레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

이 연구의 전반적인 목표는 레지오넬라 뉴모필라의 외막 소포(OMV)를 표준화된 방식으로 정제하고 인간 및 쥐 대식세포의 박테리아 복제에 미치는 영향을 분석하는 것입니다. 이 방법은 외막 소포 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, OMV 준비를 위한 표준화된 절차는 숙주-병원체 상호 작용에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 레지오넬라 뉴모필라 OMV가 인간 또는 쥐 대식세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 표준화된 프로토콜을 제공하고 레지오넬라 뉴모필라 병원성에 대한 이해를 향상시킬 것이라는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 OMV의 가능한 전염증 가능성과 레지오넬라균이 숙주 세포 내부와 세포 밖에서 OMV를 방출할 때 감염 과정에 어떤 영향을 미칠 수 있는지에 대해 생각했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차는 제 연구실의 기술자인 Kerstin Hoffmann과 박사 후 연구원인 Analina Young이 시연할 것입니다.

먼저 멸균 상태에서 작업하는 동안 BCYE 한천 플레이트에 L.pneumophila 균주 코어 B를 펴고 섭씨 37도에서 3일 동안 배양합니다. 배양 전 플레이트의 L.pneumophila를 사용하여 0.3의 OD600에서 10ml의 YEB 배지를 접종하고 섭씨 37도의 회전 셰이커에서 6시간 동안 박테리아를 배양합니다. 혈액 한천 플레이트에 100마이크로리터의 현탁액을 펴서 액체 배양의 순도를 확인합니다.

혈액 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 남은 액체 배양액을 90ml의 신선한 YEB 배지에 추가하고 3.0에서 3.5의 OD600에 도달할 때까지 회전 셰이커에서 배양합니다. 박테리아를 펠릿으로 만들기 위하여 4, 000 g에 20 분 동안 액체 배양물을 원심 분리하십시오.

그런 다음 상층액을 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 박테리아 펠릿을 버리고 원심분리 단계를 한 번 더 반복하기 전에 샘플을 다시 원심분리하십시오. 다음으로 남은 상층액을 2회 필터 살균합니다.

그런 다음 박테리아가 없는 상등액을 초원심분리기 튜브로 옮기고 샘플을 100, 000g으로 섭씨 4도에서 3시간 동안 회전시킵니다. 상등액을 디캔팅하고 버리십시오. 그런 다음 멸균 PBS를 사용하여 OMV 펠릿을 재현탁하고 풀링합니다.

초원심분리 단계를 반복하여 오염 단백질과 유리 LPS를 제거합니다. 이제 상층액을 버리고 멸균 면봉으로 초원심분리기 튜브를 건조시킵니다. OMV 펠릿을 500마이크로리터의 멸균 PBS로 재현탁합니다.

그런 다음 혈액 한천과 BCYE 한천 플레이트에 각각 20마이크로리터를 줄무늬를 만들어 준비된 소포의 박테리아 오염을 배제합니다. 혈액 한천 플레이트를 밤새 배양하고 BCYE 한천 플레이트를 3일 동안 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 BCYE 분석을 사용하여 얻어진 OMV 제제에 대한 단백질의 양을 정량화합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 THP-1 세포를 대식세포로 분화한 후 500마이크로리터의 새로운 배지를 사용하여 분화 배지를 대체하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 더 배양합니다. THP-1 또는 쥐 BMDM 세포를 OMV로 처리하려면 이전에 준비한 OMV를 해동하고 세포에 적절한 양을 첨가합니다. 대식세포를 섭씨 37도에서 최소 20시간 동안 배양하여 전처리 또는 처리되지 않은 THP-1 세포를 야생형 L.pneumophila strain core B 또는 murine BMDM 세포를 이 균주의 편모가 결핍된 돌연변이로 감염시킵니다.

웰당 5번째 L.pneumophila에 1 곱하기 10에 해당하는 0.5의 MOI로 박테리아를 추가합니다. 배양물을 각각 24시간과 48시간 동안 배양합니다. 세포를 용해하려면 최종 농도 0.1%에서 사포닌을 첨가하고 5분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 피펫팅으로 용해된 대식세포를 재현탁시키고 현탁액을 반응 용기로 옮깁니다. 멸균 PBS를 사용하여 L.pneumophila 현탁액의 연속 희석을 준비합니다. 그런 다음 BCYE 한천 플레이트에 필요한 희석액 50 마이크로 리터를 줄무늬로 만들고 플레이트를 3 일 동안 배양합니다.

형성된 군체를 눈으로 시각적으로 세고 텍스트 프로토콜에 따라 계산을 수행합니다. 이 실험에서 L.pneumophila OMV의 전염증 가능성을 조사한 결과, PMA 분화된 THP-1 세포는 IL-8 및 IL-6 분비의 시간 및 용량 의존적 증가로 반응합니다. 여기서, CXCL-1 ELISA 분석을 사용하여 서로 다른 유전적 배경을 가진 쥐 BMDM에서 L.pneumophila OMV 인식에 대한 다양한 톨 유사 수용체의 영향을 분석했습니다.

야생형 마우스의 쥐 BMDM은 OMV 자극 후 CXCL-1을 분비한 반면, TLR2/4 이중 녹아웃에서 나온 쥐 BMDM은 현저히 적은 분비를 보였습니다. THP-1 대식세포의 박테리아 복제에 대한 L.pneumophila OMV의 영향을 연구하기 위해 세포를 20시간 동안 OMV로 사전 배양한 다음 L.pneumophila에 추가로 감염시켰습니다. THP-1 유래 대식세포의 사전 자극은 먼저 감염 24시간 후에 박테리아 복제 용량을 의존적으로 감소시키는 반면 나중 시점에서 CFU 수를 두 배로 증가시킵니다.

이 실험에서 볼 수 있듯이, OMV로 쥐 BMDM을 사전 자극하면 야생형 동물의 쥐 BMDM에서 CFU 수가 10배 증가하는 반면, TLR2 knockout 및 TRIF/MyD88 대식세포에서는 OMV 사전 배양 후 L.pneumophila 복제가 증가하지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 멸균 조건에서 작업하고 정제된 OMV의 박테리아 오염을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 다운스트림 분석에서 결정적인 결과를 얻을 수 없습니다.

이 절차에 따라 어떤 레지오넬라 돌연변이가 더 많거나 더 적은 OMV를 생성하는지와 같은 추가 질문에 답하거나 OMV 분비에 대한 다양한 스트레스 조건의 영향을 조사하기 위해 나노 입자 추적 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 OMV 연구 분야의 연구자들이 OMV가 체외 및 생체 내에서 숙주-병원체 상호 작용에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 OMV를 정제하는 방법과 대식세포의 후속 감염에 대한 OMV의 영향을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그런 다음 이 프로토콜은 배양 및 성장 시간을 조정한 후 다른 그람 음성 박테리아와 각각의 숙주 세포에 적용할 수 있습니다. 레지오넬라 뉴모필라균에 대한 작업은 인간에게 매우 전염될 수 있으므로 레지오넬라균을 취급하고 이 절차를 수행하는 동안 항상 멸균 벤치에서 작업을 수행해야 한다는 것을 잊지 마십시오.