Name: 레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 Legionella pneumophila 외막 소포(OMV) 표준 분리법 및 대식세포에 미치는 영향 분석 기법. 이 방법은 병원성 균주와 숙주 상호작용 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 TLR2으로 우리를 제공하기위한 교수 마르쿠스 Schnare 감사합니다 - / -과 TLR2 / 4 - / - 마우스 및 TRIF /에서 MyD88에 대한 교수 카슨 Kirschning - / - 마우스. 이 작품의 일부가 Bundesministerium 대 Bildung 놀이 Forschung에 의해 투자되었다 (예 : 바이오 miRSys을 - FKZ 0316175B, 전자 : 메드 CAPSYS - FKZ 01X1304E, http://www.bmbf.de/), 독일 연구 협회를 (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), 및 Hessisches Ministerium 대 Wissenschaft 싶게 미술 (LOEWE 의료 RNomics - FKZ 519 / 03 / 00.001- (0003) http://www.proloewe.de/medicalrnomics) 모든 BS합니다.

1. 중간 및 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 국물 매체 (YEB)의 1 L를 준비합니다. ACES 10 g을 증류수 900 ㎖의 효모 추출물 10g을 녹인다. KOH (5 N)과 6.9로 pH를 조정합니다. L 시스테인 및 Fe의 10 ㎖ (증류수 10ml에 0.4 g)의 10 mL를 넣고 (NO 3) 2 O 3 x9H (증류수 10ml에 0.25 g). 증류수 1 L까지 채우고 용액 (기공 크기 : 0.22 μm의) 살균 필터. 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 판 한천 버퍼 숯불 효모 추출물 (BCYE)를 준비합니다. ACES 10 g을 증류수 900 ㎖의 효모 추출물 10g을 녹인다. KOH (5 N)과 6.9로 pH를 조정합니다. 한천 15 g 및 활성탄 2.5 g을 추가합니다. 증류수와 오토 클레이브 1 L까지 입력합니다. <ol><li> 및 L- 시스테인 10ml의 추가 (10 ml의 증류수 0.4 g)의 10 ㎖의 Fe (NO 3) 2 O 3 x9H (증류수 10ml에 0.25 g, 여과에 의해 멸균 모두 0.22 ㎛의 관통냉각 BCYE (약 50 ° C)에 기공). 4 ° C에서 접시와 저장소를 따르십시오. </li></ol></li></ol> 2. L.의 뉴모 필라 육성 <ol><li> BCYE 아가 플레이트에 L. 뉴모 필라 변형 코비 (야생 형, WT)를 확산, 3 일 동안 37 ° C에서 그들을 품어. OD 예비 배양 플레이트에서 L.의 뉴모 필라 0.3의 600 YEB 10 mL를 접종; 6 시간 동안 회전 진탕 기 (150 RPM)에서 37 ° C에서 박테리아를 배양한다. </li><li> 혈액 한천 플레이트에 정지 100 μL을 확산하여 액체 문화의 순도를 확인합니다. 37 ℃에서 밤새 품어. </li><li> 신선한 YEB 매체의 90 mL의에 남아있는 액체 배양을 추가하고 약 16 ~ 20 시간을 취하는 OD 3.0-3.5의 600을, 도달하는 회전 진탕 기 (37 ° C와 150 RPM)에 품어. </li></ol> 3. 준비 및 L. 뉴모 필라 된 OMV 정량화 참고 : 다음 원심 분리 단계를 모두 수행합니다무균 조건에서 4 ° C에서의. <ol><li> 박테리아를 펠렛 20 분 동안 4,000 XG에서 액체 문화를 원심 분리기. 신선한 원심 분리기 튜브에 뜨는을 전송 세균 펠렛을 폐기하고, 원심 분리 (20 분 4,000 XG)를 반복합니다. 일단이 단계를 반복합니다. </li><li> 살균 필터 두번 뜨는 나머지 (기공 크기 : 0.22 μm의). 3 시간 동안 10 XG에 초원 심 분리기 튜브 및 초 원심 분리기에 박테리아가없는 뜨는을 전송합니다. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다하고 폐기합니다. 오염 LPS 단백질을 제거 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 초 원심 분리기 (3 시간 동안 100,000 XG)의 OMV 펠렛을 재현 탁. </li><li> 뜨는을 취소하고 멸균 PBS 500 μL의 OMV 펠렛을 재현 탁. μL 혈액 한천 플레이트에와 BCYE 한천 플레이트에 킬 (20)는 제조 된 소포의 세균 오염을 제외합니다. 37 3 일 (모두 밤새 혈액 한천 플레이트와 BCYE 한천 플레이트를 인큐베이션6; C). </li><li> 제조자의 지시에 따라 bicinchoninic 산 분석법을 사용 OMV 제제로부터 얻은 단백질 량을 정량. 참고 : 100 ㎖ L.의 뉴모 필라 문화의 농도는 일반적으로 1 μg의 / μL이다. -20 ° C에서 준비하고 정량화 된 OMV를 저장합니다. </li></ol> 4. 사전 치료 식세포 <ol><li> THP-1 세포를 준비합니다. 주 : THP-1 백혈병 환자로부터 유래 된 단핵구 세포주이다. <ol><li> 24 웰 당 2 × 5 THP-1 세포에 첨가하고 대 식세포와 같은 세포에 20 ㎚의 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA)를 추가하여 그들을 구분할. 37 ° C에서 24 시간 동안 품어. </li><li> 새로운 매체의 500 μL와 매체를 교체하고 또 다른 24 시간 동안 배양; THP-1 세포에 대한 최적 배지를 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 RPMI 1640 높은 글루코오스로 구성된다. </li></ol></li><li> 참조에서 설명 된 바와 같이, 뮤린 골수 유래 대 식세포 (mBMDM)를 격리20 줬어. </li><li> 된 OMV와 THP-1 유래 대 식세포 또는 mBMDM을 취급합니다. <ol><li> 단계 3에서 제조 된 OMV를 해동하고, 인간 또는 뮤린 대 식세포에 대한 이들 단백질 량 (0.1, 1 및 10 μg의 / ㎖)에 의한 추가. 적어도 20 시간 동안 37 ° C로 된 OMV와 대 식세포를 부화. ELISA의 상층 액을 사용하거나 5 단계로 이동합니다. </li></ol></li></ol> 5. 대 식세포를 감염 및 집락 형성 단위 (CFU) 분석과 세균 복제 평가 <ol><li> 단계 2.1에서 L.의 뉴모 필라를 사용 단계 4.3에서 THP-1 세포 또는 mBMDM을 사전 처리 및 컨트롤 (2 × 24분의 5 우물)로 대 식세포를 전처리하지. 매체를 교환하지 마십시오. </li><li> L. 뉴모 필라 코비의 플라 젤린-부족 돌연변이와 L. 뉴모 필라 코비 WT 및 mBMDM와 THP-1 세포를 감염 (모두 감염의 다양성 0.5 (MOI)와, 1 × 5 L.의 뉴모 필라 / 24 우물), 24 부화 48 시간 각각. 보 준비제 L. 뉴모 필라 코비 (WT 또는 플라 젤린-부족 돌연변이) 단계 2.1에 설명 된대로. </li><li> 를 Lyse은 사포닌의 첨가에 의해 그들의 배지에서 세포 (최종 농도 0.1 %)과 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 피펫으로 세균을 재현 탁하고, 반응 용기에 상기 현탁액을 전송. 멸균 PBS에서 미디어를 함유 L.의 뉴모 필라의 연속 희석을 준비합니다. </li><li> 킬 BCYE 아가 플레이트에 필요한 희석액 50 μL, 37 ℃에서 3 일간 배양한다. </li><li> 시각적으로 형성된 식민지를 계산합니다. CFU를 계산 <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" /> 전처리하지만 100 %로 설정된다 마크로파지를 감염되지하는 CFU 카운트 결과를 정규화한다. </li></ol>

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병원성 세균 및 표적 세포에서 이러한 막 소포 충격 된 OMV 현재 집중적으로 연구되고있다. 예를 들어, 클로스 트리 디움 퍼프 린 젠스가 된 OMV 식세포의 사이토 카인의 분비를 유도 - 유래, B 림프구 보렐리 burgdorferi에 발 된 OMV 활성화 및 헬리코박터 파이로리는 막 소포는 위 상피 세포 (21, 22), (23) 상에 작용할 수 -released 수있다. L.의 뉴모 필라, 비정형 폐렴의 심한 형태를 유도 할 수있는 세포 내 병원균은 또한 폐 상피 세포와 대 식세포 (16), (19)을 활성화 할 수 있습니다 된 OMV를 발표한다. 여기서는 폐렴 된 OMV의 잠재적 역할을 연구하는 배양액에서 L. 뉴모 된 OMV의 소규모 분리를위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 멸균 CONDIT에서 작동하는 것이 중요합니다이온 및 순수 L. 뉴모 필라를 얻기 위해 다른 세균으로부터의 오염을 배제하기는 OMV 준비 - 유래. 된 OMV의 분리 최대 된 OMV이 여과 공정에 의해 손실되기 때문에이 상기 OMV 수율을 감소시킨다하더라도, L. 뉴모 필라로 수득 OMV 펠릿의 오염을 방지하기 위해 0.22 ㎛의 세공을 통해 여과하는 단계를 포함한다. 또한, 우리는 더 밀접 된 OMV는 세포 외 박테리아 (15)에 의해 LCV 내부에 출시되는 레지오넬라 폐렴의 상황을 대략 그 고립 된 소포와 L.의 뉴모 필라에 감염된 세포에 인간과 쥐의 대 식세포의 반응을 테스트했다. 채용 된 OMV의 용량이 24 시간 배양 후 인간 대 식세포의 생체 외 감염에서 무료 OMV의 양에 따라 추정되었다 (참조 20에서 설명). 다른 수신자 세포의 자극이나 생체 내 실험에서,다른 OMV의 용량이 필요할 수 있습니다 설립해야합니다. L. 뉴모 된 OMV의 효과의 분석 및 예거 STEINERT (24)에 의해 기술 된 프로토콜의 발전을 나타낸다. 여기에, THP-1 세포에 의한 주 인간의 물질의 제한된 가용성 폐포 대 식세포에 대한 모델이 될 PMA 차별화. PMA의 첨가는 대 식세포 유사 세포 (25) 단핵구 THP-1 세포를 분화. 또한, 이들은 L. 뉴모위한 잘 알려진 모델 세포주 (26)을 연구한다. 이 인간 단핵 세포주 외에, mBMDM 세포가 사용됩니다. mBMDM 널리 L.의 뉴모 27, 28, 29의 효과에 대한 연구 허용됩니다. 다른 TLR에 다른 단백질 유전자 녹아웃 사용 가능성들을 OMV 효과를 연구하기위한 유용한 도구 만든다. ORD에서당 실험 쥐의 양을 낮추는 ER은 mBMDM 대신 식세포의 한계에 의한 폐포 대 식세포 사용된다. 주요 실험 검증을위한 폐포 대 식세포가 필요할 수 있습니다. 초 원심 분리의 본원에 기술 된 프로토콜 된 OMV를 정화 게다가, Chutkan 등에 의한 프로토콜에 포함되는 밀도 구배 원심 분리를 수행 할 수있다. 30. 이렇게 얻어진 OMV 제제의 순도를 향상 공동 정제 단백질 응집체, 편모 및 LPS의 양을 줄일 수있다. 얻어진 OMV 제제의 순도는 투과 전자 현미경에 의해 또는 품질 관리 부가 단계로 나노 입자 추적 분석에 의해 분석 될 수있다. 이것은 여기에 제시된 단백질 측정 절차 넘어 정량의 추가적인 수단을 제공 할 수있다. 선택적으로, LPS 농도가 물러의 amebocyte 파쇄 시험에 의해 분석 될 수있다. OMV 수율이 낮은 경우,원심 필터를 통해 추가 농축 단계는 여기에 완료되지 않은, 수행 될 수있다. 수율이 예상보다 낮았다하면 된 OMV는 폐기되었다. 된 OMV 뒤에 생물학적 메커니즘 및 기능을 규명하기위한 노력의 일환으로, OMV 생산에 다른 스트레스 조건의 영향을 시험 할 수있다. 영양 결핍은 유해 에이전트 배양 온도, 또는 노출의 변화는 OMV 분비 (31)에 영향을 미칠 수 있습니다. 가능한 스트레스 조건은 Klimentova 및 Stulik (32)에 의해 프로토콜에서 설명합니다. 또한, 하이퍼 또는 hypovesiculating L. 뉴모 변이체가 생성 될 수있다. 상이한 OMV 제제이어서, (참조 번호 17에 기재되어 있음), 인간 폐 조직 이식편, 또는 생체 내 모델에서 대 식세포 감염 실험에서 분석 될 수있다. 세균 통신에서의 영향 선천성 면역 신호에 된 OMV의 역할, 게다가실험적으로 해결 될 수있다. 또한, 다양한 선천성 면역 신호 전달 캐스케이드의 영향 뮤린 녹아웃 세포를 사용하는 인간 세포주 CRISPR / Cas9 녹아웃의 발생에 의해 분석 될 수있다. 된 OMV에이 기초 연구는 이미 나이 세리아의 meningitides (33)에 의해 전송 뇌막염 B 존재 새로운 백신 전략의 개발에 도움이 될 것입니다. OMV 분리 및 특성화의 프로토콜로부터 출발 한 다른 그람 음성균 및 다른 숙주 세포에이를 적용 할 수있다; 단지 액체 배양에서 세균의 성장을 조절할 필요가있다. Chutkan 등 알 발행 프로토콜. 대장균과 녹농균 (30)로부터 된 OMV의 생성에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 배양 용균 박테리아 오염의 증가 및 단백질 및 MEM을 피하기 위해 늦은 정지상 도달하지 않아야branes. 또한, 숙주 세포의 자극에 사용되는 OMV 도즈 여전히 독성의 낮은 속도를 유지하면서, 생체 내 감염 동안에 된 OMV 존재의 양에 따라 결정되어야한다. 이러한 방식으로 된 OMV의 병리학 적 역할은 잡종 통신 및 호스트 병원체 상호 작용에 미치는 영향을 조사 할 수있다. 또한 폐렴에 L. 뉴모 필라 된 OMV의 역할을 연구하기 위해, 충분한 수율과 비교 감염 실험과 표준화 된 OMV 준비가 필요하다. 이 프로토콜은 분리 절차를 표준화 및 기타 그람 음성균 및 다른 숙주 세포에 OMV 연구를 확장하는 데 도움이된다. 또한, 연구는 생체 내 실험 설정을 확장하는 데 사용할 수있는 시험 관내 기술에 대한 상세한 혜택 것이다. 앞으로,이 프로토콜은 혈청 또는 기관지 LAV 1 차 생물 재료 된 OMV의 분리로 확장 될 수있다나이 유체는 생리 학적 조건하에 발표 된 OMV의 구성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이것은 OMV 조성물의 주요 파라미터를 결정하기 위해 시험 관내 -generated 된 OMV의 특성을 이해하는 것이 도움이 될 것이다.

<html> 박테리아는 다른 메커니즘을 통해 하나 독성 인자를 분비 할 수있다. 공지 분비 시스템 외에도, 그람 음성균은 정보를 교환 할 수 있고, 작은 외막 소체 (OMV), 타원체 소체 10-300 nm의 직경과 이중 층의 막 구조를 통하여 독성 인자를 제공한다. 이들은 성장 환경 (액체 배양, 고체 배양하고, 바이오 필름)의 다양한 모든 성장 단계 (2, 3)에 분비되어있다. 된 OMV는 중요한 교통 수단 (예를 들어, OMV의 표면에서 발견되는 단백질 adhesins 독소 및 효소뿐만 아니라 대한 LPS 용) 4. 관내화물은 단백질 가수 분해로부터 보호 그래서 장거리 행동 할 수 있으며, 소포는 체액과 원격 장기 (5, 6)에서 찾을 수있다&quot;외부 참조&quot;&gt; (7, 8). 그들은 단지 인식 진핵 세포 (9), (10)에 의해 흡수되지만 또한, 이들은 숙주 세포 (4) 내로 박테리아 및 내습의 결합을 용이하게 할 수있는 할 수 없다. 레지오넬라 뉴모 필라 (L. 뉴모 필라)이 된 OMV를 분리 할 수있는 그램 음성 박테리아이다. 인간의 폐에서는 주로 자연 호스트 민물 아메바 (11)이더라도, 폐포 마크로파지를 감염. L.의 뉴모 필라 감염은 레지오넬라 증, 폐렴 (12)의 심한 형태가 발생할 수 있습니다. 숙주 세포에이 블록 phagosome - 리소좀의 융합. 복제 틈새 레지오넬라 함유 액포 (LCV)이, 13, 14이 형성되어있다 또한, 숙주 세포 기관을 모집. 리소좀 분해뿐만 아니라 이펙터 단백질 TRA에 의해 억제된다타입 IV 분비 시스템으로, 또한 된 OMV (15)의 릴리스 nslocation. 세균 배양 물로부터의 정제 된 OMV를받는 세포에 미치는 영향을 분석 할 필요가있다. L. 뉴모 된 OMV의 단백질 함량 및 폐포 상피 세포 16 만, 인간의 폐 조직 이식과 이후 연구에서 소포의 영향에 집중 이전 연구 L. 뉴모 된 OMV가 폐포 대 식세포 (17)에 의해 흡수되는 것을 보여 주었다. 된 OMV 본 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)와 다른 박테리아 항원, 그들은 진핵 세포의 감염에 영향을 호스트 (18) 면역 반응을 조절할 수있다. L. 뉴모 된 OMV 신속 또한 그들이 멤브레인 TLR2 활성화 (19), 숙주 세포의 막과 융합하고. 그것은 리스테리아 pneumoph 것으로 알려진 바와ILA 된 OMV가 염증성 방법 16 17 식세포 및 상피 세포를 자극하고, 우리는 인간 및 뮤린 대 식세포에 감염 과정에 대한 된 OMV의 영향을 분석 하였다. 여기서는 직접 또는 감염에 따라 차등 초 원심 분리에 의해 분비 된 OMV를 분리 및 진핵 숙주 세포의 소포체의 영향을 평가하기 위해 배양액에서 L. 뉴모 필라의 배양을위한 프로토콜을 기술한다.

<table><tbody><tr><td>10cm 페트리 접시</td><td>Sarstedt AG & Co KG (독일 뉘브레흐트)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter Incorporation (미국 캘리포니아)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG(독일 카를스루에)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>활성탄</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG(독일 카를스루에)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>한천, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (카를스루에, 독일)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>5% 양 혈액을 함유한 Columbia 한천</td><td>Becton Dickinson GmbH (하이델베르크, 독일)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>큐벳</td><td>Sarstedt AG & Co KG (독일 뉘엠브레흐트)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (인간)</td><td>BD OptEIA&trade;; Becton Dickinson GmbH (하이델베르크, 독일)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (murine)</td><td>DuoSet, R& D (미국 미니애폴리스)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (독일 카를스루에)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청 (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (독일 다름슈타트)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG(독일 브라운슈바이크)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific 독일 BV & Co KG (Braunschweig, Germany)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프&nbsp;</td><td>사르스테트 AG & Co KG (독일 뉘브레흐트)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (독일 카를스루에)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td><td>Antje Flieger 교수 (RKI, 독일 베를린)가 친절하게 제공함</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby &Delta; flaA</td><td>---</td><td>---</td><td>Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (독일 칼스루에)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mBMDM</td><td></td><td>------</td> <td>Markus Schnare 교수 (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) 및 Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlin, Germany)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>회전 쉐이커(MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 high glucose</td><td>Life Technologies GmbH (다름슈타트, 독일)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (독일 칼스루에)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (영국 케임브리지)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>멸균 필터 (기공 크기: 0.22 &마이크로; m)</td><td>Corning Incorporated (미국 뉴욕)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (독일 타우프키르헨)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>효모 추출물</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG(독일 카를스루에)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG(독일 브라운슈바이크)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

박테리아는 다양한 분비 시스템을 통해 다양한 분자를 분비할 수 있습니다. 그람 음성 박테리아는 분자가 세포 외 공간으로 또는 다른 세포로 직접 분비되는 것 외에도 외막 소포(OMV)를 형성할 수도 있습니다. 이러한 멤브레인 소포는 화물을 장거리로 운송할 수 있으며, 화물은 프로테아제와 뉴클레아제에 의해 분해되지 않도록 보호됩니다. 
레지오넬라 뉴모필라(L. pneumophila)는 심각한 형태의 폐렴을 유발하는 세포 내 그람 음성 병원체입니다. 인간의 경우 폐포 대식세포를 감염시켜 리소좀 분해를 차단하고 특수 복제 액포를 형성합니다. 또한 L. pneumophila는 다양한 성장 조건에서 OMV를 생성합니다. 인간 대식세포의 감염 과정에서 OMV의 역할을 이해하기 위해 우리는 액체 배양에서 박테리아 막 소포를 정제하기 위한 프로토콜을 설정했습니다. 이 방법은 차동 초원심분리를 기반으로 합니다. 농축된 OMV는 이후 단백질 및 지질다당류(LPS) 양과 관련하여 분석한 다음 인간 단핵구 세포주 또는 쥐 골수 유래 대식세포의 처리에 사용되었습니다. 이러한 세포의 전염증 반응은 효소 결합 면역흡착 분석법으로 분석되었습니다. 또한, 후속 감염의 변화를 분석했습니다. 이를 위해 대식세포에서 L. pneumophira의 박테리아 복제는 콜로니 형성 단위 분석법으로 연구되었습니다. 
여기에서는 초원심분리를 통해 액체 배양에서 L. pneumophila OMV를 정제하고 대식세포에 대한 전염증 가능성의 다운스트림 분석을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

실험 설치 L. 뉴모 된 OMV를 준비하고,도 1에 도시되어 감염 다음 식세포의 염증성 반응에 미치는 영향을 분석. 제조 된 OMV의 염증성 전위는도 2에 도시 PMA 분화 된 THP-1 세포를 분석 할 수있다. THP-1 세포는 IL-8 및 IL-6 분비의 시간 및 농도 의존적 ​​증가에 반응한다. 도 3의 CXCL1 ELISA에 의해 제시된 또한 L. 뉴모 OMV 인식에 다른 TLR에의 영향은 다른 유전 배경에서 mBMDM를 사용하여 분석 될 수있다. OMV 자극 후 CXCL1 분비 WT 생쥐에서 mBMDM 반면, mBMDM TLR2 / 4 - / - 훨씬 적게 분비. THP-1 대식 세포에서 세균 복제에 L. 뉴모 필라 된 OMV의 영향을 연구하기 위해, 세포 된 OMV와 미리 배양 한 후 추가로 감염L.의 뉴모 필라와 (그림 4 A). THP-1 유래의 대 식세포의 프리 - 자극에 먼저 감염 24 시간 후, 세균 복제를 감소하지만, 이후 시점 (48 시간 PI)에서 CFU 카운트의 두 배에 이르게. 도 4 B에 제시된 바와 같이 대 식세포의 감염 다음 OMV 인식 시그널링 수신자 같은 수용체 (TLR)의 영향은, mBMDM 의해 평가 될 수있다. 세포는 L.의 뉴모 필라 복제의 증가를 표시하지 않습니다 - / - - 그리고 TRIF /에서 MyD88 - / TLR2 동안 OMV 사전 배양 후 WT 동물에서 mBMDM의 열배에 의해 세균 복제 증가. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" /> 그림 1 : 실험 절차. (A) L. 뉴모 코비 WT 10-cm BCYE 한천 플레이트 신선한 YEB 90 ㎖ 중에 전송되는 작은 배양액 (10 ㎖)를 접종하는데 사용된다로부터6 시간 후 매체. 소량은 순도를 확인하기 위해 혈액 한천 플레이트 상에 플레이 팅된다. 박테리아는 초기 정지상 (= 3.0-3.5 OD 600)까지 37 ° C에서 배양한다. (B) 배양액을 원심 분리하고, 세균을 제거하기 위해 멸균 여과 하였다. 레지오넬라 -free 상등액을 다시 ultracentrifuged PBS에 재현 탁시키고되는 OMV 펠릿을 얻었다 ultracentrifuged된다. 격리 소체는 순도 확인, 재현 탁하고, 단백질 양을 정량한다. 스케일 바는 2.5 cm를 나타냅니다. (C) 인간이나 쥐의 대 식세포는 정량화 된 OMV로 자극한다. 세포 배양 상등액을 ELISA에 이용 될 수 있거나, 대 식세포는 10 cm BCYE 한천 플레이트 상 CFU 분석으로 세균 복제를 결정 L. 뉴모 필라에 감염 될 수있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </A&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" /> 그림 2 : L. 뉴모 필라 된 OMV에 의해 THP-1 세포의 염증성 활성화. (A) 여기에서, THP-1 단핵구 세포주 폐포 대 식세포에 대한 모델로서 사용된다. PMA 분화 된 THP-1 세포를 각각 24, 48 시간 동안 L. 뉴모 된 OMV (0.01-25 μg의 / ㎖)의 투여 량 증가와 함께 처리 하였다. 무 세포 상청액은 IL-8 ELISA에 사용 하였다. SEM ± 3 개의 독립적 인 실험의 평균 값이 표시됩니다. THP-1 세포는 시간과 용량 의존적이었다 중요한 IL-8 분비와 같은 작은 0.01 μg의 / mL의 L. 뉴모 필라 된 OMV에 반응했다. (B) L. 뉴모 된 OMV (0.1 μg의 / ㎖) PMA 분화 된 THP-1 세포를 자극하는 데 사용 하였다. 배양 상등액 24 및 48 시간 후에 수집하고, 방출 된 IL-6 ELISA를 통해 측정 하였다 상등액. SEM ± 3 개의 독립적 인 실험의 평균 값이 표시됩니다. 심지어 된 OMV의 최저 용량 (0.1 μg의 / ㎖)와 IL-6의 상당량 분비 THP-1 세포. IL-6의 분비는 OMV 투여 량 증가와 장시간 배양 시간 증가. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; * P &lt;해당 0 μg의 / mL의 OMV에 비해 0.05 ** p &lt;0.01. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" /> 그림 3 : 대 식세포의 염증성 활성화는 TLR2 / 4에 따라 달라집니다. WT에서 mBMDM과 TLR2 / 4 - / - 생쥐 L. 뉴모 된 OMV (0.1 μg의 1 / ㎖)와 함께 배양 하였다. CXCL1 분비는 각각 24 및 48 시간 후 ELISA에 의해 분석 하였다. 그만큼3 개의 독립적 인 실험의 SEM ± 평균 값이 표시됩니다. WT 마우스에서 mBMDM는 L. 뉴모 OMV 배양 후 용량 의존적 CXCL1 분비 반응. TLR2 / 4 - / - mBMDM는 WT mBMDM에 비해 훨씬 적은 CXCL1을 분비하고,이 분비 농도 의존적으로 증가하지 않았다. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; 해당 μg의 0 / ㎖ OMV와 비교하여 * P &lt;0.05; 이 #P &lt;0.05 똑같이 취급 WT 샘플을 비교 하였다. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" /> 그림 4 : 대 식세포에서 L. 뉴모 필라 OMV 사전 배양 증가 세균 복제. (A)는 차별화 된 THP-1 세포가 된 OMV (0.1, 1로 미리 배양 된 10 μ; g / ㎖) 또는 LPS / IFN-γ는 (200 NG는 / mL 씩) 이상이 제어 방치 하였다. 전 배양 (20 시간) 후, THP-1 세포를 각각 2, 24, 48 시간 동안 L. 뉴모 코비 WT (MOI 0.5)로 감염시켰다. THP-1 세포는 사포닌을 첨가하여 용해시키고, 세균은 BCYE 아가 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. CFUs 모든 시점 이후 0 μg의 / mL의 OMV에 대해 계산 하였다. 막대는 3 개의 독립적 인 실험, 기술 중복으로 수행 각각의 SEM ± 평균 값을 나타냅니다. 하지 미리 처리 된 세포에 비해 세균 흡수 (2 시간 후 감염 (PI))에 차이가 없었다. 세균 복제의 변화는 각각 24 및 48 시간 후에 측정 하였다. LPS / IFN-γ 전처리 된 THP-1 세포 이것도 L. 뉴모 OMV의 전처리 세포 농도 의존적 관찰 세균 부하 24 시간 PI의 감소를 보였다. 이후 시점 (48 시간 파이)에서, OMV 사전 처리 된 THP-1 세포는 L.의 뉴모 필라 다시의 두 배를 보여 주었다습곡, 반면 LPS / IFN-γ 전처리 식세포 박테리아 하중의 추가적인 감소를 보였다. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; * P &lt;해당 0 μg의 / mL의 OMV에 비해 0.05 ** p &lt;0.01. 20 시간 동안 0.1 μg의 / mL의 L. 뉴모 필라 된 OMV 사전 배양 한 다음 flagellin-에 감염되었다 (B) mBMDM 서로 다른 유전 적 배경을 가진 마우스 (WT, TLR2 - / -, 및 TRIF /에서 MyD88 - - /)에서 48 시간 동안 L. 뉴모 필라 코비 (MOI 0.5)의 결핍 돌연변이. mBMDM은 사포닌을 첨가하여 용해하고, 레지오넬라가 BCYE 아가 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. CFU는 실선으로, 0 μg의 / ㎖ OMV에 대하여 계산 하였다. 막대는 평균 값 ±± SEM 3 개의 독립적 인 실험, 중복으로 수행 각각의를 나타냅니다. WT 마우스에서 mBMDM는 OMV 전처리 후 L. 뉴모 복제의 증가를 보였다. TLR2 - / - 대 식세포는 상당히 감소 보였다 <emTRIF /에서 MyD88에 필적&gt; 레지오넬라 복제 - / - mBMDM. 통계 : 맨 - 휘트니 테스트; WT는 샘플에 비하여 p &lt;0.05. 참조 (20)로부터 허가 재판하는 것은 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서는 레지오넬라 뉴모 필라 (L. 뉴모) 액체 배양에서 외막 소체 (OMV)의 정제를 기술한다. 이러한 정제 소포 그들의 프로 - 염증 가능성을 분석하는 대 식세포의 치료에 사용된다.

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

본 연구의 전반적인 목표는 표준화된 방식으로 Legionella pneumophila로부터 외막 소포(Outer Membrane Vesicles, OMV)를 정제하고, 이것이 인간 및 생쥐 대식세포 내의 세균 복제에 미치는 영향을 분석하는 것입니다. 이 방법은 외막 소포 연구 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 표준화된 OMV 제조 절차는 호스트-병원체 상호작용에 미치는 영향을 연구하는 데 유용할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 Legionella pneumophila OMV가 인간 또는 생쥐 대식세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 표준화된 프로토콜을 제공한다는 것이며, 이를 통해 Legionella pneumophila의 병원성에 대한 이해를 높일 수 있다는 점입니다. 우리는 OMV가 염증 유발 가능성이 있다는 점과, Legionella가 호스트 세포 내부와 세포 외부 모두에서 OMV를 방출한다는 점이 감염 과정에 어떻게 영향을 미칠 수 있을지 고민하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻게 되었습니다. 실험 절차는 본 연구실의 테크니션인 Kerstin Hoffmann과 박사 후 연구원인 Analina Young이 시연할 예정입니다.먼저, 무균 조건 하에서 *L. pneumophila* strain core B를 BCYE 한천 배지에 도말하고 37°C에서 3일 동안 배양합니다. 예비 배양 플레이트의 *L. pneumophila*를 사용하여 OD600 0.3으로 10mL의 YEB 배지를 접종하고, 회전 진탕기를 이용하여 37°C에서 6시간 동안 박테리아를 배양합니다. 현탁액 100μL를 혈액 한천 배지에 도말하여 액체 배양물의 순도를 확인합니다.혈액 우무 배지를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 남은 액체 배양액을 90 mL의 신선한 YEB 배지에 추가하고, OD600 값이 3.0에서 3.5에 도달할 때까지 회전 진탕 배양기에서 배양합니다. 액체 배양액을 4,000 g에서 20분 동안 원심분리하여 박테리아 펠릿을 형성합니다.그 다음 상층액을 새로운 원심분리 튜브로 옮깁니다. 박테리아 펠릿은 폐기하고, 샘플을 다시 원심분리한 후 원심분리 단계를 한 번 더 반복합니다. 다음으로, 남은 상층액을 두 번 여과 멸균합니다.그 다음 박테리아가 제거된 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 100,000 g로 3시간 동안 원심분리합니다. 상층액을 따라내어 버립니다. 그런 다음 멸균 PBS를 사용하여 OMV 펠릿을 재현탁하고 하나로 모읍니다.오염된 단백질과 유리 LPS를 제거하기 위해 초원심분리 단계를 반복합니다. 이제 상층액을 버리고 멸균 면봉으로 초원심분리 튜브를 건조시킵니다. OMV 펠렛을 500 µL의 멸균 PBS로 재현탁합니다.그 다음, 준비된 소포의 박테리아 오염 여부를 배제하기 위해 혈액 한천 배지와 BCYE 한천 배지 각각에 20 µL씩 도말합니다. 혈액 한천 배지는 하룻밤 동안, BCYE 한천 배지는 3일 동안 배양합니다. 얻어진 OMV 조제물의 단백질 양을 정량하기 위해 제조사의 지침에 따라 BCYE 분석법을 사용하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 THP-1 세포를 대식세포로 분화시킨 후, 500 µL의 신선한 배지를 사용하여 분화 배지를 교체하고 37 °C에서 24시간 동안 더 배양합니다. THP-1 또는 마우스 BMDM 세포를 OMV로 처리하려면, 미리 준비한 OMV를 해동하여 적절한 양을 세포에 첨가합니다. 배지를 교체하지 않은 상태로, 야생형 L.pneumophila strain core B로 전처리 또는 미처리된 THP-1 세포를 감염시키거나, 이 균주의 편모 결핍 돌연변이체로 마우스 BMDM 세포를 감염시키기 위해 대식세포와 OMV를 37 °C에서 최소 20시간 동안 함께 배양합니다.MOI 0.5로 박테리아를 첨가하며, 이는 웰당 1 × 10⁵ L.pneumophila에 해당합니다. 배양물을 각각 24시간과 48시간 동안 배양합니다. 세포를 용해하기 위해 최종 농도가 0.1%가 되도록 saponin을 첨가하고 세포를 5분 동안 배양합니다.그 다음 피펫팅을 통해 용해된 대식세포를 재현탁하고 현탁액을 반응 용기에 옮깁니다. 멸균된 PBS를 사용하여 L.pneumophila 현탁액의 연속 희석액을 준비합니다. 그런 다음 필요한 희석액 50 µL를 BCYE 한천 배지에 도말하고 플레이트를 3일 동안 배양합니다.형성된 콜로니를 육안으로 계수하고 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행합니다. 본 실험에서는 L.pneumophila OMV의 염증 유발 가능성을 조사하였으며, PMA로 분화된 THP-1 세포는 IL-8 및 IL-6 분비가 시간 및 농도 의존적으로 증가하며 반응합니다. 여기서는 CXCL-1 ELISA 분석을 통해 서로 다른 유전적 배경을 가진 마우스 BMDM에서 L.pneumophila OMV 인식에 미치는 다양한 toll-like 수용체의 영향을 분석하였습니다.야생형 생쥐 유래 BMDM은 OMV 자극 후 CXCL-1을 분비한 반면, TLR2/4 이중 결손 생쥐 유래 BMDM은 분비량이 현저히 적었습니다. L.pneumophila OMV가 THP-1 대식세포 내 박테리아 복제에 미치는 영향을 연구하기 위해, 세포를 OMV와 20시간 동안 사전 배양한 후 L.pneumophila를 추가로 감염시켰습니다. THP-1 유래 대식세포의 사전 자극은 감염 24시간 후에 박테리아 복제를 농도 의존적으로 감소시켰으나, 더 나중의 시점에서는 CFU 수치가 두 배로 증가하는 결과로 이어졌습니다.본 실험에서 보여준 바와 같이, 마우스 BMDM을 OMV로 사전 자극하면 야생형 동물의 murine BMDM에서 CFU 수치가 10배 증가하는 결과가 나타나는 반면, TLR2 knockout 및 TRIF/MyD88 대식세포에서는 OMV 사전 배양 후 L.pneumophila 복제 시 이러한 증가가 나타나지 않습니다. 이 절차를 수행할 때는 멸균 조건 하에서 작업하고 정제된 OMV의 박테리아 오염 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 후속 분석에서 결정적인 결과를 얻을 수 없습니다.이 절차 이후, 어떤 Legionella 돌연변이가 OMVs를 더 많이 또는 더 적게 생성하는지와 같은 추가적인 질문에 답하거나, 서로 다른 스트레스 조건이 OMVs 분비에 미치는 영향을 조사하기 위해 나노입자 추적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 OMV 연구 분야의 연구자들이 in vitro 및 in vivo에서 OMVs가 숙주-병원체 상호작용에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 OMVs를 정제하는 방법과 이것이 이후의 대식세포 감염에 미치는 영향에 대한 분석을 시작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 프로토콜은 배양 및 성장 시간을 조절하여 다양한 그람 음성균과 그에 해당하는 호스트 세포에 적용할 수 있습니다. Legionella pneumophila는 인간에게 매우 전염성이 높으므로, Legionella를 취급하고 이 절차를 수행할 때는 항상 무균 작업대(sterile bench) 내에서 작업해야 함을 잊지 마십시오.

legionella-pneumophila-outer-membrane-vesicles-isolation-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서 그대로의 고립과 정화하는 방법을...

병원체 Vacuoles의 정제에서<em&gt; Legionella</em&gt; - 감염된 Phagocytes

출처: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila 외막 소포: 대식세포에 대한 전염증 가능성의 분리 및 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 박테리아 복제에 미치는 영향을 조사하기 위해 Legionella pneumophila 외막 소포(OMV)로 대식세포를 전처리하는 방법을 보여줍니다. 숙주 면역 신호를 변경함으로써 OMV는 대식세포를 감염에 더 쉽게 만듭니다. 처리되지 않은 세포에 비해 처리된 세포에서 더 높은 콜로니 수는 OMV가 대식세포 내부의 L. pneumophila 복제를 촉진한다는 것을 나타냅니다.

외막 소포로 전처리된 대식세포에서 Legionella pneumophila 복제 분석

출처: 융, A. L. 외 레지오넬라 폐기구 의 외막 소포: 대식세포에서의 염증 촉진 잠재력의 분리 및 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 순차적 원심분리, 멸균 여과, 초원심분리를 통해 레지오넬라 폐포 균으로부터 외막 소포(OMVs)를 분리하는 과정을 시연합니다. 정제된 OMVs는 막 단백질과 지다당류가 풍부하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 적합합니다.

레 지오넬라 기우모균 외막 소포의 초원심분리 기반 분리

이 비디오에서는 유세포 분석을 사용하여 배양된 대식세포의 in vitro 감염에 따라 세포 내 및 세포 외 병원성 박테리아인 Listeria monocytogenes를 정량화합니다.

In vitro에서 Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes의 유세포 분석

이 동영상은 면역형광을 통해 일차 대식세포에서 NOD-like receptor family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) 인플라마솜 형성을 연구하는 기술을 보여줍니다. 대식세포는 먼저 NLRP3 단백질 발현을 상향 조절하기 위해 박테리아 지질다당류(LPS)로 프라이밍됩니다. 대식세포를 칼륨 이오노포단인 니게리신(nigericin)에 노출시키면 NLRP3가 활성화되고 인플라마좀(inflammasome)이 형성되며, 이는 면역형광을 통해 시각화됩니다.

대식세포에서 인플라마솜 복합체 형성을 연구하기 위한 시험관 내 기술

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

왁스 나방 갤러리아 mellonella의 유충은 최근 레지오넬라 뉴모 감염을 연구하는 생체 내 모델로 설립되었습니다. 여기, 우리는 예방 접종, 세균 독성 및 복제의 측정뿐만 아니라 감염된 혈구 세포의 추출 및 분석을 포함하여 유충에서 레지오넬라 균의 발병을 특징 짓는 기본적인 기술을 보여줍니다.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

배우세요 Legionella pneumophila 외막 소포(OMV) 표준 분리법 및 대식세포에 미치는 영향 분석 기법. 이 방법은 병원성 균주와 숙주 상호작용 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

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