배 단계 사이 연구 될 수있다 4) 분자를 포함쉽게 조작하는 성게의 신호 전달 경로에서 D; 5) 많은 성게는 10 ~ 11 개월 년 (예 : Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus)에 대한 임신하는됩니다. 여기서 우리는 체계적이고 효율적으로 지정하고 성게 배아의 패턴 영역이 여러 무척추 동물 모델 시스템은 복잡한 분자 메커니즘의 연구에 제공하는 이점을 설명하기 위해 신호 전달 경로의 구성 요소를 특성화 할 수있는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>번역 차단 모르폴리노 및/또는 스플라이스 차단 모르폴리노</td><td>Gene Tools LLC</td><td>사용자 정의</td><td>www.gene-tools.com</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D1821</td><td>Make 25 mg/mL stock solution</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1254-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>23336-0010</td><td></td></tr><tr><td>포름아미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47671-1L-F</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타아제 접합 항디곡시제닌 항체</td><td>Roche</td><td>11 093 274 910</td><td></td></tr><tr><td>테트라미솔 염산염(레바미솔)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base UltraPure</td><td>Research Products Internationall Corp</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>BCIP(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이</td>트 <td>Roche</td><td>11 383 221 001</td><td></td></tr><tr><td>4 니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드(NBT)</td><td>Roche</td><td>11 383 213 001</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 포름아미드</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4551-500mL</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P9541-5KG</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>M7506-2KG</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 알드리치</td><td>C1016-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions

배아 발달 과정에서 성체 형태의 다양한 세포 유형과 조직을 생성하기 위해 필요한 세포 간 신호 전달 경로는 현저히 적습니다. 그러나 매년 개별 신호 경로의 더 많은 구성 요소가 발견되고 있으며, 연구에 따르면 상황에 따라 이러한 경로 대부분에서 상당한 혼선이 발생한다고 합니다. 이러한 복잡성으로 인해 모든 생체 내 발달 모델 시스템에서 세포 간 신호 전달을 연구하는 것은 어려운 작업입니다. 또한 차세대 차등 스크린에서 생성된 대규모 데이터 세트에서 식별된 신호 경로와 관련된 분자를 특성화하기 위해 효율적인 기능 분석이 필요합니다. 여기에서는 성게 배아에서 세포 운명과 축 사양을 제어하는 신호 전달 경로의 구성 요소를 효율적으로 식별하는 간단한 방법을 보여줍니다. 성게와 유사한 배아의 게놈 및 형태학적 단순성은 복잡한 신호 상호 작용을 이해하기 위한 강력한 생체 내 발달 모델을 만듭니다. 여기에 설명된 방법론은 개별 경로에서 새로운 신호 전달 분자를 식별하기 위한 템플릿으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 다른 많은 유기체의 다양한 경로에서 분자 간의 상호 작용을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

성게 배아에서 우리는 3 가지의 Wnt 신호 지점 (이 Wnt / β-catenin이,이 Wnt / JNK와의 Wnt / PKC) 4, 25 상호 작용은 전후방 (AP) 패턴에 적용의 Wnt 신호 전달 네트워크를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시그널링 이벤트의 가장 중요한 결과 중 하나는 초기 넓게 표현 전방 neuroectoderm (ANE) GRN가 낭배의 시작 (S.의 purpuratus HPF 24)에 의해 전방 기둥 주위의 작은 영역에 제한된다 있다는 것이다. 이러한 결과는이 Wnt / β-catenin의 신호가 32 세포 단계에서 배아의 후방 절반 ANE 유전자의 활성화를 방지 함을 나타냅니다. 그리고,이 경로는 점진적으로 아래로 60 세포 단계 초기 낭배의 배아의 앞쪽 절반에 ANE GRN을 조절 비표준의 Wnt / JNK 신호 ...

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and ...

이 실험들의 전반적인 목표는 발생 과정을 지시하는 유전자 조절 네트워크 간의 복잡한 상호작용을 연구하는 데 있어 단순 생물이 제공하는 이점을 설명하는 것입니다. 이러한 방법론은 신호 전달 경로가 후생동물의 주요 배아 축을 따라 세포 운명 지정(cell fate specification)을 어떻게 조절하는지와 같은 진화 및 발생 생물학의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법론의 주요 장점 중 하나는 생체 내(in vivo) 발생 맥락에서 신호 전달 경로와 그로 인해 활성화되는 유전자 조절 네트워크를 효율적으로 특성화하는 데 사용할 수 있다는 점입니다. 이 절차의 시연은 Marina Martinez-Bartolom이 맡을 예정입니다.

the-power-simplicity-sea-urchin-embryos-as-vivo-developmental-models

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

미세 주입 계란, 배아, 다양한 종류의 세포로 DNA의 구조, mRNA를, 모르 폴리 노의 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 다른 치료를 제공하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

morphant 배아를 생성하는 방법은 발달 메커니즘과 유전자 규제 네트워크를 연구하는 것이 필수적이다. 바다 스타 Patiria miniata는 이러한 연구에 대한 새로운 모델 시스템입니다. 여기서 우리는 배아의 문화를, 배우자를 얻기 생산을위한 프로토콜,이 종 접합자의 빠른 미세 주입을 제시한다.

의 미세 주입을위한 방법 Patiria의 minata 접합자

우리는 축 발달과 병행하여 자기 조직화, 대칭 파괴 및 신장을 표시하는 마우스 배아 줄기 세포의 응집체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 기술을 사용하면 축 방향 발달 과정과 단층 배양에서 수행하기 어려운 세포 유형의 생성을 연구할 수 있습니다.

마우스 배아 줄기 세포의 집계의 세대 대칭 속보, 양극화 및 응급 집단 행동은보기가<em&gt; 체외</em

제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

줄기 세포처럼<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아의 Explants는 초기 신경 발달의 특징을 연구하는<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

여기에 설명된 프로토콜은 관심 세포 유형에서 선택적으로 발현되는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 유전자 인코딩 전압 지시기(GEVI)와 함께 생체 내 시스템에서 제브라피시 배아를 사용하여 가장 비침습적인 생리학적 조건에서 흥분성 세포의 전기적 특성을 연구할 수 있도록 합니다.

살아있는 Zebrafish 배아에서의 바이오 센스 모터 뉴런 멤브레인 잠재력

다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.

분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성

Zebrafish blastoderm explant는 초기 배아 내내 내인성 신호 센터에서 배아 세포를 분리하여 생성되며, 상대적으로 순진한 세포 클러스터를 쉽게 조작하고 배양하여 ex vivo를배양한다. 이 문서에서는 이러한 각질에 대한 지침을 제공하고 위장 중에 Nodal 신호에 대한 역할을 심문하여 유용성을 입증합니다.

제브라피시 배아에서 나이브 Blastoderm 의 세대

여기에서 우리는 척추동물 Xenopus laevis 배아에서 알려진 조직 운명을 가진 세포 계통의 질량 분석 기반 단백질체 특성 분석을 설명합니다.

발달 중인 (개구리) 배아의 세포 계통 유도 질량 분석법 단백질체학

신호 전달 경로의 광유전학적 조작은 발달, 재생, 항상성 및 질병에서 신호전달이 어떻게 해독되는지 조사하는 강력한 전략이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 초기 제브라피시 배아에서 광-산소-전압 감지 도메인 기반 결절 및 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 신호 활성제를 사용하기 위한 실용적인 지침을 제공합니다.

제브라피시 배아의 광유전학적 신호전달 활성화

배우세요 무척추동물 배아에서 복잡한 세포 신호 전달 경로와 유전자 조절 네트워크를 생체 내에서 효율적으로 특성화하는 방법을. 이 연구는 진화 및 발달 생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아

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