마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한

본 실험 절차의 전반적인 목적은 체외 탈락막화(decidualization) 연구를 위한 공동 배양을 위해 마우스의 일차 자궁내막 기질 세포 및 상피 세포를 분리하고 배양하는 것입니다. 이 방법은 탈락막화 및 영양막 세포 침습과 같은 중요한 과정 동안 상피 세포와 기질 세포 사이의 파라크라인 신호 전달(paracrine signaling)은 무엇이며, 이러한 신호 전달 경로가 어떻게 조절되는지와 같은 생식 의학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술은 상피 및 기질 세포 공동 배양 시스템에서 탈락막화 과정을 연구하는 데 활용될 수 있습니다.

이 시스템을 사용하여 두 세포 중 하나에서 분비되는 신호 분자가 이 과정에 영향을 줄 수 있는지 평가할 수 있습니다. 자궁을 채취하기 전, 질 도말 검사를 수행하여 동물의 주기 단계를 확인하십시오. 이는 발정기에 있는 마우스만을 선택하기 위함입니다.

질 세척액에서 각막 상피 세포가 관찰되는 것으로 특징지어집니다. 다음으로, 포셉과 가위를 사용하여 첫 번째 발정기 동물의 복부를 절개하고, 양측 자궁각을 시각화하기 위해 장을 옆으로 젖힙니다. 난관 아래의 자궁각 가장 원위단 부위를 잡고, 해부용 포셉과 Dumont 5번 포셉을 사용하여 지방 및 결합 조직을 제거하면서 난관으로부터 자궁 조직을 박리합니다.

그다음, 자궁체 상단의 원위단에서 자궁각을 제거합니다. 제거한 자궁각은 3 mL의 HBSS가 담긴 35 mm 페트리 접시에 넣습니다. 모든 자궁각을 수집한 후, 접시를 실체현미경 아래로 옮기고 포셉을 사용하여 잔여 지방 및 결합 조직을 제거합니다.

그 후, Dumont 5번 포셉, 해부용 포셉 및 소형 스프링 가위를 사용하여 자궁각을 세로로 절개하여 내강을 노출시키고, 신선한 HBSS가 담긴 새 페트리 접시에서 조직을 헹굽니다. 이제 모든 자궁각을 pancreatin과 trypsin이 들어 있는 15 milliliter 튜브로 옮깁니다. 그리고 조직을 4 °C에서 60분 동안 50 rpm의 궤도 쉐이커 위에서 수평으로 배양합니다.

1시간이 지나면 튜브를 벤치로 옮겨 흔들지 않은 상태로 45분 동안 수평 배양하고, 이어서 37 °C 항온수조에서 흔들지 않은 상태로 15분 동안 수평 배양합니다. 항온수조 배양이 끝나면 상층액을 조심스럽게 따라내고, 트립신 활성을 불활성화하기 위해 자궁을 차가운 마우스 자궁내막 상피세포 배지가 담긴 페트리 접시에 5분 동안 옮겨 둡니다. 다음으로, 조직을 차가운 HBSS 3 mL가 들어 있는 15 mL 튜브로 옮기고, 10초 동안 볼텍싱하여 상피 시트를 분리합니다.

그런 다음, 3 mL의 신선한 HBSS가 담긴 새로운 페트리 접시에서 자궁을 헹구고, 앞서 시연한 것과 같이 두 개의 새로운 15 mL 튜브에 상피 세포 시트 현탁액을 두 번 더 수집합니다. 세 번째 조직 볼텍싱 후, 자궁을 마우스 자궁내막 기질 세포 소화 혼합액이 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 옮겨 37 °C, 200 rpm에서 30분 동안 배양합니다. 세 가지 세포 현탁액을 100 µm 나일론 메쉬에 조심스럽게 피펫팅하여 조직 잔해를 제거함으로써 상피 세포 시트를 회수하고, 이어서 얻어진 세포 현탁액을 원심 분리합니다.

펠렛을 12 milliliters의 마우스 자궁내막 상피세포 배지에 넣고 충분히 혼합하여 재현탁한 후, 중력에 의해 남은 마우스 자궁내막 기질세포가 분리되도록 5분 동안 그대로 둡니다. 침강이 완료되면 5 milliliter 피펫을 사용하여 상층액의 위쪽 2 milliliters를 조심스럽게 제거하고, 수집된 세포를 원심분리합니다. 그런 다음, 마우스 상피세포 펠렛을 상피세포 배지로 완만하게 피펫팅하여 재현탁합니다.

그리고 계획된 하위 분석에 적합한 밀도로 콜라겐 코팅된 커버슬립에 세포를 플레이팅합니다. 상피세포 분리가 완료되면 기질세포 단계로 넘어가며, 인큐베이터에서 자궁이 들어있는 마우스 기질세포 소화 튜브를 꺼냅니다. 방금 보여드린 것처럼 30분간 인큐베이션한 후, 튜브를 손으로 10초 동안 가볍게 흔들어 자궁을 3 mL의 4 °C HBSS가 담긴 페트리 접시로 옮깁니다.

조직을 충분히 헹군 다음, 트립신 활성을 억제하기 위해 소화 튜브에 기질 세포 배지 3 mL를 첨가하고, 자궁을 3 mL의 신선한 마우스 자궁내막 기질 세포 배지가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직이 든 튜브를 10초 동안 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음, 자궁을 차가운 HBSS가 담긴 디쉬로 옮겼다가, 다시 새로운 기질 세포 배지가 들어 있는 15 mL 튜브로 옮깁니다.

세 번째 조직 세척과 전이를 마친 후, 자궁 조직을 신선한 마우스 자궁내막 기질세포 소화 혼합액에 넣고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 소화가 끝나면, 1번에서 3번 튜브 및 트립신 튜브의 세포 현탁액을 40 µm 나일론 메쉬에 통과시키고, 메쉬를 5 mL의 마우스 자궁내막 기질세포 배지로 추가 세척합니다. 그 후, 원심분리를 통해 세포를 수집합니다.

그 후 펠릿을 신선한 마우스 자궁내막 기질세포 배지로 재현탁하여, 계획된 하위 분석에 적합한 밀도로 폴리라이신 코팅 커버스립에 도말합니다. 일차 세포 배양의 순도는 vimentin과 cytokeratin 발현의 차이로 평가할 수 있는데, vimentin 수치는 마우스 자궁내막 기질세포에서 높고 마우스 자궁내막 상피세포에서는 낮게 나타납니다. 반면 cytokeratin 수치는 마우스 자궁내막 상피세포에서 높고 마우스 자궁내막 기질세포에서는 낮게 나타납니다.

mentin/cytokeratin 이중 염색은 기질 세포의 mentin 발현과 상피 세포의 독점적인 cytokaratin 발현을 추가적으로 보여줍니다. cyclic adenosine monophosphate 및 MPA 처리를 통한 기질 세포 배양의 탈락막화 유도는, 대조군 기질 세포 배양과 비교하여 5일간의 처리 후 prolactin MRNA 수준이 급격히 증가함을 나타냅니다. 세포 배양 인서트 내부에서 상피 세포를 시각화하기 어렵기 때문에, 5일간의 탈락막화 시뮬레이션 직후에 생존력 분석을 수행할 수 있으며, 색상이 파란색에서 밝은 분홍색으로 변하는 것은 생존 가능한 상피 세포가 존재함을 의미합니다.

이 기법 이후, 배반포가 존재하는 상태에서 상피세포에 의해 분비되는 인자들이 기질세포의 탈락막화를 유도할 수 있는지 평가하기 위해 배반포 부착 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.