Name: MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 배우세요 HDAC 억제제를 이용한 B세포 항체 클래스 스위치 및 플라즈마 세포 분화의 후성유전적 조절 메커니즘을 분석하는 방법을. 마우스 비장 세포 분리, 자기 분리법을 통한 B세포 정제, 그리고 고처리량 시퀀싱 기술을 활용하여 면역학 연구에 필수적인 유전자 발현 변화를 규명합니다.

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이 작품은 NIH 교부 금 AI 105813 및 인공 지능 079705 (PC)에 의해 지원 되었다, Lupus 연구 대상 식별 Lupus 그랜트 ALR 295955 (PC)에 대 한 얼라이언스와 관절염 국립 연구 재단 연구 부여 (HZ). TS는 의학 샌 안토니오 Xiangya UT 학교 학생 방문 프로그램의 맥락에서 소아과 의료 센터, 두 번째 Xiangya 병원, 중앙 남쪽 대학, 창사, 중국에 의해 지원 되었다.

프로토콜의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 샌안토니오에서 건강 과학 센터 택 사스 대학 동물 보호 지침을 따릅니다.
 1. 자극의 마우스 B 세포 CSR, 플라즈마 세포 분화 및 HDI 처리 <ol><li>비장 세포 현 탁 액의 준비 참고: 마우스를 제외 하 고 층 류 두건에 모든 단계를 수행 안락사와 해 부입니다.
	<ol><li>는 특정 병원 체 무료 C57BL/6J CO 2 흡입에 의해 (나이 8-12 주) 마우스 Euthanize.</li>
		<li>위 복 부와 해 보드에 마우스를 하다. 피하 주사 바늘 1.5-18-게이지, 마우스의 모든 4 개 피트를 핀.</li>
		<li>70% 에탄올에 젖은 잎사귀를 사용 하 여 피부를 소독.</li>
		<li>압력가 수술 도구 (집게와 해가 위) 바로 시각화 (간 바로 아래 복 부의 왼쪽)에 비장 하 흉 곽 아래 피부를 통해 잘라의 1 세트를 사용 하 여.</li>
		<li>다른 살 균 겸 자 사용 하 고 집게로 비장을 부드럽게 클램핑 및 해 부와 모든 연결 조직에서 절단 하 여 복 부의 더 큰 곡률 아래 거짓말 비장 추출 하가 위가 위. 모든 연결 조직을 제거 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브를 포함 하는 완전 한 RPMI1640 매체의 1000 µ L로 비장의 장소 (RPMI 1640 매체 보충 10% 열 비활성화 태아 종 아리 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 µ g/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 0.25 µ g/mL 암포 B, 및 50 µ M β-mercaptoethanol).</li>
		<li>50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 원심 분리기 튜브로 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 고 셀 여과기에 microcentrifuge 튜브에서 비장을 부 어. 15 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브의 끝을 사용 하 여 부드럽게 스 트 레 통해 비장을 매쉬. 완전 한 매체의 15 ~ 20 mL와 함께 셀 여과기 린스.</li>
		<li>5 분 및 삭제는 상쾌한 350 x g에서 셀 아래로 회전.</li>
		<li>비장 세포 정지에서 붉은 혈액 세포를 제거합니다. ACK 세포의 용 해 버퍼 (5 mL 당 비장)에 셀 펠 릿을 resuspend. 가끔 떨고와 실 온에서 4 분 동안 품 어 고 다음 완전 한 매체의 25 mL와 끄다.</li>
		<li>스핀 5 분 350 x g에서 셀 고는 상쾌한 삭제. 완전 한 매체의 1 또는 10 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀.</li>
	</ol></li> <li>B-세포 격리 참고: 부정적인 선택 다음 제조 업체에 의해 격리 B 셀 &#39; s 지시. 비-B 세포는 비 B 세포 (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1), 및 TER119)와 streptavidin 입히는 자석 입자에 대하여 지시 하는 biotinylated 항 체와 제거에 대 한 대상.
	<li>준비 1 x 10 8 셀/mL 살 균 5 mL (12 x 75 mm) 폴리스 티 렌에 완전 한 매체에서의 0.25 ~ 2 mL 세포 현 탁 액 <ol>라운드-하단 튜브. 샘플을 정상적인 쥐 혈 청 (50 µ L/mL)을 추가.</li>
		<li>추가 50 µ L/mL 격리 샘플을 칵테일. 부드럽게 pipetting으로 셀을 혼합 최대 아래로 2-3 시간 및 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>샘플에 75 µ L/mL streptavidin 입히는 자석 입자를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합물을 섞어 2-3 시간 실 온에서 2.5 분 동안 품 어와.</li>
		<li>완료 RPMI 1640 매체를 추가합니다. 부드럽게 위아래로 2-3 번 pipetting으로 세포를 혼합.</li>
		<li>자석에 (뚜껑) 없이 튜브를 놓고 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 손길이 닿지 않은 B 세포를 포함 하는 상쾌한에서 2.5 분 부에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
		<li>는 Hemocytometer 고 Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. B220 등 CD19 B 세포 표면 마커 흐름 cytometry 분석에 의해 B 세포의 순도 평가.</li>
	</ol></li> <li>B 세포 자극 및 HDI 치료 <ol><li>10 6 셀/mL x 0.3의 최종 농도에 완전 한 RPMI 1640 매체에 순화 B 셀 Resuspend.</li>
		<li>48-잘 셀 문화 접시를 사용 하 여 세포 배양에 대 한. 각 잘 순화 된 B-세포 현 탁 액 (0.3 x 10 6 셀/mL), 대장균, IL-4 (마지막 5 ng/mL 농도), 그리고 0에서 LPS (최종 농도 3 µ g/mL) 또는 500 µ M HDI (valproic 산; 1 mL을 추가 VPA).</li>
		<li>QRT-PCR 및 높은 처리량 mRNA와 미르 시퀀싱 분석을 위한 60 h 또는 흐름 cytometry 분석을 위한 96 h 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.</li>
	</ol></li> <li>CSR 및 플라즈마 세포 분화의 cytometry 분석 흐름 <ol><li>문화의 96 h 후 여러 번 위아래 세포를 pipetting으로 각 우물에서 셀 분리. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 벤치 가기 원심 분리기를 사용 하 여 5 분 동안 350 x g에서 셀 아래로 회전 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>HBSS 버퍼 1 %BSA 및 0.5 ng/mL fluorescein (FITC)-100 µ L 셀 resuspend - 마우스 IgM 항 체 (Ab) , 0.2 ng/mL allophycocyanin (APC) 안티 염소를 활용된-활용된 쥐 반대로 마우스 IgG1 단일 클로 널 Ab (mAb), 0.2 ng/mL phycoerythrin (PE)-쥐 반대로 마우스 B220 mAb, 0.2 ng/mL PE Cy7 활용 된 쥐 반대로 마우스 CD138 mAb, 및 2 ng/mL 7-aminoactinomycin 활용 된 D (7-AAD).</li>
		<li>셀 형광 활용 된 항 체 (단계 1.4.2) 30 분에 대 한 실 온에서 어둠에서을 품 어</li>
		<li>1 %BSA HBSS의 1 mL로 세포 세척.</li>
		<li>벤치탑 원심 분리기 및 삭제는 상쾌한 사용 하 여 5 분 동안 1500 x g에서 셀 아래로 회전.</li>
		<li>1 %BSA HBSS의 300 µ L 셀 resuspend 고 라운드-하단 폴리스 티 렌 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 빛에 노출을 피하기 위해 호 튜브 커버.</li>
		<li>수행 흐름 cytometry 분석 단일 셀 서 스 펜 션에. 각 보상 샘플 50000 이벤트와 다른 샘플에 대 한 250000 이벤트를 수집 합니다. 장비 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석.</li>
		<li>펄스 형상 게이트 (FSC-H FSC-A와 SSC-H SSC A x x)를 사용 하 여 파편과 남자를 제거 합니다. 적절 하 게 죽은 세포를 제외 하려면 7-AAD에 작 게이트.</li>
	</ol></li></ol> 2. 높은 처리량 mRNA-Seq 작은 RNA는 제조 업체에 따라 복구할 수 있는 총 RNA 격리 키트를 사용 하 여 2-4 × 10 6 셀에서 총 RNA를 추출 하는 문화의 <ol><li>후 60 h &#39; s 지시. DNase를 포함 나 치료 단계.</li>
	<li>는 bioanalyzer, 다음 제조 업체를 사용 하 여 RNA 무결성 확인 &#39; s 지침.</li>
	<li>사용 높은-품질 총 RNA의 500-1000 ng (RNA 무결성 번호 린 &#62; 8.0) RNA-seq에 대 한 상업적인 RNA와 라이브러리 준비 샘플 p다음 제조업체 담당자 키트 &#39; s 지침.</li>
	<li>는 어댑터의 그들의 각각 6-혈압 인덱스 부분에 따라 개별 mRNA-seq 라이브러리 수영장 및 50 bp/시퀀스에서 라이브러리 순서. 제조 업체에 따라 높은 처리량 DNA 시스템을 사용 하 여 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>시퀀싱 실행 후에 각 샘플의 fastq 파일을 생성 하는 CASAVA와 demultiplex. 읽기 매핑 및 이전 개요 11로 생물 정보학 분석 수행.</li>
	<li>는 TopHat2 기본 설정 14를 사용 하 여 그들의 참조 게놈 (UCSC 마우스 게놈 빌드 mm9)와 모든 시퀀싱 읽기 맞춥니다. 모든 샘플에서 유전자 당 수를 HTSeq-카운트를 사용 하 여 정렬에서 bam 파일을 처리.</li>
</ol> 3. 높은 처리량 미르-Seq <ol><li>사용 100 ng-1 µ g의 높은-품질 총 RNA에서 준비 단계 상업 작은 RNA-seq 키트를 사용 하 여 작은 RNA-seq 라이브러리 준비를 위한 2.1.</li>
	<li>Ligate 퇴 화 3 &#39; 5에 어댑터 &#8242; 상업 결 찰 키트와 함께 시작 작은 RNA 분자의 끝. 선 퇴 화 5 &#39; 3에 어댑터 &#8242; 상업 결 찰 키트와 함께 시작 작은 RNA 분자의 끝. 반전 녹음 방송으로 cDNA에 RNA를 변환 하 고 상업 키트와 PCR 증폭에 의해 작은 RNA-seq 라이브러리를 증폭.</li>
	<li>마지막 작은 RNA-seq 라이브러리를 분리 하는 6 %TBE 네이티브 페이지 젤을 사용 합니다. Bromophenol 염료 추적 블루 밴드 젤 (0.5-1 ㎝)의 하단에 가까워질 때까지 200 V에서 1 X TBE 버퍼와 젤을 실행.</li>
	<li>유리 접시에서 젤을 제거 하 고 2-3 분 젤 UV transilluminator 또는 다른 젤 문서 악기에 밴드 하는 시각화에 대 한 깨끗 한 용기에 ethidium 평범한 사람 (물에 0.5 µ g/mL)와 얼룩.</li>
	<li>잘라 깨끗 한 면도기를 사용 하 여 150 ~ bp 밴드 고 1.7 mL 튜브에 배치.</li>
	<li>제조업체 지침 당 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 추출.</li>
	<li>상업 고감도 DNA 분석 결과와 최종 도서관과 제조 업체 당 상업 dsDNA 분석 결과와 농도의 크기 분포를 확인 &#39; 지침.</li>
	<li>증폭 및 후속 시퀀싱 실행 제조 업체 당 상업 높 처리량 DNA 시퀀싱 시스템 라이브러리를 풀 &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>제조 업체 당 각 샘플에 대 한 fastq 파일을 생성 하는 CASAVA와 Demultiplex &#39; s 프로토콜.</li>
	<li>각 샘플의 작은 RNA-seq 분석을 사용 하 여 깜박임 제조 업체 당 작은 RNA 정렬에 대 한 &#39; s 프로토콜.
	<ol><li>RRNA, 뇌관, 미토 콘 드리 아, 같은 오염 물질에 정렬 되 고 읽기 제거.</li>
		<li>성숙 미르 시퀀스를 데이터 정렬.</li>
		<li>머리 핀 루프 시퀀스 (전조 미르)에 데이터를 정렬.</li>
		<li>맞춤 데이터를 다른 작은 RNA (fRNA 데이터베이스를 사용 하 여) 시퀀스 15.</li>
	</ol></li> <li>모든 샘플은 계량 후 다른 그룹/샘플 사이 차동 표현된 miRNAs 정의. 예측 대상으로 선택 된 mRNAs 또는 선택적 미르 TargetScan 16, 소 17, PicTar 등 온라인 miRNA 표적 예측 도구를 사용 하 여 대상이 될 수 있는 mRNAs miRNAs 18 .</li>
	<li>기능 주석 또는 통로 분석, 필요한 경우 제출 독창성 통로 분석 (IPA) 예측된 유전자 또는 데이비드.</li>
</ol> 4. MRNAs와 miRNAs의 양적 RT-PCR (qRT-PCR) <ol><li>mRNA의 qRT-PCR 분석 <ol><li>RNA 추출에서 0.2-5 × 10 6 셀 다음 작은 RNA를 복구할 수 있는 상업 총 RNA 격리 키트를 사용 하는 제조 업체 &#39; s 지시. DNase를 포함 나 치료 단계.</li>
		<li>올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여 첫번째 물가 cDNA 합성 시스템 총 RNA 로부터 cDNA를 합성.</li>
		<li>다음 프로토콜 실시간 PCR 마스터 믹스 x 2를 사용 하 여 적절 한 뇌관으로 qRT-PCR에 의해 cDNA를 계량: 95 ° C 15에 대 한 s, 10 94 ° C의 40 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 s.</li>
		<li>72 ° C 확장 단계 동안 데이터 수집을 수행 하 고 95 72에서 녹는 곡선 분석을 수행 ° c.</li>
	</ol></li> <li>miRNA의 qRT-PCR 분석 <ol><li>단계 4.1.1에서에서 준비 하는 샘플에서 Aliquot RNA.</li>
		<li>CDNA로 RNA 반전 녹음입니다. 제조 업체에 따라 상업 예측에 관한 반전 녹음 방송 키트를 사용 &#39; s 지침.</li>
		<li>250 nM 성숙한 미르 앞으로 뇌관으로 함께에서 범용 역 뇌관 SYBR 녹색 실시간 PCR 마스터 믹스를 사용 하 여 예측에 관한 실시간 PCR를 수행 합니다.
		실 온에서 <ol><li>재개 2 x PCR 주인 혼합, 미르 관련 앞으로 뇌관, 및 보편적인 반전 뇌관. 개별 솔루션을 혼합.</li>
			<li>준비 25 µ L 당 잘 반응 볼륨 (96-잘 PCR 번호판에 사용)에 대 한 반응 혼합으로 다음과 같습니다: PCR 마스터 믹스 12.5 µ L x 2 미르 전달 뇌관 (2.5 μ M) 2.5 µ L 유니버설 반전 뇌관 (2.5 μ M) 2.5 µ L RN ase 무료 water5 µ L</li> <li>96 잘 PCR 플레이트에 반응 혼합의 추가 22.5 μ. 개별 판 우물에 추가할 템플릿 cDNA (50 세-3 ng)의 2.5 µ L.</li>
			<li>단단히 접시 영화 인감. 1000 x g 및 실내 온도에서 1 분 동안 접시를 원심.</li>
			<li>실시간 cycler에 접시를 놓고 다음과 같은 순환 프로그램 시작: 5 분, 15 94 ° C의 40 주기 동안 95 ° C s, 55 ° C 30에 대 한 s, 및 72 ° C 30에 대 한 s.</li>
		</ol></li> <li>ΔΔCt 메서드를 사용 하 여 스프레드시트와 qRT-PCR 데이터 분석을 위해. 정상화 표현의 작은 핵/nucleolar RNAs Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68, 및 Snord70/SNORD70 관련 miRNAs의 표정.</li>
	</ol></li> <li>통계 분석 <ol><li>통계 분석 p 값으로 결합 하 고 학생 홀을 수행 &#39; s t- 스프레드시트를 사용 하 여 테스트 및 p 값 고려 &#60;로 0.05 상당한.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜 B 셀 클래스 스위칭 및 플라즈마 세포 분화; 유도에 포괄적인 접근을 제공 합니다. epigenetic 변조기, 즉 HDI;에 의해 그들의 영향을 분석 하 그리고이 세포에서 mRNA와 미르 식에 HDI의 효과 검색 합니다. 이러한 방법의 대부분은 또한 인간 B 세포 기능 및 mRNA/miRNA 표정에 epigenetic 요인의 영향을 분석 하 사용할 수 있습니다. QRT-PCR 및 mRNA-seq/미르-seq 접근 또한 HDIs 같은 후 변조기로 치료 하는 쥐에서 분리 하는 B 세포를 분석을 사용할 수 있습니다.
Epigenetic 조절 세포 증식, 생존, CSR 및 플라즈마 세포 분화에 영향을 미칠 수 있는 등 많은 다른 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 세포 증식, 생존, 그리고 HDI 치료 없이 B 세포의 세포 주기를 분석 합니다. HDI에 의해 mRNA와 미르 식 또는 qRT-PCR에 의해 다른 후 레 귤 레이 터의 변조를 분석 하기 위한 과제 중...

후 성적인 부호 또는 DNA 메 틸 화, 히스톤 posttranslational 수정, 및 비 코딩 RNAs (microRNAs 포함) 같은 요인 유전자 식1을 변경 하 여 세포 기능을 조절. 후 성적인 수정 B 림프 구 기능, 면역 글로불린 종류 스위치 DNA 재결합 (CSR), 신체적인 hypermutation (SHM), 및 메모리 B 세포 또는 플라스마 세포, 항 체 및 autoantibody 변조 함으로써 차별화 등 규제 응답2,3. CSR과 SHM 비판적으로 높은 T-종속 및 T-독립 항4B 세포에서 유도 된 활성화 유도 cytidine deaminase (원조, Aicda로 인코딩된), 필요 합니다. 클래스-전환/hypermutated B 셀 추가 1 (Blimp1, Prdm1로 인코딩된)5패션 비판적으로 유도 하는 B 림프 구 성숙 단백질에 의존에 항 체의 대량 분 비 플라즈마 세포로 분화. 탈 항 체/autoantibody 반응, 알레르기 반응 또는 면역1,4이어질 수 있는 B 세포에서 비정상적인 epigenetic 변화 될 수 있습니다. 어떻게 후 성적인 요소 이해, miRNAs, 같은 변조 B 세포 내장 유전자 발현은 백신 개발에 대 한 중요 한 뿐만 아니라 그러나 또한 잠재적인 비정상적인 항 체/autoantibody 응답의 메커니즘을 필수적 이다.
Histone acetylation와 deacetylation는 히스톤 단백질 히스톤 acetyltransferase (모자) 및 히스톤 deacetylase (HDAC)에 의해 일반적으로 촉매에 리 진 잔류물의 수정. 이러한 수정 chromatin의 증가 또는 감소 접근으로 이어질 더 허용 또는 녹음 방송 요인 또는 단백질의 바인딩을 DNA와 유전자 식이5,6, 의 변경 방지 7 , 8. HDAC 저 해제 (HDI)는 HDACs의 기능을 방해 하는 화합물의 클래스. 여기, 우리는 B 세포의 본질적인 유전자 식 프로필에와 그것의 메커니즘에 HDAC의 규제를 해결 하기 위해 HDI (VPA)를 사용.
miRNAs는 작은, 비 코딩 RNAs 약 18 ~ 22 뉴클레오티드 길이에서 여러 단계를 통해 생성 되는. miRNA 호스트 유전자 변하게 되 고 머리 핀 기본 microRNAs (pri-miRNAs)를 형성 한다. 그들은 선구자 miRNAs (pre-miRNAs)에 pri miRNAs는 더 처리는 세포질에 수출 된다. 마지막으로, 성숙 miRNAs는 사전 miRNAs의 분열을 통해 형성 된다. miRNAs는 3' 번역된의 영역 내에 그들의 표적 mRNAs6,7보완 시퀀스를 인식합니다. Post-transcriptional 입을 통해 miRNAs 확산, 감 별 법, apoptosis10,11같은 세포 활동을 조절. 여러 miRNAs 동일한 mRNA를 타겟팅 할 수 있기 때문에 하나 하나의 miRNA 잠재적으로 여러 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 개인의 가치와 miRNAs의 집단 효과 이해 하는 미르 식 프로필의 직접 보기 중요 하다. miRNAs B 세포 개발 및 주변 차별화로 B-세포 단계 특정 분화, 항 체 응답 및 면역1,,49에 포함 될 표시 되었습니다. 에 3' UTR Aicda 및 Prdm1의 여러 검증 또는 예측 진화론 보존된 사이트 miRNAs8여 대상이 될 수 있다.
히스톤 후 전사 수정 등 miRNAs, epigenetic 변조 유전자 식9의 셀 유형과 셀 단계-특정 규칙 패턴을 표시 합니다. 여기, miRNA 및 mRNA 표현, CSR, 그리고 플라즈마 세포 분화의 HDI 중재 변조를 정의 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 CSR 및 플라즈마 세포 분화;을 B 세포를 유도 대 한 프로토콜을 포함 HDI;와 B 세포를 치료에 대 한 qRT-PCR, 미르-seq, 및 mRNA seq10,11,12,,813miRNA 및 mRNA 표정 분석을 위한.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine (크기: 6 x 500mL; L-글루타민 포함)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 항생제 항진균 용액 100 mL</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>21008-952&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 스테인 0.04%</td><td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 버퍼&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line Counting Chamber</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 자석</td><td>줄기 세포 기술</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(캡 포함</td>) <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 B 세포 분리 키트</td><td>줄기 세포 기술</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>BD 바늘만 18 게이지 1.5 인치 짧은 베벨 100/박스&nbsp;</td><td>BD 바이오사이언스</td><td>&nbsp; </td><td></td>305199</tr><tr><td>PE/Cy7 안티-마우스 CD138 (Syndecan-1) 항체</td><td>BioLegend&nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 B220 항체</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse/human CD45R/B220 anti-mouse</td>, <td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Mouse APC-IgG1 200 &micro; g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 IgM 항체</td><td>Biolegend</td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스/인간 CD45R/B220 항체</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE 안티 인간/마우스 CD45R (B220) (RA3-6B2)</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민, 분획 V, 열 충격 처리&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (대장균 055:B5의 지질다당)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-4 (캐리어 프리)</td><td>BioLegend</td><td>574302 (크기: 10 ug)</td><td></td></tr><tr><td>발프로산 나트륨염</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Class II Type A2 Biosafety Cabinet</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>대용량 리치인 CO2 인큐베이터&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 디지털 제어 수조: 모델 205</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning CentriStar 15ml 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>1.7mL 마이크로튜브, 투명</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>고속 이지 리더 플라스틱 원심분리기 튜브 50ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>로터 6M</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>로터 6M.06</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>드러먼드 휴대용 Pipet-Aid XP 피펫 컨트롤러</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학적 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫 팁</td><td>Fisher</td><td>Scientific 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6 탁상용 원심분리기, 비냉장</td><td>Beckman Coulter</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>GH-3.8A 로터, 수평, ARIES 스마트 밸런스</td><td>Beckman Coulter</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R 탁상용 원심분리기, 냉장</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>TA-15-1.5 로터, 고정 각도</td><td>Beckman Coulter</td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific 아날로그 보텍스 믹서&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep kit</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름 (방부제/분자생물학으로서의 약 0.75% 에탄올)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-Free Dnase set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 분광광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III First-strand 합성 시스템 RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96-Well Semi-Skirted PCR 플레이트, 25 Fisher</td><td></td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 접착 씰</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ 광학 모듈</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>iCycler 섀시</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>광학 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 집속 초음파 발생기</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I for Illumina</td><td>벡크만 쿨터(Beckman Coulter</td><td>) A288267</td><td></td></tr><tr><td>cBot 클러스터 생성 스테이션</td><td>일루미나</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 게놈 시퀀서</td><td>일루미나</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA 라이브러리 준비 키트 v2</td><td>일루미나</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 소형 RNA 라이브러리 준비 키트</td><td>일루미나</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex 일루미나 소형 RNA 염기서열분석 키트 v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>애질런트</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

micrornas 받 클래스 스위치 dna 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 b 세포 유도에서 mrnas의 게놈 넓은 분석의 hdac 억제제 중재 변조

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

항 체 응답은 신체적인 hypermutation (SHM), 클래스-스위치 DNA 재결합 (CSR), 및 플라즈마 세포 분화를 포함 하 여 몇 가지 중요 한 B 세포-기본 프로세스를 통해 수행 됩니다. 최근 몇 년 동안, 후 성적인 수정 또는 히스톤 deacetylation 및 microRNAs (miRNAs) 같은 요인 보였다 epigenetic 요인의 부전으로 이어질 발견 되었습니다 동안 모양 항 체 반응, B-세포 유전 프로그램 상호 작용 autoantibody 응답입니다. Epigenetic 변조기에 B 세포에 게놈 넓은 miRNA 및 mRNA 표정 분석 하는 것이 B 세포 기능과 항 체 반응의 후 성적인 규정을 이해 하는 데 중요 합니다. CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 B 세포를 유도, 히스톤 deacetylase (HDAC) 억제제 (HDIs)와이 B 세포 치료 및 mRNA와 예측에 관한 식 분석 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 직접 보완 DNA (cDNA) 시퀀스를 사용 하 여 다음-세대 mRNA 시퀀싱 (mRNA-seq) 미르-seq 기술과 시퀀싱의 게놈, 그리고 양이 많은 반전 녹음 방송 (qRT)를 읽고 분석-PCR. 이러한 방법으로 우리는 정의 B 세포는 CSR 및 플라스마 세포 감 별 법을 유도, HDI, 후 레 귤 레이 터, 선택적으로 miRNA 및 mRNA 표정 변조 CSR 및 플라즈마 세포 분화를 변경.

LPS와 함께 배치 하는 B 세포를 정화 우리의 프로토콜을 사용 하 여 (3 µ g/mL) 및 IL-4 (5 ng/mL)에 96 h IgG1에 CSR의 30-40% 및 플라즈마 세포 분화의 ~ 10%를 일으킬 수 있다. HDI (500µM VPA) 치료, 후에 IgG1 CSR 감소 10-20%, 플라스마 세포 감 별 법 ~ 2%로 감소 하는 동안 (그림 1). CSR의 HDI 중재 금지 추가 후 재결합 Iμ Cγ1 및 성숙한 VHDJH의 감소 수에 의해 확인 되었다-완료 된 CSR의 Cγ1 증명서. QRT-PCR로 측정 된, CSR/SHM, Prdm1 및 Xbp1, 플라즈마 세포 차별화에 대 한 중요 한 중요 Aicda, 표현의 VPA (그림 2)에 의해 저해를 표시 했다.
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후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

본 실험의 전반적인 목표는 B 림프구가 항체 클래스 전환 및 형질 세포 분화를 거치도록 유도하고, B 세포 내 HDAC 억제제 mRNA 및 microRNA의 발현에 의한 조절 및 후성유전적 조절을 분석하는 것입니다. 이 방법은 면역글로불린 클래스 전환 및 형질 세포 분화의 후성유전적 조절과 같이 B 세포 항체 반응 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 B 세포 기능을 조절하고 후성유전적 조절 인자에 의한 microRNA 및 mRNA의 변화를 정의할 수 있는 간단한 방법을 제공한다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 특정 병원체 제거 C57BL6J 마우스를 안락사시키고 피부를 멸균한 후, 오토클레이브 멸균된 포셉과 해부 가위를 사용하여 갈비뼈 바로 아래의 피부를 절개하여 간 바로 아래 복부 왼쪽에 있는 비장을 시각화합니다. 비장을 조심스럽게 고정하고 연결된 모든 조직을 절단한 다음 장기를 적출합니다. 그 후 비장을 complete RPMI 1640 배지 1,000 µL가 들어 있는 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다.다음으로, 50 mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리 튜브에 70 µm 세포 여과기(cell strainer)를 삽입하고, 마이크로 원심분리 튜브에 담긴 비장을 세포 여과기 위에 붓습니다. 15 mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리 튜브의 끝부분을 사용하여 비장을 여과기 사이로 조심스럽게 으깹니다. 그 다음, 15~20 mL의 완전 배지를 사용하여 여과기를 헹굽니다.세포를 350 x G에서 5분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거합니다. 1 mL의 ACK 용해 완충액을 사용하여 세포 펠렛을 재부유시키고 1분 동안 배양합니다.그 다음 ACK 4 mL를 첨가하고, 가끔씩 흔들어주며 실온에서 4분 동안 추가로 배양하여 비장 현탁액에서 적혈구를 제거합니다. 이어서 완전 배지 25 mL를 첨가하여 용해 반응을 중지시킵니다. 세포를 350 x G에서 5분 동안 원심 분리합니다.상층액을 제거하고 1 mL의 완전 배지를 첨가하여 세포 펠릿을 재부유시킵니다. 그런 다음 혈구계수기를 사용하여 생존 세포 수를 측정합니다. 멸균된 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브에 완전 배지를 사용하여 1 x 10⁸ cells/mL 농도의 세포 현탁액 0.25~2 mL를 준비합니다.샘플에 정상 쥐 혈청을 추가합니다. 다음으로, 튜브에 밀리리터당 50 µL의 분리 칵테일을 추가합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

항원 노출에 따라 활성화된 B 세포의 subpopulations는 독특한 효과기 기능 항체 isotypes를 만들어 클래스 스위치 재조합 (CSR)으로 알려진 공정을 받고있다. 이 보고서에 제시된 프로토콜은 CSR을 유도하고 분석하는 방법을...

Murine B 세포를 정화에 유도 및 클래스 스위치 재조합 평가

이 프로토콜에서는 새로 합성되거나 초기 DNA와 관련된 단백질 및 히스톤 변형을 검사하는 새로운 BrdU-ChIP-Slot-Western 기술을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

현재 메서드 여러 기판의 UHPLC MS 분석에 의해 HeLa 세포에서 히스톤 deacetylases (HDAC)의 isoform 특정 억제제를 식별 하는 역할. 이것은 생활에서 HDAC1 및 HDAC6 활동을 반영 하기 위해 개발 된 항 체 없는 메서드를 단일 isoform 셀 무료 분석 달리 셀 환경.

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

여기, 우리는 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에서 수정 된 히스톤의 염색 질 immunoprecipitation에 대 한 프로토콜을 설명합니다. Immunoprecipitated DNA가 풍부 하 고 지역화의 게놈을 통해 히스톤 포스트 번역 상 수정 양이 많은 PCR 이후에 사용 됩니다.

히스톤 수정 Saccharomyces cerevisiae 에서 chromatin Immunoprecipitation (칩)

Chromatin 환경 규칙은 적절 한 유전자 발현에 필요한 필수적인 과정 이다. 우리가 chromatin 수정의 채용을 통해 유전자 발현을 제어 하기 위한 메서드를 설명 하는 여기, 유전자 및 가역 방식 기계.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

생체 외에서 B 세포 플라즈마 세포 차별화 모델을 보고 다단계 문화 시스템을 사용 하 여, 우리.

수명이 긴 플라즈마 세포에 인간의 정상적인 메모리 B 세포의 체 외 분화 모델

CBP/p300과 같은 히스톤 아세틸 트랜스퍼라제(HATs, 리신 아세틸 트랜스퍼라아제라고도 함)의 억제제는 암 치료에 대한 잠재적 치료법이다. 그러나 이러한 억제제의 유효성을 검사하기 위한 엄격한 방법이 필요합니다. 검증을 위한 3개의 시험관내 방법은 재조합 아세틸 전달을 가진 HAT 분석, 세포 배양에 있는 히스톤 아세틸화를 위한 면역blotting 및 ChIP-qPCR를 포함합니다.

히스톤 아세틸트랜스퍼효소 억제제 검증을 위한 아세서

여기서 우리는 체외 DC 분화에 대한 안정적인 녹다운 세포주를 얻기 위해 shRNA의 렌즈바이러스 트랜스듀션을 사용하여 수지상 세포(DC)의 개발에 관여하는 잠재적 전사 인자를 선별하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

대장포에이성 줄기및 전구세포주에서 짧은 헤어핀 RNA 중재 유전자 녹다운에 의한 수지상 세포 개발 연구

배우세요 HDAC 억제제를 이용한 B세포 항체 클래스 스위치 및 플라즈마 세포 분화의 후성유전적 조절 메커니즘을 분석하는 방법을. 마우스 비장 세포 분리, 자기 분리법을 통한 B세포 정제, 그리고 고처리량 시퀀싱 기술을 활용하여 면역학 연구에 필수적인 유전자 발현 변화를 규명합니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

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