Name: 오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 마우스 Wolffian 덕트의 오르간 문화 및 전체 마운트 면역 형광 염색법을 통해 기관 발달 과정을 시각화하고 이해하는 방법을. 이 기술은 생체 내 환경을 모방하여 정확한 발달 생물학 연구 결과를 제공합니다.

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우리는이 원고의 중요한 읽기 위해 부인과 종양학 그룹의 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 국립 보건 의료 연구위원회, 호주 연구위원회, 그리고 암 연구소 NSW (PST)에서 자금을 지원합니다. MK 뉴캐슬 대학원 연구 활동의 대학을받는 사람입니다.

동물 관리 및 실험 절차는 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 법, 뉴 사우스 웨일즈 동물 연구 규제 및 관리를위한 호주 코드와 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회의 지침에 따라 수행하고 확인 하였다 과학적 목적을 위해 동물의 사용합니다. 마우스에 착수 모든 절차는 뉴캐슬 대학의 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1 시간 짝짓기 <ol><li> 쌍 6~8주 세 남성 및 일광 사이클이 종료 직전 암컷 마우스. </li><li> 질 플러그의 존재 이른 아침 (또는 8.00 이전 AM), 매일 매일 암컷을 확인합니다. 플러그의 날 0.5 DPC로 간주됩니다. </li><li> (남성)없이 새로운 케이지에 질 플러그 여성을 전송하고 플러그의 날짜를 레이블을 붙입니다. </li></ol> 마우스 배아 생식소 능선 2. 분리 <ol><li> 마우스 embryon을 분리후술하는 바와 같이 15.5 DPC 임신 여성에서 생식기 IC 리지는 약간의 수정 9에 기재된 바와 같이. </li><li> 임신 한 여성이 오후에 의한 임신의 다음날에 들어갈 것으로 간주하는 시간으로 정오 전에 절개를 수행합니다. </li><li> 자궁 경부 전위를 사용하여 15.5 DPC 임신 여성을 희생 (또는 기관의 동물 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라). </li><li> 흡수성 티슈 페이퍼에 그 뒷면에 마우스를 유지하고 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 스프레이. </li><li> 흉곽에 끝까지 비뇨 생식기 개구부로부터 연장, 집게와 하복부 피부 (복부 쪽)을 들어 올려 수술 가위를 사용하여 횡 절개를합니다. 복부를 노출 동물의 머리를 향해 피부를 당겨. </li><li> 복강을 노출 수술 가위로 복부 근육을 잘라. 바로 자궁 경부 위의 집게로 임신하는 자궁을 잡고 상처를합니다. 이제 t에 개최하여 자궁을 들어 올려오 방광 및 복막 첨부 파일에서 자궁를 분리하기 - 자궁 접합에서 삭감 다음에 자궁 넓은 인대를 잘라. </li><li> 빙냉 HBSS (행크 균형 염 용액)을 함유하는 50 ㎖ 튜브에 자궁 옮긴다. 여분의 혈액을 제거하는 얼음처럼 차가운 HBSS로 부드럽게 임신하는 자궁을 씻으십시오. </li><li> 빙냉 HBSS를 함유하는 페트리 접시에 자궁 유지하고 얼음에 유지한다. 자궁 벽을 잘라 배아를 꺼내. 얼음에 HBSS와 신선한 페트리 접시에 배아를 유지합니다. </li><li> 깨끗한 살균 티슈 페이퍼를 가지고 새로운 배양 접시에 넣어. 티슈 페이퍼에 70 % 에탄올을 분무. 측면에서이 조직 종이에 배아를 유지하고 그림 1에서 점선으로 나타낸 바와 같이 방향 멸균 블레이드를 사용하여 하복부에서 잘라. </li><li> 척추를 고정하여 멸균 스폰지베이스의 배아를 수정합니다. </li><li> 해부 실체 현미경 아래로 놓고 조심스럽게 복부 정중선을 따라 절단. 간과 창자를 제거합니다. 마우스 비뇨 생식기 시스템 (신장, 요관, 고환, WD 및 정관)는 이제 볼 수 있어야합니다. </li><li> 고환 및 WD를 잘라, 얼음에, HBSS와 신선한 페트리 접시에 보관하십시오. 하여 WD와 고환을 사용하려면, 요도에 첨부 파일에 가까운 정관을 잘라 gubernaculum에서 WD의 하부의 첨부 파일을 잘라. </li><li> 같은 그룹의 배아 (이 실험 계획에 따라 다를 수 있음)에서 고환 및 WDS 수영장. </li></ol> 배아 생식소 능선 3. 문화 (그림 2) <ol><li> 10 % FBS (소 태아 혈청), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % L- 글루타민으로 DMEM / F12를 보충하여 배아 생식 융기 배양 배지를 준비한다. 수조에서 37 ° C로 미디어를 따뜻하게. </li><li> 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰 당 300 μL 미디어를 추가한다. </li><li> 신선한 페트리 접시를 가지고 그것에 무균 HBSS의 작은 방울을 넣어. (0.8 폴리 카르 보 네이트 트랙 에치 막 넣어81, 그 빛나는 표면이 HBSS를 향 HBSS이 드롭 m). </li><li> 사용 청소 집게는 (위를 향하고, 그 거친 표면에) 막에 두 WDS와 생식선을 넣어 살균 물티슈 / 흡수 종이를 사용하여 HBSS의 최대 크기를 제거합니다. 흡수 종이로 조직을 만지지 마십시오; 그렇지 않으면, 조직이 손상된다. </li><li> WDS이나 생식선도이 서로 닿지되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면 이후의 배양 기간 동안 함께 스틱 것입니다. </li><li> 공기 매체 인터페이스 300 μL 배지 및 배양을 함유하는 24- 웰 플레이트의 웰에서 조직과 멤브레인을 전송. WDS의 낭성 성장에 막 결과에 너무 많은 배지. </li><li> 5 % CO 2의 존재하에, 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 매일 배양 배지를 변경합니다. 피펫으로 매체를 변경하려면, 잘 처음부터 매체를 제거하고 데워진 신선한 매체의 300 μL를 추가합니다. 노트:WD의 형태 형성에 다른 신호 경로의 영향을 연구하는데 필요한 농도에서 화학 활성제 및 / 또는 억제제가 배지에 첨가 할 수있다. </li><li> 문화 3 일의 조직. 3 일 내에서, 15.5 DPC 배아에서 수집 uncoiled WDS는 매우 선상 튜브 (그림 3B)로 변환. 의 Wnt 억제제 IWR1의 첨가는 코일 WD (도 3c)의 억제를 초래한다. </li><li> 수확 이러한 조직은 얼음처럼 차가운 PBS와 페트리 접시를 취할. 페트리 접시에 배양 생식선 및 WD와 멤브레인을 전송합니다. 멤브레인은 PBS에 떠 있습니다. PBS에서 싱크와 생식선 및 WD 꺼내 멤브레인을 누릅니다. </li><li> 4 ℃ 또는 실온에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) O / N와 조직을 고정한다. 필요한 경우, 고정하기 전에 WDS의 명 시야 이미지를 가져 가라. </li></ol> 4. 전체 마운트의 면역 형광 <ol><li> 세척 고정 된 조직은 PBS-T (PBS + 1 %로 3 배실온에서 천천히 흔들, 10 분 각각에 트리톤 X-100). </li><li> 천천히 흔들 (~ 30 RPM)와, 4 ° C에서 에탄올 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직 탈수. 이 단계에서, 조직을 75 % 에탄올을 4 ℃에서 저장 될 수있다. <ol><li> , 에탄올을 변경 2 분 동안 방해받지 않고 조직을 유지하고 수 있도록 조직이 정착. 가능한 상층 액을 가지고 에탄올의 다음으로 높은 농도를 추가합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 피펫 팁은 모든 단계에서 조직을 만지지해야합니다. </li></ol></li><li> 탈수 후, 천천히 흔들 함께 4 ℃에서 에탄올 (100 %, 75 %, 50 % 및 25 %), 10 분, 각각의 등급에 직렬로 조직을 재수. </li><li> 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-T (PBS + 0.1 % 트리톤 X-100), 4 배속, 20 분 각각으로 조직을 씻으십시오. </li><li> 블로킹 완충액으로 RT에서 1 시간 동안 조직을 차단 (PBS + 1 % BSA + 0.2 % 무 지방 건조 우유 분말 + 0.3 % 트리톤 X-100). </li><li> AfteR 차단 (버퍼를 차단에 희석) 차 항체 용액에 조직을 전송하고 부드러운 락 (~ 30 RPM)와 4 ° C에서 O / N을 품어. 사용 된 일차 항체의 희석은 자료 표에 설명되어 있습니다. </li><li> 다음 날, 부드러운 락 (~ 30 RPM)로, RT에서 PBS-MT (PBS + 2 % 무 지방 분유 분말 + 0.5 % 트윈 20), 4 배속, 30 분 각각으로 조직을 씻는다. </li><li> 부드러운 락으로 차단 버퍼에 250 (이 단계는 개별 항체에 대한 최적화를 필요로) 및 실온에서 1 시간 동안 배양이 세척 단계 후, 1의 희석에 차 항체를 추가합니다. </li><li> 지금부터 이후 이차 항체가 빛에 민감 형광으로 표시 될 때 빛에 노출되지 않도록 알루미늄 호일로 덮여 조직을 유지. </li><li> 조직이 부드러운 락으로, PBS-T (PBS + 0.1 % 트윈 20), 30 분 각각 3 배 씻으십시오. </li><li> 스테인드 조직을 장착 슬라이드를 준비합니다. <ol><li> 이를 위해, 유리 커버 슬립 컷및 다이아몬드 펜을 사용하여 얇은 스트립으로 두 스트립 네일 에나멜을 사용하여 유리 슬라이드 위에 다른 하나를 스틱. 이 두 경계 사이에 두 경계와 장소 조직을 만듭니다. </li><li> DAPI 포함하는 설치 매체를 추가하고 커버 슬립에 넣어. 슬라이드에 그것을 해결하기 위해 커버 슬립의 모서리에 네일 에나멜을 적용합니다. 참고 : 조직은 이제 이미징을위한 준비가되어 있습니다. -20 ° C에서 다음 슬라이드를 저장합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+morphogenesis+of+the+Wolffian%2Fepididymal+duct%2C+more+twists+and+turns%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns.</a> Dev Biol. 325, 6-14 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

장기 배양 시스템은 기존의 세포 배양 시스템에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 시스템은 서로 다른 세포 유형 사이의 원래 구조 관계와 상호 작용을 유지합니다. 이는 생체 내 시스템에서 모방하고 틈새 계수가없는 세포 배양 과정보다 더 정확한 정보를 제공한다. 기관 배양 물 시스템의 사용은 심지어 전체 동물을 사용하여보다 이점이있다. 이 전체 동물, 쉽게 관리 및 기관 배양 물 시스템의 유지 보수 등을 또한 사용의 높은 비용을 포함하는 다양한 약학 제 또는 약물 절연 / 배양 기관 및 기관의 직접 반응하지 전신 일 수를 테스트 할 수있다 공부했다. 배아 WDS의 성공적인 문화를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 손상된 조직이 잘 성장하고 낭포 성이되지 않는 조직은 자신의 무결성을 손상시키지 않고 신중하게 수집해야합니다. 의 상단에 미디어의 초과필터는 WDS의 낭포 성 성장으로 이어집니다. 우리는 어떤 오염없이 조직 문화 후드 외부 ...

남성 생식은 주로 고환 이루어져 생식 세포의 발생과 분화 및 정자의 성숙, 전송 및 저장을 위해 요구되는 복잡한 도관 시스템 사이트. 부고환은 정관과 고환 및 생식 세포 (1)의 후 고환 발달과 성숙에 주로 관여를 연결하는 관 모양의 기관이다. 고도로 꼬인 성인 마우스 부고환 간단한 직선 전구체 튜브 Wolffian 덕트 (WD) (1)로부터 발생한다. 정자 여성 생식 세포이 기름지게하는 능력을 획득하는 부고환 복잡하고 코일 구조가 필수적이다. 남성 불임에 대한 이러한 중요한 장기가 형태로 개발하고 얻는 방법을 잘 이해되지 않는다. 다양한 신호 경로는 예 Wnt 신호 전달 경로 및 경로 3,4- 5 시그널링 안드로겐으로 WD의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 우리의 최근 작품은 벨의 요구를 설립했다고급의 Wnt는 태아 개발 4시 WD의 코일 링에 대한 시그널링. 그러나, 상기 연구는 부고환 내 상피 및 간질 세포 생후 부고환 권취, 세포 분화 및 세포 간 통신에 관련된 메커니즘을 이해하기 위해 필요하다. 유전자 변형 마우스 모델은 다양한 기관 시스템 (6)의 개발 및 질병을 기본 분자 메커니즘의 식별 / 검증을위한 강력한 도구로 입증되었습니다. 광범위한 사용에도 불구하고, 추정 유전자 기능에 관해서 타겟 마우스 돌연변이의 예상치 못한 표현형, 일부 모델에서 널 (null) 돌연변이에 더 표현형, 유전 적, 환경 적 요인의 영향, 노동 집약적 등 유전자 변형 마우스 모델의 중요한 제한이있다 시간 소모적 마우스 모델을 개발하는 과정. 따라서, 단지 MODI 유전자에서 발견의 중요성 해석들이었다 마우스 모델은 항상 6 간단하지 않다. 이러한 제한은 우리 제어 배양 조건에서 실시간으로 다수의 신호 경로를 조작 할 수있는 유연성을 제공 관내 기관 배양 물 시스템의 사용에 의해 극복 될 수있다. 기관 배양 물 시스템은 전체 기관 (7)의 생리 병리학을 이해하는 수단이있다. 이되어 장기의 형태, 구조 및 기능 (8)의 더 나은 이해를 제공하고, 생체 내에서 존재하는 또, 형광 표지 된 항체로 염색하여 전체 장기의 화상은, 입체적 환경에서 관심있는 마커를 시각화 우릴 수있다. 여기, 우리는 WDS와 같은 관상 기관의 형태 형성에 대한 질문의 다양한 대답을 적용 할 수 있습니다 마우스 배아 생식 능선의 분리, 체외 문화와 WDS의 전체 마운트 면역 형광 이미징을위한 방법을 설명했다. 이 프로토콜에서, 우리15.5 일에서 격리 된 마우스 배아 비뇨 생식기 능선은 교미 (DPC) 임신 댐을 게시하고 상피 세포 마커 (사이토 케라틴 8, CK8), 세포 증식 마커 (포스 포 히스톤 3, PH3) 및 활성에 대한 면역 염색 한 다음 3 일 동안을 배양 βcatenin.

<table><tbody><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Corning, USA</td><td>3524</td><td>는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>. Hank' s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, USA</td><td>SH30031.02</td>는 <td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium : 영양소 혼합물 F-12 (DMEM / F12)</td> <td>Sigma, USA</td><td>D8437</td><td>Warm in 37 &deg; 사용 전 C 수욕</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Interpath,&nbsp; 호주</td><td>SH30034.02</td><td>배양 매체에 사용되는 10% FBS</td></tr><tr>L<td>-글루타민</td><td>GE Healthcare Life Sciences, 미국</td><td>SH30034.01</td><td>1% 농도</td></tr>는 <tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco, USA</td><td>15070-063</td><td>1% 농도</td></tr>는 <tr><td>Whatman Nuclepore 폴리카보네이트 Track-Etch를 사용했습니다.</td><td>Whatman, 미국</td><td>110409</td><td>멤브레인 (0.8 &마이크로; m)</td></tr><tr><td>IWR1</td><td>시그마, 미국</td><td>10161-5mg</td><td>100 &마이크로; M 농도</td></tr>는 <tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA)</td> <td>전자 현미경 과학, 미국</td><td>15710</td><td>16 % 재고, 4 %는 PBS에 사용됩니다. 독성 - 장갑을 착용하고 싱크대에 버릴 수 없습니다 </td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>214-20L PL</td><td>Absolute, milliQ 물로 25, 50 및 75%를 만듭니다.</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>2509-500ml</td> 매우 <td>점성이 있어</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, USA</td><td>T8787-50ml</td>를 <td>분배하는 동안 매우 점성이 있고 조심스럽게</td></tr><tr><td>Di-Sodium Hydrogen Phosphate</td><td>Thermo Scientific Fisher, USA</td><td>621-500mg</td><td>은 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Sodium Di-hydrogen Phosphate</td><td>Ajax Finechem, USA</td><td>4745-500g</td><td>다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Thermo Scientific Fisher, 미국</td><td>465-500g</td><td>은 다른 공급 업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Cytokeratin8 / Troma I</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB)</td> <td>TROMA-I</td><td>1 : 250 차단 완충액</td></tr><tr><td>활성 및 베타; 카테닌&nbsp;</td><td>세포 신호 기술,&nbsp; 미국</td><td>D13A1</td><td>1:200 차단 버퍼</td></tr><tr><td>인산-히스톤 3</td><td>Millipore, MA, USA</td><td>06-570</td><td>1:200 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa488 염소 안티-토끼 IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&nbsp; 미국</td><td>111-545-047</td><td>1:250 차단 버퍼</td></tr><tr><td>Alexa594 Goat anti-Rat IgG</td><td>Jackson ImmunoResearchLabs,&nbsp; 미국</td><td>112-585-072</td><td>1:250 차단 버퍼</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>242-500ml</td><td>는 다른 공급업체에서 구입할 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>n-프로필 갈레이트</td><td>Sigma, USA</td><td>2370-2</td><td></td></tr><tr><td>-(4-amidinophenyl)-1H -인돌-6-카르복사미딘 (DAPI)</td><td>Sigma, USA</td><td>D9564-10mg</td><td>핵산(DNA)</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td>를 염색하는 데 사용 <td>Thermo Fisher 사이언티픽, 미국</td><td>2225-500ml</td><td>솔벤트</td></tr><tr><td>커버 슬립 (24 x 50 mm)</td><td>Lomb Scientific</td><td></td> <td>CS24501GP-</td></tr></tbody></table>

오르간 문화와 마우스 wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Organ Culture and Whole Mount Immunofluorescence Staining of Mouse Wolffian Ducts

두발 형태 형성은 남성 생식 기관을 포함한 대부분의 포유 동물의 개발을위한 기본 요건이다. 부고환, 남성 생식 기관의 중요한 부분은 기억 정자 성숙 및 전송에 대한 책임이있다. 성인 부고환은 Wolffian 덕트 (WD)로 알려진 단순하고 직선 배아 전구체로부터 개발하는 높은 코일 튜브입니다. 고환에서 정자가 난자와 수정 할 수 없습니다로 부고환의 적절한 코일 링은 남성 불임 필수적이다. 그러나, 부고환 개발 및 권취를 담당하는 메카니즘은 부분적으로 전체 기관 배양 및 촬상 방법의 부족으로 불분명. 본 연구에서, 우리는 더 나은 다른 관형 기관을 연구하기 위해 적용될 수있다 WD의 권취 및 발전 과정을 시각화 관내 배양 시스템 및 전체 마운트 면역 형광 프로토콜을 설명한다.

개발하는 동안, WD는 단순한 직선 튜브는 매우 복잡하고 코일 덕트로 변환되는 것을 특징으로 상당한 변화를 겪는다. 전술 한 방법을 사용하여, WDS는 배양 조건에서 유사한 변화를 겪는다. 여기에서 우리는 3 일 (그림 3) 배양 WDS의 결과를 보여 주었다. WD의 형태 형성에 관여하는 분자 메커니즘을 해부 배양액 다른 신호 경로를 표적 억제제 및 활성제로 보충 될 수있다. 그림 3C 특정 억제제, IWR1 (10) 시그널링의 Wnt의 존재 문화의 3 일 후 WD를 uncoiled 보여줍니다. 화살표 (그림 3B) 코일과 코일 WD (그림 3C)의 억제에 Wnt 신호 결과의 억제를 나타내는 WDS (도 3a 및 C)를 uncoiled로 표시 한. 따라서,이 배양 시스템 (STABLE) 중 관련된 분자 메커니즘을 절개하는데 사용...

우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

Tubal morphogenesis is a fundamental requirement for the development of most mammalian organs, including the male reproductive system. The epididymis, an ...

이 장기 배양 및 전체 마운트 면역형광법의 전반적인 목표는 볼프관(Wolffian duct)의 나선형 형성 및 발달 과정을 더 잘 시각화하고 이해하는 것입니다. 이 방법은 장기의 형태, 구조 및 기능 발달에 관여하는 메커니즘에 관한 발생생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내 시스템을 모사하며, 틈새 인자(niche factors)가 결여된 세포 배양 연구보다 더 정확한 정보를 제공한다는 점입니다.수정 후 15일째 정오 이전에 임신한 마우스를 흡수성 티슈 페이퍼 위에 배측으로 눕히고, 복부의 배면을 70% ethanol로 분무합니다. 포셉을 사용하여 동물의 배면 하복부 피부를 들어 올리고, 외과용 가위로 비뇨생식기 구멍부터 갈비뼈까지 이어지는 측면 절개를 실시합니다. 자궁경부 바로 위쪽의 방광을 포셉으로 잡고, 자궁에 절개를 가합니다.방광을 잡은 상태에서 자궁광인대와 자궁-난관 접합부를 절개하여 자궁을 부속물 연결 부위에서 분리합니다. 자궁을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어 있는 50 milliliter 튜브에 넣고, 조직을 부드럽게 흔들어 과도한 혈액을 제거합니다. 세척한 자궁을 얼음 위에 놓인 신선하고 차가운 HBSS가 들어 있는 페트리 접시에 옮기고, 자궁벽을 절개하여 배아를 채취한 뒤, 채취하는 즉시 신선한 HBSS가 담긴 얼음 위의 새 페트리 접시에 넣습니다.새 접시에 에탄올을 적신 멸균 티슈 페이퍼를 깔고 그 위에 배아를 옆으로 눕혀 놓습니다. 그리고 멸균 칼날을 사용하여 동물의 하복부를 대각선으로 절개합니다. 멸균 스펀지 베이스 위에 배아의 척추 라인을 따라 핀으로 고정한 후, 해부용 실체 현미경 아래로 배아를 옮깁니다.복부 정중선을 따라 조심스럽게 절개한 후 간과 장을 제거합니다. 이제 비뇨생식계가 보일 것입니다. 요도 연결 부위에 가깝게 정관을 절개합니다.정소와 Wolffian duct를 수확하기 위해 gubernaculum에 부착된 Wolffian duct 하단부를 절개합니다. 수집된 조직은 즉시 얼음 위에 놓인 신선한 HBSS가 담긴 새로운 Petri dish에 넣습니다. 배아 생식선 융기(gonadal ridges)를 배양하려면, 먼저 24-well 세포 배양 플레이트의 각 well에 300 µL의 배지를 추가합니다.다음으로, 새로운 페트리 접시에 멸균된 HBSS를 한 방울 떨어뜨리고, 광택이 나는 면이 HBSS를 향하도록 하여 0.8 µm 폴리카보네이트 트랙 식각 막(poly carbonate track etch membrane)을 그 방울 위에 올립니다. 조직의 수분을 유지하기 위해 항상 HBSS 방울 위에 막을 배치하고, 막의 거친 면이 위를 향하게 합니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여, 조직들이 서로 닿지 않도록 두 개의 생식 능선(genital ridges)을 막의 거친 면 위에 올립니다.그리고 멸균 와이프로 과량의 HBSS를 제거합니다. 생식능선을 막으로 옮길 때, 포셉의 두 가지 사이에 샘플을 잡고, 옮긴 후에는 막에서 과량의 HBSS를 조심스럽게 제거하여 울프관의 낭성 성장을 방지하십시오. 그런 다음 막을 24-웰 플레이트의 한 웰에 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건의 공기-배지 계면(ear medium interface)에서 조직을 배양하며, 3일 동안 매일 전체 배지를 교체합니다.배양 4일 차가 되면, 펴져 있던 울프관(Wolffian ducts)은 매우 복잡하게 꼬인 관 형태로 변형됩니다. 전체 마운트 면역형광염색을 위해 조직을 고정하려면, 배양된 생식샘과 울프관이 있는 막을 얼음처럼 차가운 PBS가 담긴 새 페트리 접시에 옮깁니다. 막은 PBS 위에 뜰 것입니다.포셉 팁을 사용하여 막을 가라앉힙니다. 그리고 배양된 생식선 조직을 4% paraformaldehyde로 옮깁니다. 고정 후, 실온에서 완만하게 흔들어 주며 PBS 및 Triton X로 10분씩 3회 세척합니다.그 다음, 4°C에서 분당 30회 회전시키며 단계별 에탄올 시리즈로 10분씩 침전시켜 조직을 탈수합니다. 침전 단계 사이에서 샘플을 교체할 때는 탈수의 마지막 2분 동안 조직이 가라앉도록 둡니다. 그런 다음 조직에 닿지 않게 주의하며 알코올을 최대한 제거하고, 다음 단계의 더 높은 농도 에탄올을 첨가합니다.마지막 탈수 과정 후, 방금 시연한 대로 역방향 농도 구배의 에탄올 시리즈를 사용하여 조직을 재수화합니다. 그런 다음 Triton X가 포함된 PBS에서 실온으로 20분 동안 4회 세척합니다. 각 세척 시 분당 30회 회전시킵니다.실온에서 블로팅 버퍼를 사용하여 조직을 1시간 동안 블로킹한 후, 목적하는 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 분당 30회 회전하며 배양합니다. 다음 날, Tween이 포함된 PBS 및 무지방 우유 분말 용액으로 실온에서 30분씩 4회 세척하며, 각 세척 시 분당 30회 회전시킵니다. 마지막 세척 후, 조직을 적절한 2차 항체로 실온에서 1시간 동안 느리게 흔들어주며 빛이 차단된 상태로 라벨링합니다.그 다음, PBS-Tween 용액만으로 조직을 세 번 세척합니다. 그리고 면역형광 현미경으로 샘플을 분석합니다. 발달 과정 동안 Wolffian duct는 단순하고 곧은 관에서 매우 복잡하고 꼬인 관으로 변형되는 상당한 변화를 거칩니다.Wolffian duct 형태 형성(morphogenesis)에 관여하는 분자적 기전을 분석하기 위해, 배양액에 서로 다른 신호 전달 경로를 표적으로 하는 억제제와 활성제를 첨가할 수 있습니다. 예를 들어, 이 Wolffian duct는 특정 신호 억제제가 포함된 상태로 3일 동안 배양되었을 때 꼬임(coiling)이 일어나지 않았습니다. 이는 해당 경로가 꼬임 과정에 관여하고 있음을 보여줍니다.Wolff관의 전장 면역염색을 통해 cytokeratin-8의 발현, PH3 양성 증식 세포의 존재 및 3일간 배양된 조직을 확인할 수 있으며, 수정 후 18.5일째에 갓 분리하여 전장 고정한 조직에서 beta catenin의 발현을 확인할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 배아 하나당 약 5분에서 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 통해 배양 기관에 약물이나 호르몬을 처리함으로써, 이러한 제제들이 특정 생식선 조직에 미치는 직접적인 영향에 관한 추가적인 의문점을 해결하기 위한 테스트를 진행할 수 있습니다.이 절차를 수행할 때, 포셉으로 성선 능선을 직접 잡지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 기술이 개발된 이후, 발생 생물학 분야의 연구자들은 선천적 기형 및 생식 계통의 발달 이상과 관련된 기전을 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 성선 능선을 배양하고 전체 마운트 면역형광 염색을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 물질을 취급할 때는 항상 개인 보호 장구를 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

organ-culture-whole-mount-immunofluorescence-staining-mouse-wolffian

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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전체 마운트 면역형광 이미징: 온전한 오가노이드를 평가하기 위한 고정 및 염색 기법

향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

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이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

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생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

여기, 선물이 직렬 구분 없이 교양된 난소 젊은 쥐의 모 낭을 계량 하는 프로토콜. 전체 기관 면역 형광 및 조직 삭제를 사용 하 여, 실제 단면 광 단면으로 대체 됩니다. 샘플 준비 및 시각화의이 방법은 기관 무결성을 유지 하 고 특정 셀의 자동화 된 정량화를 용이 하 게.

전체 산 면역 형광 및 교양된 마우스 난소의 여 포 정량화

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식별, 조직학 특성화 및 체 외 3D 회전 타원 체 문화 모델에 대 한 마우스 전립선 돌출부의 해 부

마우스 전립선 오르가노이드는 분화를 조절하는 메커니즘을 평가하는 유망한 맥락을 나타낸다. 이 논문은 전립선 오르가노이드를 확립하기 위한 개선된 접근법을 설명하고, (1) 오르가노이드로부터 단백질 용해액을 수집하고, (2) 전체 마운트 공초점 현미경검사법에 대한 수정 및 얼룩 오르가노이드를 수집하는 방법을 소개합니다.

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여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

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암컷 마우스 요도 상피를 단일 세포 및 면역형광 분석을 위한 최적화된 방법

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정적 장기 문화를 사용하여 구개 퓨전 공부의 방법

배우세요 마우스 Wolffian 덕트의 오르간 문화 및 전체 마운트 면역 형광 염색법을 통해 기관 발달 과정을 시각화하고 이해하는 방법을. 이 기술은 생체 내 환경을 모방하여 정확한 발달 생물학 연구 결과를 제공합니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

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