마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한 체외 탈락

이 절차의 전반적인 목표는 체외 탈이중화(in vitro decidualization) 연구를 위해 1차 마우스 자궁내막, 기질 및 상피 세포를 분리하고 배양하여 공동 배양하는 것입니다. 이 방법은 탈이중화(decidualization) 및 영양막 침습(trophoblast invasion)과 같은 중요한 과정에서 상피 세포와 기질 세포 사이의 부분비 신호는 무엇인지, 이 신호 전달 경로는 어떻게 조절되는지와 같은 생식 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술은 상피 및 기질 공동 배양 시스템에서 탈이중화(decidualization) 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 시스템을 사용하면 두 세포 중 하나에서 분비되는 신호 분자가 이 과정에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다. 자궁을 적출하기 전에 질 도말 검사를 실시하여 동물의 주기 단계를 확인합니다. 발정 단계에 있는 마우스만 선택합니다.

질 세척에 각막 상피 세포가 존재하는 것이 특징입니다. 그런 다음 집게와 가위를 사용하여 첫 번째 발정 동물의 복부를 열고 장을 옆으로 반사하여 양쪽 자궁 뿔을 시각화합니다. 나팔관 아래의 가장 말단부에 있는 뿔 하나를 잡고 해부 겸자를 사용하여 나팔관에서 자궁 조직을 해부하고 Dumont 5번 집게를 사용하여 지방 조직과 결합 조직을 제거합니다.

그런 다음 자궁 몸체 위의 말단 끝에 있는 뿔을 제거합니다. 자궁 뿔을 제거한 후 HBSS 3ml가 든 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 자궁 뿔을 모두 채취하면 실체 현미경으로 접시를 옮기고 집게를 사용하여 남아 있는 지방 및 결합 조직을 제거합니다.

그런 다음 Dumont 5번 집게, 해부 집게 및 작은 스프링 가위를 사용하여 자궁 뿔을 세로로 열어 내강을 노출시키고 신선한 HBSS가 들어 있는 새 페트리 접시에서 조직을 헹굽니다. 이제 모든 뿔을 판크레아틴과 트립신이 들어 있는 15ml 튜브로 옮깁니다. 그리고 조직을 섭씨 4도에서 60분, 궤도 셰이커에서 50rpm으로 수평으로 배양합니다.

한 시간이 끝나면 튜브를 벤치로 옮겨 흔들림 없이 45분 동안 수평 배양한 다음 섭씨 37도의 수조에서 흔들림 없이 15분 동안 수평 배양합니다. 수조 배양이 끝나면 상층액을 조심스럽게 디캔터하고 자궁을 차가운 쥐 자궁내막 상피 세포 배지가 들어 있는 페트리 접시에 5분 동안 옮겨 트립신 활성을 비활성화합니다. 다음으로, 3ml의 차가운 HBSS가 들어 있는 15ml 튜브로 조직을 옮기고 10초 동안 조직을 소용돌이하여 상피 시트를 분리합니다.

그런 다음 3ml의 신선한 HBSS가 들어 있는 새 페트리 접시에서 자궁을 헹구고 방금 시연한 대로 두 개의 새로운 15ml 튜브에 두 개의 상피 시트 현탁액을 더 수집합니다. 세 번째 조직 와류 후 자궁을 마우스 자궁내막 기질 세포 소화 혼합물이 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 옮겨 섭씨 37도 및 200rpm에서 30분 배양합니다. 100미크론 나일론 메쉬를 통해 3개의 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하여 조직 파편을 제거한 다음 생성된 세포의 현탁액을 원심분리하여 상피 시트를 복구합니다.

펠릿을 12ml의 마우스 자궁내막 상피 세포 배지에 철저히 혼합하여 다시 현탁시킨 다음 용액을 5분 동안 가라앉혀 나머지 마우스 자궁내막 기질 세포를 중력에 의해 분리합니다. 침전이 끝나면 5 밀리리터 피펫을 사용하여 상층액의 위쪽 2 밀리리터를 조심스럽게 제거하고 수집 된 세포를 원심 분리합니다. 그런 다음 부드러운 피펫팅으로 상피 배지에 마우스 상피 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

그리고 계획된 다운스트림 분석을 위해 적절한 밀도로 콜라겐이 코팅된 커버 슬립에 세포를 플레이트합니다. 상피 세포 분리 후 기질 세포를 계속 사용하고 인큐베이터에서 자궁과 함께 마우스 기질 세포 소화관을 제거합니다. 30분 배양 후 방금 시연한 것처럼 10초 동안 손으로 튜브를 부드럽게 흔든 다음 자궁을 4도 섭씨 HBSS 3밀리리터가 들어 있는 페트리 접시에 이식합니다.

조직을 잘 헹구고, 3ml의 기질 세포 배지를 소화관에 첨가하여 트립신 활성을 비활성화하고, 3ml의 신선한 마우스 자궁내막 기질 세포 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 자궁을 옮깁니다. 조직 튜브를 10초 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 자궁을 차가운 HBSS 접시로 옮긴 다음 새로운 15ml 튜브의 기질 세포 배지로 옮깁니다.

세 번째 조직 헹굼 및 이식 후, 신선한 마우스 자궁 내막 기질 세포 소화 혼합물에서 자궁 조직을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 분해가 끝나면 튜브 1에서 3으로 세포 현탁액을 통과시키고 트립신 튜브를 40미크론 나일론 메쉬에 통과시키고 추가로 5ml의 마우스 자궁내막 기질 세포 배지로 메쉬를 헹굽니다. 그런 다음 원심분리로 세포를 수집합니다.

그리고 계획된 다운스트림 분석을 위해 적절한 밀도로 폴리리신으로 코팅된 커버 슬립에 도금하기 위해 신선한 마우스 자궁내막 기질 세포 배지에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 일차 세포 배양의 순도는 비멘틴과 사이토케라틴 발현의 차이로 평가할 수 있는데, 이는 비멘틴 수치가 마우스 자궁내막 기질 세포에서 높고 마우스 자궁내막 상피 세포에서 낮기 때문입니다. 사이토케라틴 수치는 마우스 자궁내막 상피 세포에서 높고 마우스 자궁내막 기질 세포에서는 낮습니다.

mentin/cytokeratin 이중 염색은 기질 세포에 의한 mentin의 발현과 상피 세포에 의한 cytokaratin의 독점적인 발현을 추가로 보여줍니다. 고리형 아데노신 일인산염 및 MPA의 적용에 의한 기질 세포 배양에서 탈이중화의 유도는 대조군 기질 세포 배양에 비해 처리 5일 후 프로락틴 MRNA 수치가 급격히 증가함을 보여줍니다. 상피 세포는 사이드 셀 배양 삽입물에서 시각화하기 어렵기 때문에 5일간의 탈락이중화 시뮬레이션 직후 생존 능력 분석을 수행할 수 있으며, 파란색에서 밝은 분홍색으로의 색상 변화는 생존 가능한 상피 세포의 존재를 나타냅니다.

이 기술에 따라, 배반포 접착 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 배반포가 있는 상태에서 상피 세포에 의해 분비되는 인자가 기질 세포 탈이중화를 유도할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.